外源信號分子AI-2 對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3產胞外多糖的影響

王 艷，顧 悅，鄭硯學，張 悅，賀銀鳳

（內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院 呼和浩特 010018）

群體感應（quorum sensing，QS）是細菌通過感知周圍環(huán)境中菌群濃度的變化，釋放信號分子，進而啟動相關基因表達來實現調控菌體行為的一種生理活動[1]。目前發(fā)現QS 系統(tǒng)可以調控細菌多種生理行為，如毒力因子的表達、生物膜的形成、胞外多糖的產生、生物發(fā)光、細菌自溶以及細菌素的生物合成和對各種環(huán)境壓力的抗性等[2-6]。乳酸菌是一類兼性厭氧，能夠將碳水化合物發(fā)酵產生乳酸的革蘭氏陽性菌，其群體感應類型包括自身誘導和雙組分信號系統(tǒng)[7]。乳酸菌的信息交流分為種間交流信號分子AI-2 和種內調節(jié)信號分子AIP，其中，信號分子AI-2 是呋喃酮酰硼酸二酯，LuxS/AI-2 群體感應系統(tǒng)在多種細菌信息交流中都起著重要的作用[8-9]。

前期研究表明LuxS/AI-2 群體感應系統(tǒng)可調控乳酸菌形成生物膜，且對生物膜的形成能力具有一定的影響[10-11]。乳酸菌的生物膜主要是菌體外的大量胞外聚合物與細菌粘連形成的菌落聚集體[12]。胞外聚合物主要指細菌分泌的各種生物大分子物質，如胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）和蛋白質、核酸等。EPS 是指細菌在生長發(fā)育過程中通過自身代謝，將環(huán)境中含碳化合物通過一系列的反應合成并分泌到細胞外的高分子、長鏈糖類聚合物。EPS 在生物膜中的比例占總有機物的50%～90%[13]。EPS 在微生物抵抗不良環(huán)境時發(fā)揮作用，助其存活[14]，具有改善腸道微生物的菌群結構，促進腸道健康，調節(jié)免疫功能，抗腫瘤及抗氧化等益生功能[15]。

目前研究主要集中在QS 系統(tǒng)對乳酸菌生物膜的形成，在研究QS 系統(tǒng)與生物膜的調控機制過程中發(fā)現QS 系統(tǒng)與細菌分泌EPS 在一定程度上存在某種聯(lián)系。吳榮[16]通過研究發(fā)現添加終濃度為60 μmol/L 的外源信號分子AI-2 時，植物乳桿菌5-4-1 各生長階段EPS 生成量均顯著提高。Smritikana 等[6]研究發(fā)現，霍亂弧菌MO10 合成EPS 過程涉及群體感應系統(tǒng)，該菌的群體感應自誘導劑缺失會引起EPS 過度表達。楊維等[17]研究發(fā)現在不同濃度溴化呋喃酮作用下，單增李斯特菌EPS 含量均低于空白組，且隨著濃度的增加，EPS 含量逐漸減小。以上結果表明QS 系統(tǒng)對細菌EPS 合成有一定的影響，然而是否存在調控關系還需驗證。

本研究首先通過測定發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）TG4-1-1 和乳酸片球菌（P.acidilactici）11-3不同培養(yǎng)時間EPS 分泌量和AI-2 活性，得出菌株分泌EPS 和AI-2 活性的變化規(guī)律；其次，采用添加外源AI-2 的方法，以兩株菌在外源AI-2 作用下生長量、菌體形態(tài)、EPS 分泌量以及微觀表面結構的變化為指標，研究信號分子AI-2 是否可以調控乳酸菌分泌EPS。最后，明確信號分子AI-2和乳酸菌產EPS 之間是否存在相關性，為LuxS/AI-2 群體感應系統(tǒng)調控EPS 的研究提供一定的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）TG4-1-1、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）11-3 均由內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院食品生物技術團隊提供。

1.2 試劑與材料

氯化鈉、七水合硫酸鎂、三氯乙酸，國藥化學集團；透析袋（MD34，截留分子質量為8 000～14 000 d），北京索萊寶科技有限公司；L-精氨酸、酸水解酪蛋白，Coolaber 公司；MRS 肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

HF-SAFE 1500 型生物安全柜、SMART-N 純水機，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；SX-500全自動高壓滅菌鍋，日本TOMY 公司；PB 10 型酸度計，德國Satorius 公司；5810 型高速低溫離心機，德國Eeppendorf 公司；Neofuge 18R 高速冷凍離心機，上海力申科學儀器有限公司；Free Zone真空冷凍干燥機，美國Laconco 公司；紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。BioTek Epoch 全波長酶標儀，美國BioTek 公司；Perkin Elmer victor X 酶標儀，美國Perkin Elmer 公司；TM4000 形桌上顯微鏡，日本株式會社日立高新技術那珂事業(yè)所。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株不同生長階段EPS 產量的測定 將發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 以2%（體積分數）接種比接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，在37℃下活化培養(yǎng)二代，將二代菌液制備成供試菌液[18]。將供試菌液以2%（體積分數）接種比接種于新鮮的MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)0，4，7，10，13，16，19，22，25 h 后測定不同時間點菌株的生長量、EPS 產量、AI-2 活性。

1.4.1.1 EPS 的粗提取 EPS 的粗提取參照紀亞楠[19]的試驗方法。

1.4.1.2 EPS 的測定 采用苯酚-硫酸法測定乳酸菌EPS 含量，取稀釋后的透析樣品200 μL，依次加入6%苯酚溶液200 μL，濃硫酸1 mL，搖勻，室溫放置30 min 使用酶標儀測OD490nm值。將不同培養(yǎng)時間粗多糖的OD490nm代入標準曲線中即可算出EPS 的含量。

葡萄糖標準曲線繪制：以無水葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法繪制標準曲線[20]。配制100 μg/mL 的葡萄糖標準液，按表1 加入各種試劑，混勻，靜置30 min，以1 號管為空白對照，在490 nm處測定吸光度，繪制葡萄糖標準曲線。

表1 苯酚-硫酸法標準曲線繪制Table 1 Standard curve drawing by phenol-sulfuric acid method

以糖含量（mg/L）為橫坐標，吸光度（A490nm）為縱坐標繪制標準曲線，建立回歸方程，回歸線性方程為Y=0.0112X-0.0064，R2=0.999。R2＞0.99，表示具有可行度和線性關系，R2值越接近1，吻合程度越高。

1.4.2 菌株不同生長階段AI-2 活性測定

1.4.2.1 無細胞發(fā)酵上清液的制備（cell-free fermentation supernatant，CFS）將試驗菌株以1.4.1節(jié)的方法進行培養(yǎng)，待測培養(yǎng)液8 000 r/min 離心5 min（4 ℃），使用0.22 μm 水系濾膜對上清液過濾除菌，即得到試驗菌株的CFS。將哈維氏弧菌BB170 以2%（V/V）接種于AB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 代至OD600nm為0.9～1.1，4 ℃ 4 000 r/min 離 心10 min，使用0.22 μm 水系濾膜對上清液過濾除菌，即得到陽性對照。AB 培養(yǎng)基過濾除菌即得到陰性對照，MRS 培養(yǎng)基過濾除菌即得乳酸菌介質對照。所取上清液與對照樣品于-80 ℃保存。

1.4.2.2 信號分子AI-2 活性的測定 將哈維氏弧菌BB170 接種到AB 培養(yǎng)基中，30 ℃100 r/min振蕩培養(yǎng)活化二代，以2%接種比培養(yǎng)3 代至OD600nm為0.9～1.1，按1 ∶5 000（V/V）將菌液和AB培養(yǎng)基混合，得到稀釋后約為105 CFU/mL 的哈維氏弧菌BB170 菌液。陽性對照為哈維氏弧菌BB170 的CFS，陰性對照為無菌的AB 培養(yǎng)基，介質對照為無菌MRS 培養(yǎng)基。將待測樣品、陽性、陰性、介質對照與稀釋后的哈維氏弧菌BB170 菌液以1 ∶100（V/V）進行混合，30 ℃100 r/min 振蕩培養(yǎng)。在0～6 h 內，每隔30 min 取200 μL 混合液在化學發(fā)光模式測定其熒光強度值。在陰性對照熒光強度值達到最低點時對各個樣品的熒光強度進行測定，計算其相對熒光強度用以代表信號分子AI-2 的活性。計算公式如下：

待測樣品相對熒光強度=待測樣品的熒光強度值/介質對照的熒光強度值[21]

1.4.3 外源信號分子AI-2 最佳添加濃度的確定 根據顧悅[22]的試驗方法，完成了信號分子AI-2的體外合成。反應體系為：1 mmol/L 的SAH 與1 mg/mL 的LuxS 和Pfs 蛋白在10 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 7.5）中，37 ℃水浴反應1 h。使用10 ku超濾管以除去未反應的蛋白，使用0.22 μm 水系濾膜過濾除菌，保藏于-80°C。利用埃爾曼試劑測定AI-2 濃度可達1.362 mmol/L，同時采用哈維氏弧菌BB170 生物發(fā)光法測得合成AI-2 的相對熒光強度可達139.350±0.384。

將外源信號分子AI-2 添加到MRS 培養(yǎng)基中至終濃度分別為50，100，150 μmol/L，將活化培養(yǎng)至二代的發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 按2%（V/V）接種比接入含有不同濃度外源AI-2 的MRS 培養(yǎng)基中作為試驗組，將菌按2%（V/V）接入含有等體積pH 7.5 磷酸鈉緩沖液的MRS 培養(yǎng)基中作為對照組，測定AI-2 活性最高點時處理組生長量和AI-2 活性變化，測定EPS 產量最高點時生長量和EPS 產量變化，篩選出最佳外源AI-2 添加濃度便于后續(xù)試驗。

1.4.4 外源信號分子AI-2 對菌株的影響 將1.4.3 節(jié)中篩選得到的最佳濃度作為試驗濃度，同時以未添加外源AI-2（0 μmol/L）為對照，分別培養(yǎng)0，4，7，10，13，16，19，22，25 h 后，測定外源AI-2對菌株TG4-1-1 和11-3 不同培養(yǎng)時間生長量、EPS 產量的影響。同時利用掃描電鏡觀察兩株菌培養(yǎng)13 h 的菌體形態(tài)以及培養(yǎng)22 h 的多糖冷凍干燥后的表面結構。

1.5 數據處理及分析

每組試驗重復3 次，用SPSS19.0 對試驗數據進行統(tǒng)計分析，所有數值用平均值±標準差表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時間EPS 產量和AI-2 活性的變化規(guī)律

2.1.1 發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3不同培養(yǎng)時間EPS 產量的變化規(guī)律 不同培養(yǎng)時間發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 EPS產量和生長量的變化規(guī)律如圖1 所示。由圖1a 可知，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 的延滯期較短，培養(yǎng)4 h以后進入對數生長期；13 h 以后開始進入穩(wěn)定期，且穩(wěn)定期持續(xù)時間較長；培養(yǎng)16 h 時生長量達到最大（OD595nm=2.153±0.019），22 h 以后生長量逐漸降低進入衰亡期。發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 不同時間點粗多糖產量差異較大，隨著培養(yǎng)時間延長，菌株粗多糖的產量呈逐漸上升的趨勢。0～4 h 為發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 EPS 合成的起始階段，4～13 h 內是EPS 快速合成階段，13～22 h 進入EPS 合成的穩(wěn)定期，培養(yǎng)22 h 后EPS 產量最高達到（195.863±1.643）mg/L，之后在25 h 時EPS 產量略有下降。由圖1b 可知菌株11-3 與菌株TG4-1-1 隨不同培養(yǎng)時間的生長量和EPS 產量的變化規(guī)律具有相似性，其在培養(yǎng)16 h 時OD595nm為2.061±0.022 達到最大，培養(yǎng)22 h 后EPS 產量為（125.179±1.458）mg/L 達到最大。說明菌株TG4-1-1 和11-3 從延滯期開始一直到穩(wěn)定期前期的生長量和EPS 產量都隨著時間的延長呈現大幅上升的趨勢，是因為菌株在這段時期內生長旺盛導致其代謝產物也增多；當菌株的生長量穩(wěn)定時，EPS 產量在小幅增加；當菌株進入衰亡期時，EPS 產量也隨之減少，推測可能是由于培養(yǎng)后期培養(yǎng)基營養(yǎng)物質不充分，菌體會分解一定量自身所產EPS，也可能是菌體發(fā)酵過程中產生的酶如糖苷水解酶將EPS 降解，導致后期出現EPS 產量減少現象[23]。

圖1 菌株不同培養(yǎng)時間的生長量和EPS 產量的關系Fig.1 Growth and EPS yield of strains at different culture time

2.1.2 發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3不同培養(yǎng)時間AI-2 活性的變化規(guī)律 利用哈維氏弧菌BB170 生物發(fā)光法對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 培養(yǎng)不同時間下產AI-2 活性進行檢測。結果如圖2a，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1隨著培養(yǎng)時間的延長AI-2 活性逐漸增強，達到最強后又減弱。在0～10 h 內隨著時間的延長發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 的生長量（OD595nm）逐漸增大、AI-2活性逐漸增強；菌株在10 h 時AI-2 活性達到最大；之后菌株的生長量還在逐漸上升直至穩(wěn)定后又略有下降，在此期間菌株AI-2 活性則一直呈現下降趨勢。從圖2b 可知乳酸片球菌11-3 所產AI-2 活性隨著培養(yǎng)時間的延長在10 h 時達到最強，之后AI-2 活性減弱。發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 均在10 h 時所產AI-2 活性最強，這與其它研究證實細菌信號分子AI-2 產生的最強時期一般發(fā)生在對數末期和穩(wěn)定初期[24-25]的結果一致；后期AI-2 活性減弱可能與AI-2 不穩(wěn)定易分解的性質有關[26]，也可能是因為AI-2 附著在菌體細胞膜上導致其環(huán)境中減少[27]。

圖2 菌株不同培養(yǎng)時間的生長量和AI-2 活性的關系Fig.2 Growth and AI-2 activity of strains at different culture time

2.1.3 發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3不同培養(yǎng)時間EPS 和AI-2 的關系 從圖1 和圖2 可以看出，在0～10 h 試驗菌株的EPS 產量、AI-2 活性隨時間的延長而呈現上升的趨勢。10 h 之后試驗菌株的AI-2 活性開始逐漸下降，可能是被菌株內化吸收后參與調控某些生理活動[28]，如EPS的產生，與此同時EPS 產量仍在不斷積累，因此可證明這一猜測合理。

2.2 最佳外源信號分子AI-2 添加量的確定

根據前期試驗得出發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 均在培養(yǎng)10 h 時AI-2 活性最強以及22 h 時EPS 產量最高。為篩選出發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 最佳的外源信號分子AI-2 添加濃度，選取試驗菌株10 和22 h 測定菌株生長量、信號分子AI-2 活性和EPS 產量。

2.2.1 不同濃度外源信號分子AI-2 對菌株生長量的影響 加入不同濃度外源信號分子AI-2 對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 分別培養(yǎng)10 h 和22 h 的生長量的影響如圖3 所示。從圖3 中可以看出添加外源信號分子AI-2 對菌株TG4-1-1 和11-3 的生長量有一定的影響。添加終濃度為0，50 μmol/L 和100 μmol/L 時，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌 11-3 在10，22 h 的OD595nm之間均無差異，表明0～100 μmol/L 外源信號分子AI-2 對該菌株的生長量均無顯著影響（P＞0.05）；而添加濃度為150 μmol/L 時，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 在10，22 h 的OD595nm則顯著降低（P＜0.05），表明兩株菌的生長量受到明顯抑制。隨著外源信號分子AI-2 的濃度增加，其對菌株TG4-1-1 和11-3 10 h 和22 h生長量的影響逐漸顯著，說明信號分子的作用范圍受其濃度抑制，當超過一定范圍后其作用效果受到影響[29]。出現這樣的結果可能是因為濃度為150 μmol/L 時達到了菌體感受識別AI-2 的閾值，使得菌株的生長受到了影響造成其生長量低于未添加組。

圖3 不同濃度外源信號分子AI-2 對菌株10，22 h 生長量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of exogenous AI-2 on the growth of strains at 10 and 22 h

2.2.2 不同濃度外源信號分子AI-2 對菌株22h EPS 產量的影響 不同濃度外源信號分子AI-2對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 培養(yǎng)22 h 時EPS 產量的影響如圖4 所示。由圖可知，不同濃度添加外源信號分子AI-2 對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 EPS 產量有一定的影響。添加終濃度分別為0，50，100 μmol/L 和150 μmol/L 外源信號分子AI-2 后提取測定菌株TG4-1-1 的EPS 產量分別為（194.077±1.174），（197.119±1.380），（202.012±1.172）和（176.964±2.030）mg/L，菌株11-3 的 EPS 產量分別為（122.054±2.770），（127.262±1.034），（132.768±1.021）mg/L 和（114.167±2.011）mg/L，外源信號分子AI-2 終濃度為100 μmol/L 時，兩株菌EPS 產量均得到促進并顯著高于未添加組（P＜0.05）；當外源信號分子AI-2 終濃度為150 μmol/L 時，兩株菌EPS 產量則受到抑制，顯著低于未添加組（P＜0.05）。

當外源AI-2 終濃度在0～100 μmol/L 范圍內，隨著外源信號分子AI-2 濃度增加，EPS 產量也略有增高，由此推測信號分子AI-2 的添加可能增強了乳酸菌的EPS 合成相關的生理活動，進而提高了菌株產EPS 的能力。但外源信號分子AI-2濃度為150 μmol/L 時因其影響菌株TG4-1-1 和11-3 的生長量從而可能影響了EPS 的產量。

2.2.3 不同濃度外源信號分子AI-2 對菌株10 h AI-2 活性的影響 不同濃度外源信號分子AI-2對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 培養(yǎng)10 h 時所產AI-2 活性的影響見圖5。從圖5a 中可以看出不同濃度添加外源信號分子AI-2 對菌株TG4-1-1 AI-2 活性有一定的影響。與未添加外源AI-2（0 μmol/L）相比，當外源信號分子AI-2終濃度為50 μmol/L 和100 μmol/L 時，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 所產AI-2 活性都得到增強，且100 μmol/L 時菌株所產AI-2 活性顯著高于其它濃度（P＜0.05）；但當外源信號分子AI-2 終濃度增大到150 μmol/L 時，菌株所產AI-2 的活性被減弱，顯著低于未添加時的AI-2 活性（P＜0.05）。從圖5b中可知添加50，100 和150 μmol/L 外源信號分子AI-2 均對乳酸片球菌11-3 10 h 時AI-2 活性有增強作用，且增強作用顯著（P＜0.05）；100 μmol/L外源信號分子AI-2 對菌株11-3 AI-2 活性的增強作用最好。出現這樣的結果可能是AI-2 對菌株的各種生理調控呈現濃度依賴，當AI-2 濃度超出菌株的識別閾值范圍，導致部分AI-2 轉入了菌體細胞內，對菌株的生理活動起到了負調控。

圖5 不同濃度外源信號分子AI-2 對菌株AI-2 活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of exogenous AI-2 on AI-2 activity of strain cultured for 10 h

綜合上述結果得出外源信號分子AI-2 終濃度為100 μmol/L 對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 在10 h 的AI-2 活性以及22 h 的EPS 產量均有一定的促進作用，且促進作用顯著（P＜0.05）。因此，選擇100 μmol/L 的信號分子AI-2 為用于后續(xù)試驗。

2.3 100 μmol/L 外源信號分子AI-2 對菌株的影響

以100 μmol/L 為最終添加濃度，研究發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 不同培養(yǎng)時間下生長量、EPS 產量和AI-2 活性變化以探討信號分子AI-2 對菌株TG4-1-1 和11-3 產EPS 的調控。

2.3.1 外源信號分子AI-2 對菌株不同培養(yǎng)時間生長量的影響 外源信號分子AI-2 終濃度為100 μmol/L 對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 不同培養(yǎng)時間生長量的影響見圖6。從圖6 中可以得出，與未添加組（0 μmol/L）相比，外源信號分子AI-2 終濃度為100 μmol/L 時，菌株TG4-1-1 和11-3 各階段的生長量（OD595nm）均未受到顯著影響（P＞0.05），且進入各生長階段的時間也與未添加的保持一致，說明100 μmol/L 的外源信號分子AI-2 對菌株的生長無顯著影響。

圖6 外源信號分子AI-2 對菌株不同培養(yǎng)時間生長量的影響Fig.6 Effect of exogenous AI-2 on the growth of strains at different culture time

2.3.2 外源信號分子AI-2 對菌株不同培養(yǎng)時間EPS 產量的影響 外源信號分子AI-2 終濃度為100 μmol/L 時對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 不同培養(yǎng)時間EPS 產量的影響見圖7。由圖可知，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 在添加與不添加100 μmol/L 外源信號分子AI-2 的培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)時間后產EPS 的變化趨勢具有一致的相似性。與未添加外源AI-2（0 μmol/L）相比，100 μmol/L 外源信號分子AI-2 對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 不同培養(yǎng)時間的EPS 產量均在一定程度上起到促進作用，產量均有所提高，相較于其它階段16，19，22 h 的EPS 產量得到了顯著提高（P＜0.05）。從圖7b 可知，100 μmol/L 外源信號分子AI-2 同樣對乳酸片球菌11-3 13～22 h 各時間點EPS 產量均有顯著促進作用（P＜0.05）。以上結果表明100 μmol/L 外源信號分子AI-2 均對兩株菌產EPS 有促進作用，可能是因為外源信號分子AI-2 促進菌株參與合成EPS 的相關基因的表達，但是本試驗中并沒有對測定與EPS 合成相關基因的表達量，具體調控機制還需進一步驗證。Gu 等[30]研究發(fā)現添加外源信號分子AI-2 后，促進了乳酸菌EPS 的產生和抑制了多糖水解的相關基因lamC 和ftsH 的表達。

圖7 外源AI-2 對菌株不同培養(yǎng)時間EPS 產量的影響Fig.7 Effect of exogenous AI-2 on EPS production of strains at different culture time

2.3.3 外源信號分子AI-2 對菌體形態(tài)的影響 發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 培養(yǎng)13 h后菌體放大5 000 倍的掃描電鏡圖見圖8。由圖8a可知，未添加外源AI-2 時，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1的菌體形態(tài)比較完整，個別菌表面不平整，菌體邊緣比較圓滑，菌體之間空隙較多、分布松散；由圖8b 可知，添加終濃度為100 μmol/L 外源AI-2 時，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 的菌體形狀更加規(guī)則、形態(tài)更加豐滿、表面更加光滑，菌體之間的空隙較小使得其聚集生長，表明添加外源AI-2 有助于增加菌株產黏能力；菌體細胞體積相對變大，可能是因為菌體的胞外物質包裹導致的。由圖8c、8d 可知乳酸片球菌11-3 的菌體形態(tài)也有相類似的變化。以上結果說明。兩株試驗菌株均在添加100 μmol/L外源信號分子AI-2 時表現出明顯的聚集現象，進一步說明AI-2 可促進EPS 的產生。

圖8 外源AI-2 對菌株菌體形態(tài)的影響Fig.8 The effect of exogenous AI-2 on bacterial morphology

2.3.4 外源信號分子AI-2 對多糖形態(tài)的影響 發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 在添加外源信號分子AI-2 后培養(yǎng)22 h 時所產EPS 冷凍干燥后的多糖表面結構見圖9。從圖9a、9c 中可看出發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 所產的EPS 結構比較疏松，排列分布許多小孔表面粗糙，具有片狀和管狀相結合的穩(wěn)定和緊湊的三維網狀結構，有的具有薄片緊的表面，有的具有褶皺而緊密的表面。添加終濃度為100 μmol/L 的外源信號分子AI-2 時，對兩株菌多糖表面沒有明顯的影響。EPS 的微觀結構和表面形貌的差異很可能是由于樣品提取、制備、純化和干燥方法的不同以及EPS 的組成和結構的不同造成的[31]。

圖9 外源信號分子AI-2 對菌株多糖形態(tài)的影響Fig.9 Effect of exogenous AI-2 on polysaccharide morphology of strain EPS

3 結論

發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 均在10 h 時AI-2 活性最強，22 h 時EPS 產量均達到最高；添加50 和100 μmol/L 外源AI-2 對兩株試驗菌株的生長量無明顯影響，但EPS 產量隨AI-2 濃度的增加而增加，當濃度為150 μmol/L時，菌株的生長量和EPS 產量反而受到抑制；100 μmol/L 外源信號分子AI-2 對試驗菌株的生長量無影響，但卻可以影響菌株的表面形態(tài)并能顯著促進不同生長階段EPS 的產量。綜上所述，一定濃度的外源信號分子AI-2 對乳酸菌EPS 的產生具有調控作用，為進一步深入研究LuxS/AI-2 QS 系統(tǒng)調控EPS 的機理奠定基礎。