體外模擬消化對核桃主成分代謝及抗氧化特性的影響

李 夏，陳杭君，夏 魏，鄭永華，金 鵬，牛 犇，房祥軍，吳偉杰，3*，郜海燕*

（1 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點實驗室浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室 中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點實驗室 杭州 310002 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 南京 210095 3 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室 杭州 310021）

核桃（Juglans regia L.）和扁桃、腰果、榛子三者合稱為“四大干果”[1]。核桃富含人體所需的脂肪酸、蛋白質(zhì)、多酚類、糖類、黃酮類及多種微量元素與膳食纖維等[2-3]。核桃中油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52%～70%，且油脂以不飽和脂肪酸為主，約占82%～85%，蛋白占比24%左右，富含多種必需氨基酸[4]。核桃是人體優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)物質(zhì)來源，具有健腦益智，延緩細(xì)胞衰老以及增強(qiáng)免疫力的功效，并對心血管疾病也有一定的輔助功效[5-6]。目前對核桃營養(yǎng)價值的開發(fā)和功能活性的研究還不夠深入，對核桃的消化代謝及活性研究較少，導(dǎo)致其產(chǎn)品創(chuàng)新研發(fā)受阻[7]。在核桃產(chǎn)品的生產(chǎn)加工中，還存在未能充分利用的營養(yǎng)成分，造成營養(yǎng)浪費的現(xiàn)象。如何全面開發(fā)利用核桃的營養(yǎng)價值也成為產(chǎn)業(yè)營養(yǎng)健康發(fā)展的聚焦點[8]。

體外消化系統(tǒng)是在體外條件下模擬體內(nèi)消化吸收情況，以達(dá)到還原人體胃腸道生理過程的目的[9]。它可以完全或部分替代活體試驗，具有成本較低、耗時短、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點[10]。在研究膳食消化時，最常用的是多酶系多腔室靜態(tài)模型，其主要優(yōu)勢之一是固定模擬消化食物的條件，并盡量保證消化模型的統(tǒng)一[11]。此方法可用于分析消化產(chǎn)物和評估食物基質(zhì)中微量元素的釋放，以此來評估食物消化至終點或某時間點時的情況[12]。

食物消化過程中的pH 值及各種消化酶類對食物的抗氧化特性有一定影響，營養(yǎng)成分提取物的功能活性與消化后的實際利用情況存在差異。韓海濤等[13]發(fā)現(xiàn)在相同質(zhì)量濃度下，核桃蛋白中的清蛋白對DPPH 自由基清除能力最高，其次為醇溶蛋白，均高于二丁基羥基甲苯（Butylated Hydroxyl Toluene）。這與其氨基酸組成、分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此能有效抗衰老和防御多種心腦血管疾病[14]。核桃多肽也具有一定抗氧化能力，并具有一定的量效關(guān)系[15]。弘子姍等[16]用酶解法提取核桃多肽，當(dāng)多肽質(zhì)量濃度0.5 g/mL 時，其DPPH 清除率87%，ABTS+清除率84%，羥基自由基清除率82%，鐵離子還原能力達(dá)45%，說明核桃多肽具有一定的抗氧化能力[17]。

由于核桃油中含有較多的多不飽和脂肪酸，因此易發(fā)生氧化變質(zhì)[18]，使核桃油產(chǎn)品貨架期縮短。核桃油的抗氧化能力還可用來評價油脂的品質(zhì)特性[19]。彭星星等[20]研究表明，核桃油含有多種生物活性物質(zhì)，如黃酮、生育酚、甾醇等，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，然而，核桃油中的天然活性物質(zhì)會隨時間呈現(xiàn)急劇減少的變化特征，對自由基的清除能力逐漸降低，抗氧化能力也降低。

本文以“新新2”核桃為研究對象，提取油脂和蛋白質(zhì)兩類主成分進(jìn)行相關(guān)研究。采用GC-MS和HPLC-MS/MS 分析核桃消化過程中油脂和蛋白質(zhì)含量的變化，體外消化特性及消化產(chǎn)物的抗氧化活性，旨在為研發(fā)核桃油內(nèi)源性天然抗氧化劑，核桃產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃品種為 “新新2” 核桃（Juglans regia‘Xinxin 2’）（原產(chǎn)地新疆），購于洽洽食品股份有限公司。胰脂肪酶、胰酶、胰蛋白酶、豬膽鹽，阿拉丁生化科技有限公司；三氯乙酸、過硫酸鉀、鐵氯化鉀、三氯化鐵、硫酸銅、酒石酸鉀，分析純，阿拉丁生化科技有限公司；福林酚，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；游離脂肪酸含量試劑盒，科銘生物技術(shù)有限公司；氨基酸含量測定試劑盒，侖昌碩生物有限公司；DPPH 自由基清除試劑盒，南京建成科技有限公司；甲醇、正己烷、異丙醇，色譜純，CNW Technologies GmbH；乙腈，色譜純，德國默克集團(tuán)；D35-氘代硬脂酸，純度為98%，德國默克集團(tuán)；三甲基硅烷基重氮甲烷，在正己烷中含量為2moL/L，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

LR56495 臺式離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；THZ-C-1 恒溫冷凍振蕩器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；DK-8D 電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LC20AD-API 3200MD TRAP HPLC-MS/MS，日本島津公司；7890B 氣相色譜，安捷倫科技有限公司；ReadMax1900 酶標(biāo)儀，上海閃普生物科技；UV-9000 紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 核桃油脂和蛋白的提取 參考閆圣坤等[21]的方法，采用冷榨法提取核桃油脂，設(shè)置溫度170℃榨取核桃油。參考劉猛等[22]的方法，采用酸沉堿提法分離純化核桃蛋白質(zhì)，將核桃粕與蒸餾水按質(zhì)量比1∶25 混合，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值為9，堿提；用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為5，酸沉。

1.3.2 模擬體外消化試驗方法 試驗分組：設(shè)置蛋白質(zhì)組即Pr 組（樣品只含核桃蛋白）、7∶3 組（樣品中核桃蛋白質(zhì)與油脂質(zhì)量比7∶3）、1∶1 組（樣品中核桃蛋白質(zhì)與油脂質(zhì)量比1∶1）、3∶7 組（樣品中核桃蛋白質(zhì)與油脂質(zhì)量比3∶7）、油脂組即Oil 組（樣品只含有核桃油）。

模擬胃消化階段：稱取3.10 g 氯化鈉、1.10 g氯化鉀、0.30 g 二水氯化鈣、0.60 g 碳酸氫鈉溶解在1 L 蒸餾水中，配成胃電解質(zhì)溶液。配制1 mol/L乙酸鈉溶液并調(diào)節(jié)pH=5。所有溶液預(yù)熱至37 ℃。取17 樣品、255 mL 胃電解質(zhì)、59.50 mg 胃蛋白酶、0.51 mL 乙酸鈉溶液于錐形瓶中，用1 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2～3，37 ℃，80 r/min 搖床溫育2 h。分別于20，40，120，140，160，180 min 和240 min處取樣，90 ℃水浴滅酶30 min，10 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液，冷凍干燥，待測。

模擬腸消化階段：稱取5.40 g 氯化鈉、0.65 g氯化鉀、0.33 g 二水氯化鈣溶解在1 L 蒸餾水中，配成腸電解質(zhì)溶液，7%胰酶-PBS 溶液，4%膽鹽-PBS 溶液。量取50 mL 腸電解質(zhì)、50 mL 胰酶-PBS溶液、100 mL 膽鹽-PBS 溶液、59.50 mg 胰脂肪酶、0.013 g 胰蛋白酶，加入剩余胃消化液中，用0.10 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 7，37 ℃，80 r/min 搖床溫育2 h。分別于20，40，120，140，160，180 min和240 min 取樣，90 ℃水浴滅酶30 min，10 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清，冷凍干燥[23]，待測。

1.3.3 多肽含量的測定 參考高英等[24]方法，配制堿性銅A 試劑和酒石酸鉀B 試劑，3.42 mg/mL牛血清白蛋白對照品溶液，分別取樣品溶液加水稀釋30 倍待測。

根據(jù)對照品溶液含量及吸收值，計算可得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

其中相關(guān)系數(shù)R2=0.9909。

1.3.4 游離氨基酸含量的測定 按照試劑盒說明，在570 nm 處測定吸光度A：

由此計算可得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

式中：x——標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；y——ΔA。

游離氨基酸含量計算公式：

式中，D——稀釋倍數(shù)，未稀釋為1。

1.3.5 游離氨基酸種類的測定 樣品預(yù)處理：稱取0.1 g 樣品加入2 mL 鹽酸，充氮氣保護(hù)，密封110 ℃消化24 h。取100 μL 消化液，濃縮至20 μL，加980 μL 超純水。

衍生化過程：取混標(biāo)、待測樣本50 μL，加50 μL 蛋白沉淀劑，混勻后13 200 r/min 冷凍離心4 min。取8 μL 上清液，加42 μL 標(biāo)記緩沖液混勻瞬離。再加20 μL 衍生液混勻、瞬離后置55 ℃恒溫衍生15 min。衍生后樣本置冰箱，冷卻后混勻瞬離，取50 μL 于HPLC-MS/MS 檢測。

液相條件：色譜柱：MSLab45+AA-C18（150 mm×4.60 mm，5 μm）；柱溫：50 ℃，流速：1 mL/min；流動相：A 為有機(jī)相：乙腈（A+B 調(diào)節(jié)劑）；B 為水相：超純水（A+B 調(diào)節(jié)劑）；進(jìn)樣量：3 μL。梯度見表1 所示。

表1 液相梯度洗脫設(shè)置Table 1 Liquid phase gradient meter

質(zhì)譜條件：離子源：+ESI 電噴霧離子源；IS：+5500 V（噴霧電壓）；GS1：0.38 MPa（霧化氣）；GS2：0.41 MPa（輔助氣）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測；CAD：Medium（碰撞氣）；TEM：500 ℃（霧化溫度）；CUR：0.14 MPa（氣簾氣）；CXP：2.0 eV（碰撞室射出電壓）；EP：10 eV（射入電壓）。

1.3.6 游離脂肪酸含量的測定 按照試劑盒說明書測定吸光值，記為A。經(jīng)計算得標(biāo)準(zhǔn)曲線：

由此可得游離脂肪酸含量計算公式：

式中，V1——加入樣本體積，1 mL；V2——提取液體積，1.2 mL；A——吸光度；M——樣品質(zhì)量，g。

1.3.7 游離脂肪酸種類的測定 樣本預(yù)處理：取1 mL 樣品加入500 μL 提取液（異丙醇∶正己烷體積比2 ∶3，含內(nèi)標(biāo)0.20 mg/L），加入鋼珠渦旋混勻30 s，用研磨儀處理4 min（40 Hz），超聲5 min（冰水?。?，重復(fù)3 次。然后，將樣本于4 ℃12 000 r/min 離心15 min，取上清。剩余樣本中加入500 μL上述提取液，重復(fù)渦旋、研磨冰浴和離心步驟。取上清，混合渦旋10 s。將上述兩種提取液的上清液混合，取800 μL 于2 mL 試管中，氮氣吹干。加入500 μL 甲醇-三甲基硅烷基重氮甲烷溶液（二者體積比1∶2），室溫靜置30 min 后氮氣吹干。加入160 μL 正己烷復(fù)溶，12 000 r/min 離心1 min，取上清進(jìn)行GC-MS 檢測。

參數(shù)設(shè)置：進(jìn)樣量：1 μL；分流模式：Split Mode（5∶1）；隔墊吹掃流速：3 mL/min；載氣：氦氣；色譜柱：DB-FastFAME（90 m×250 μm×0.25 μm）；柱壓：0.32 MPa；柱箱升溫程序：1 min 升至50 ℃，15 min 升至200 ℃（50 ℃/min），1 min 升至210 ℃（2 ℃/min），15 min 升至230°C（10 ℃/min）；前進(jìn)樣口溫度：240 ℃；傳輸線溫度：240 ℃；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；電離電壓：-70 eV；質(zhì)量范圍m/z：33～400；掃描模式：Scan/SIM；溶劑延遲：7 min。

定量結(jié)果：計算公式：

式中，C（con）——樣本中游離脂肪酸的含量，μg/g；CS——復(fù)溶液游離脂肪酸的質(zhì)量濃度，ng/mL；V1——復(fù)溶體積，mL；V2——加入提取液的體積，μL；V3——取出提取液的體積，μL；M——稱重質(zhì)量，mg。

1.3.8 DPPH 自由基清除能力的測定 取消化終產(chǎn)物，設(shè)置10，20，30，40，50 mg/mL 5 個質(zhì)量濃度梯度，按照試劑盒說明操作。

式中，A測定——測定管的吸光度；A對照——對照管的吸光度；A空白——空白管的吸光度。

1.3.9 清除ABTS+能力的測定 取消化終產(chǎn)物，設(shè)置10，20，30，40，50 mg/mL 5 個質(zhì)量濃度梯度，參考邵洋洋等[25]方法，在波長734 nm 處測定吸光度。計算公式：

式中，A0——蒸餾水+ABTS 工作液的吸光度；A1——樣品+ABTS 工作液的吸光度。

1.3.10 三價鐵離子還原能力的測定 取消化終產(chǎn)物，設(shè)置10，20，30，40，50 mg/mL 5 個質(zhì)量濃度梯度，參考曲文娟等[26]方法，在700 nm 處測定反應(yīng)液的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2021 進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總處理，采用GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行方差分析并繪制統(tǒng)計圖。試驗均設(shè)置3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用不同符號或字母表示具有顯著差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外消化過程中核桃游離脂肪酸含量的變化

脂肪的消化主要集中在小腸的上部，它被各種酶和膽汁酸鹽水解成甘油和脂肪酸[27]。核桃油在體外消化過程中游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA）的變化如圖1 所示。隨著消化的進(jìn)行，F(xiàn)FA含量呈持續(xù)上升趨勢，從13.61 nmol/g 增到20.94 nmol/g。120～180 min 為腸消化階段，腸道中有胰脂肪酶，主要負(fù)責(zé)脂質(zhì)的消化，游離脂肪酸在此期間增加明顯，與脂肪相比，游離脂肪酸更易被人體吸收利用，是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，有助于促進(jìn)人體生長發(fā)育。核桃油主要在腸消化階段被分解為游離脂肪酸并被人體吸收代謝。因僅測定游離脂肪酸的總含量無法明確核桃油消化產(chǎn)物的具體變化情況，故對5 個時間點的消化產(chǎn)物組分進(jìn)行GC-MS 檢測。

2.2 體外消化過程中核桃游離脂肪酸組分分析

采用GC-MS 定量檢出49 種游離脂肪酸，在體外消化試驗所取樣品中共檢出22 種游離脂肪酸有含量變化，具體種類及含量見表2 所示。亞油酸含量在消化過程中始終維持最高，在180～240 min 期間含量顯著增加（P＜0.05），亞油酸是ω-6型脂肪酸，有助于預(yù)防心腦血管疾病和降血脂等；游離脂肪酸總量呈上升趨勢，從1 080 μg/g 增到413 199.89 μg/g，與上述指標(biāo)檢測結(jié)果保持一致，且在120～180 min 期間，游離脂肪酸總量顯著提高（P＜0.05），從27 451.01 μg/g 增至283 616.18 μg/g。其中有8 種脂肪酸是0 min 時未檢出，而后續(xù)消化分解產(chǎn)生的。順式-11-二十碳烯酸和反式-10-十九碳烯酸的變化最顯著（P＜0.05），此類脂肪酸在人體中可起到滋潤皮膚、潤腸通便等作用。游離脂肪酸增量在0～120 min 時相對平緩，在120～240 min 時增長趨勢明顯。對不同時間點消化產(chǎn)物的FFA 組分進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，如圖2 所示，消化180 min 時的產(chǎn)物組分與消化240 min 時的產(chǎn)物組分相近，與前3 個時間段差異較大。0 min 即未消化和消化60 min 時與后續(xù)產(chǎn)物組分存在差異，其中消化120 min 時的產(chǎn)物組分與其它4 個時間點差異明顯。綜上結(jié)果，初步判斷油脂的主要消化部位在腸道，是因為在腸消化階段游離脂肪酸含量明顯增加，與姚軼俊[28]的研究結(jié)果相近，腸道的胰脂肪酶是消化脂肪的主要酶類，大部分油脂在腸消化階段才被分解為游離脂肪酸。

圖2 消化產(chǎn)物中FFA 聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of FFA in digestive products

表2 不同消化時間點22 種游離脂肪酸（FFA）含量特征Table 2 Content characteristics of 22 kinds of free fatty acids（FFA）at different digestion time points

2.3 體外消化過程中核桃多肽及游離氨基酸含量的變化

人體內(nèi)的消化酶主要由胃蛋白酶和胰蛋白酶構(gòu)成，它們與胃酸共同作用即可水解蛋白質(zhì)[29]。在體外消化模擬過程中，多肽含量呈現(xiàn)先增后減趨勢，如圖3a 所示。在消化120 min 時達(dá)到最大值0.37 mg/mL，整體變化較平緩，從消化初始到消化終點，多肽含量從0.34 mg/mL 增到0.36 mg/mL。如圖3b 所示，核桃蛋白質(zhì)隨著消化的進(jìn)行，逐漸分解為氨基酸，使游離氨基酸（Free Amino Acid，AA）總量從0 min 時的0.59 μmol/mL 升至240 min 時的17.75 μmol/mL，在120 min 后進(jìn)入腸消化階段，氨基酸增量明顯升高。推測0～120 min 為胃消化階段，蛋白被分解為多肽，導(dǎo)致多肽含量增加；120～240 min 為腸消化階段，部分多肽逐漸被分解為氨基酸，整體多肽含量減少，而游離氨基酸總量明顯增加，說明蛋白質(zhì)經(jīng)胃和腸道的消化分解依次產(chǎn)生多肽和蛋白質(zhì)兩級產(chǎn)物，短肽和游離氨基酸更有利于人體吸收利用，且功能活性優(yōu)于直接吸收蛋白質(zhì)。

圖3 核桃蛋白質(zhì)在體外消化過程中多肽及游離氨基酸含量的變化Fig.3 The changes of polypeptide and free amino acid contents in walnut protein during digestion in vitro

2.4 體外消化過程中核桃多肽及游離氨基酸組分分析

采用HPLC-MS/MS 分析具有代表性的20 種游離氨基酸含量。0 min 時樣品即核桃蛋白，隨消化進(jìn)行，不同時間點游離氨基酸含量的變化情況見表3 所示?？梢钥闯?，0 min 時核桃蛋白中含量最高的是色氨酸0.71 μg/g，當(dāng)消化240 min 時，含量最高的是精氨酸25.50 μg/g。消化過程中精氨酸和賴氨酸的含量增加明顯，精氨酸有助于軟化血管，具有抗動脈粥樣硬化的作用，賴氨酸有助于提高人體免疫力，促進(jìn)生長發(fā)育。半胱氨酸與冠心病等心腦血管疾病有關(guān)[30]，而研究發(fā)現(xiàn)核桃蛋白質(zhì)中不含有半胱氨酸，且隨消化進(jìn)行不會產(chǎn)生半胱氨酸，因此核桃蛋白質(zhì)可作為維持人體健康的優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)源；游離氨基酸總量從3.50 μg/g 增至61.85 μg/g，在120～180 min 有明顯上升，從20.79 μg/g 增至47.46 μg/g，與上述指標(biāo)檢測結(jié)果保持一致。對不同時間點消化產(chǎn)物的AA 組分進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，如圖4 和圖5 所示，消化60 min 時的產(chǎn)物組分與消化0 min 即未消化時的產(chǎn)物組分相近，消化180 min 時的產(chǎn)物組分與消化240 min 時的產(chǎn)物組分相近，而消化前60 min 與消化120 min后產(chǎn)物組分有明顯差異。蛋白質(zhì)的消化產(chǎn)物主要以氨基酸和肽段的形式被生物體吸收[31]。小腸中所含有的消化酶種類成分復(fù)雜，能進(jìn)一步水解胃消化產(chǎn)生的氨基酸和肽[31]。綜上結(jié)果，初步判斷蛋白質(zhì)的主要消化部位在腸道。

圖4 消化產(chǎn)物中AA 聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis of AA in digestive products

圖5 消化產(chǎn)物中AA 聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of AA in digestive products

表3 不同消化時間點20 種游離氨基酸（AA）具體含量Table 3 Specific contents of 20 kinds of free amino acids（AA）at different digestion time points

2.5 核桃主成分消化產(chǎn)物抗氧化能力

隨著消化產(chǎn)物濃度的增加，5 個試驗組都保持上升趨勢。如圖6 所示，Pr 組的整體DPPH 清除能力較高，在消化終產(chǎn)物濃度為50 mg/mL 時有最高清除率為80.65%；Oil 組相對清除能力最弱，在消化終產(chǎn)物濃度為50 mg/mL 時其最高清除率僅40.61%；不同比例復(fù)配組中7∶3 比例組清除效果較好，最高清除率為75.88%，3∶7 比例組清除效果較差，最高清除率僅53.70%。初步推斷核桃蛋白質(zhì)的DPPH 清除能力比油的DPPH 清除能力好。如圖7 所示，除Oil 組，其它4 組在消化終產(chǎn)物濃度為50 mg/mL 時的清除率趨于一致；Pr 組的整體ABTS+清除能力較高，在50 mg/mL 時有最高清除率81.02%；Oil 組清除能力最弱，在50 mg/mL 時其最高清除率為60.14%；不同比例復(fù)配組中7∶3比例組清除效果較好，最高清除率為79.05%，1∶1比例組清除效果較差，最高清除率僅74.61%。初步推斷核桃蛋白質(zhì)的ABTS+清除能力比油的ABTS+清除能力強(qiáng)。如圖8 所示，7∶3 和3∶7 復(fù)配比例組的還原能力在消化終產(chǎn)物濃度為50 mg/mL 時趨于一致，1∶1 組和Oil 組在質(zhì)量濃度為30 mg/mL 時吸光度值很接近；Pr 組的整體鐵離子還原能力較高，在消化終產(chǎn)物質(zhì)量濃度為50 mg/mL時測定其在700 nm 處的吸光度，最高值為1.55；Oil 組清除能力最弱，在消化終產(chǎn)物質(zhì)量濃度為50 mg/mL 時其吸光度值為0.88；不同比例復(fù)配組中7 ∶3 比例組清除效果較好，最高吸光度值為1.46，1∶1 比例組清除效果較差，最高吸光度值僅1.20。初步推斷核桃蛋白質(zhì)的鐵離子還原能力比油的鐵離子還原能力強(qiáng)。

圖6 核桃蛋白質(zhì)和油脂在體外消化過程中DPPH 清除率的變化Fig.6 Changes of DPPH clearance of walnut protein and oil during digestion in vitro

圖7 核桃蛋白質(zhì)和油脂在體外消化過程中ABTS+清除率的變化Fig.7 Changes of ABTS+ clearance of walnut protein and oil during digestion in vitro

圖8 核桃蛋白質(zhì)和油脂在體外消化過程中鐵離子還原力的變化Fig.8 Changes of iron reducing power of walnut protein and oil during digestion in vitro

核桃蛋白包括醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白、谷蛋白-1 和谷蛋白-2，這5 種蛋白質(zhì)均具有一定的抗氧化性[15]。核桃蛋白具有較高的抗氧化活性與小分子多肽含量有關(guān)[33]，同時與其氨基酸組成、分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)有關(guān)[15]。核桃油的抗氧化能力主要與酚類物質(zhì)相關(guān)，酚類物質(zhì)通過獲得羥基自由基、過氧自由基和烷氧自由基，起到抗氧化作用[1]。結(jié)合上述HPLC-MS/MS 和GC-MS 分析結(jié)果可知，由于核桃蛋白質(zhì)在消化階段會產(chǎn)生多肽和氨基酸兩種次級代謝物，均具有良好的抗氧化性，推斷其抗氧化性與多肽含量和氨基酸組成有關(guān)，多肽分子質(zhì)量越小，氨基酸含量越高，抗氧化性越強(qiáng)。核桃油經(jīng)消化分解主要產(chǎn)生代謝產(chǎn)物為脂肪酸，推斷其抗氧化性與脂肪酸含量相關(guān)[19]。隨著消化的進(jìn)行，產(chǎn)生的短鏈脂肪酸含量越高，酚類物質(zhì)相對含量越少，越容易被氧化，因此其抗氧化性弱于蛋白質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)核桃粉中含油量越高，其貨架期越短[34]，復(fù)合核桃油的抗氧化能力也明顯優(yōu)于純核桃油[35]。添加外源性抗氧化劑，與提高核桃油抗氧化性之間起到協(xié)調(diào)增效作用，而核桃油本身也含一定的抗氧化活性物質(zhì)，有助于結(jié)合內(nèi)源的抗氧化成分，優(yōu)化核桃油抗氧化劑的配方，以此達(dá)到有效延長易氧化核桃產(chǎn)品貨架期的目的[36]?？梢钥紤]通過添加核桃內(nèi)源性氨基酸，如精氨酸和賴氨酸等，在不降低核桃產(chǎn)品營養(yǎng)價值的前提下，延長其貨架期。

3 結(jié)論

利用體外模擬消化試驗明確核桃主要成分蛋白和油脂的代謝變化特征，并對兩種物質(zhì)的抗氧化性進(jìn)行探究。結(jié)果表明：0～120 min 為胃消化階段，產(chǎn)物中多肽含量、游離氨基酸含量和游離脂肪酸含量顯著增加（P＜0.05），多肽從0.34 mg/mL 增到0.37 mg/mL，游離氨基酸從3.50 μg/g 增到20.79 μg/g，游離脂肪酸從1 080 μg/g 增 到27 451.01 μg/g；120～180 min 為腸消化階段，多肽含量逐漸降低，游離氨基酸和游離脂肪酸含量顯著提高（P＜0.05），多肽從0.37 mg/mL 降到0.36 mg/mL，游離氨基酸從20.79 μg/g 增到61.85 μg/g，游離脂肪酸從27 451.01 μg/g 增到413 199.89 μg/g。通過體外消化終產(chǎn)物抗氧化能力分析，發(fā)現(xiàn)核桃蛋白質(zhì)的抗氧化能力比油脂的抗氧化能力強(qiáng)，在同時存在蛋白質(zhì)和油脂的情況下，沒有表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用。以上結(jié)論表明核桃油和蛋白質(zhì)的主要消化部位在腸道，核桃蛋白的抗氧化性高于核桃油，二者混合不利于抗氧化性的提高，在等比混合時甚至導(dǎo)致抗氧化性更差。本研究結(jié)果為核桃油內(nèi)源性天然抗氧化劑的研發(fā)，以及開發(fā)高抗氧化性核桃功能產(chǎn)品提供研究思路。