三種圈養(yǎng)金絲猴腸道微生物組差異分析

張媛媛 ，趙素芬 ，王運(yùn)盛，李祥翔，蔣 鵬，劉 燕，張成林 ，盧 巖

（北京動(dòng)物園管理處，圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100044）

金絲猴（snub-nosed monkey 或golden monkey）隸屬于靈長目（Primates）猴科（Cercopithecidae）疣猴亞科（Colobinae）仰鼻猴屬（Rhinopithecus），因鼻梁凹陷，鼻孔上仰，又名“仰鼻猴”［1］，現(xiàn)存5 種，我國有 3 個(gè)特有種，分別為川金絲猴（Rh.roxellana）、滇金絲猴（Rh.bieti）和黔金絲猴（Rh.brelichi），均為國家一級重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物［2］。鑒于金絲猴的生態(tài)位及對人類健康的研究價(jià)值，金絲猴的健康研究備受學(xué)者關(guān)注。金絲猴消化系統(tǒng)的特點(diǎn)表現(xiàn)在消化道較長，胃呈多室且表面積較大，盲腸與結(jié)腸發(fā)育不全，機(jī)械碾碎食物的功能較弱，前胃內(nèi)寄居大量微生物發(fā)酵食物纖維，為典型的食葉動(dòng)物［3］。圈養(yǎng)環(huán)境下不能完全復(fù)制野外食物資源，可能引起金絲猴纖維和其他營養(yǎng)元素缺乏，食物組成的改變可能產(chǎn)生負(fù)面影響，誘發(fā)胃腸道疾?。?］。開展金絲猴胃腸道微生物組特征分析，可為監(jiān)控其健康及營養(yǎng)需求提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。目前一些研究者基于圈養(yǎng)環(huán)境、健康、腹瀉和年齡等因素開展川金絲猴腸道菌群差異分析［5-7］，然而，目前鮮見川、滇、黔3 種圈養(yǎng)金絲猴腸道微生物組的比較研究。北京動(dòng)物園管理處是全國唯一一家飼養(yǎng)川、滇、黔3種金絲猴，且3種金絲猴均能進(jìn)行繁殖的單位，為本項(xiàng)研究提供了基礎(chǔ)。本研究采用16S rDNA測序技術(shù)，開展相同圈養(yǎng)環(huán)境下3種金絲猴腸道微生物組差異分析，探索相關(guān)的微生物組結(jié)構(gòu)，以期為促進(jìn)金絲猴胃腸道健康及相關(guān)疾病防控提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

飼養(yǎng)于北京動(dòng)物園金絲猴館內(nèi)的2 只川金絲猴（祥云和大壯）、2只滇金絲猴（花花和阿貴）和3只黔金絲猴（阿靜、石頭和月月）（表1）。冬季供應(yīng)食物種類包括蘋果、香蕉、雞蛋、芹菜、白菜、西瓜、梨、沙白瓜、胡蘿卜、西紅柿、黃瓜、豇豆、萵筍、生菜、油菜、哈密瓜、白蘿卜、紅薯、玉米、葡萄、圓窩頭和干柞樹葉 22種，夏季將梨、豇豆、葡萄和干柞樹葉更換為芒果、桃、青提和桑葉，種類仍為22種，除冬季和夏季食物結(jié)構(gòu)上略有差異外，飼養(yǎng)環(huán)境及食物結(jié)構(gòu)基本一致。采樣期間，自由采食和飲水，食物為北京動(dòng)物園金絲猴飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)餐，飲水為清潔飲用水。

表1 金絲猴樣本采集信息Tab.1 Information of experimental golden monkeys and samples

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與分組

分別于2017 年11 月和2018 年3 月采集金絲猴糞便樣品，其中，川金絲猴樣本5 份（健康樣本），滇金絲猴樣本7份（5份健康樣本，2份腹瀉樣本），黔金絲猴樣本9 份（健康樣本）。采樣前1 d 將籠舍徹底清掃，次日清晨投喂食物前進(jìn)入籠舍內(nèi)采集新鮮糞便，置于無菌冷凍管內(nèi)，并依次編號（表1），送至實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存，備用。

1.2.2 DNA提取及Illumina MiSeq測序

使 用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit（Omega Bio-Tek，Inc.，Norcross，USA）從糞便樣本內(nèi)部（0.5 g）提取DNA。以基因組DNA 為模板，使用融合引物341F/806R 對 細(xì)菌16S rDNA 基因V3—V4 高 變區(qū)進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系：5.0 μL 10×buffer，0.5 μL dNTPs（10 mmol/L），10 ng 基因組DNA，0.5 μL Bar-PCR primer F（50 μmol/L），0.5 μL Primer R（50 μmol/L），0.5 μL FastPfu Polymerase（5 U/μL），超純水補(bǔ)充體積至50.0 μL。PCR 程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)25 次；72 ℃終延伸5 min。按照DNA 凝膠純化試劑盒說明書將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，由上海凌恩生物科技有限公司（中國，上海）進(jìn)行Illumina HiSeq PE250測序。

1.2.3 16S rDNA基因序列及生物信息學(xué)分析

過濾原始數(shù)據(jù)，去除嵌合體和適配器污染獲得高質(zhì)量clean reads，通過reads 之間的overlap 關(guān)系將reads 拼接成Tags；使用Usearch（version 10，http：//drive5.com/uparse/）在97%相似度下將Tags 聚成操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）；去除嵌合體序列，然后通過OTU 與Ribosomal Database Project（RDP）Classifier（version 2.2，http：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）數(shù)據(jù)庫比對（置信閾值0.7），對OTU 進(jìn)行物種注釋。使用mothur（version 1.30.1，http：//www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP #Alpha_diversity）進(jìn)行物種豐度（Chao1、Richness）和物種豐富度（Shannon、Simpson、ACE 和Evenness）指數(shù)分析；使用R 語言進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）和作圖；使用Qiime 軟件的bray crutis、weighted unifrac 算法計(jì)算β多樣性距離矩陣；用R 語言進(jìn)行非度量多維尺度分析（NMDS）和作圖，構(gòu)建多樣本相似度樹狀圖；使用Qiime 軟件分析ANOSIM 相似性；采用LEfSe軟件分析在門/科/屬等不同分類水平上，與種屬或健康狀況等生物學(xué)指標(biāo)相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；采用Sigmaplot 12.0軟件繪制物種差異柱狀圖。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用IBM SPSS Statistics 20分別對3種金絲猴和健康/腹瀉滇金絲猴樣本的α多樣性指數(shù)（Chao1、Richness、Shannon、Simpson、ACE 和Evenness）進(jìn)行單因素ANOVA 分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；在門和屬水平對細(xì)菌域相關(guān)物種進(jìn)行Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，分析 3 種圈養(yǎng)金絲猴及健康/腹瀉滇金絲猴樣本間的物種豐富度差異；結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，p＜0.05或者Sig.＜0.05示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 圈養(yǎng)金絲猴腸道微生物組成

從21 個(gè)樣本中，共獲得1187 088 個(gè)高質(zhì)量reads，每個(gè)樣品平均獲得56 528 個(gè)高質(zhì)量reads，所有樣品獲得的reads 數(shù)量為43 655～68 956 個(gè)。獲得高質(zhì)量序列的平均長度為414 bp，基于97%相似度聚成1 782 個(gè)OTUs。21 個(gè)樣品平均Good’s coverage為（99.76±0.06）%。

21 個(gè)樣本平均有99.29%的OTUs 被注釋為細(xì)菌域相關(guān)物種，涉及16 門29 綱63 目117 科287 屬。在門水平，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢菌門，三者平均相對豐度分別為57.63%、29.26%和6.77%；其次為螺旋體門（Spirochaetota）和脫硫桿菌門（Desulfobacterota），平均相對豐度為1.37%和1.32%；其余11 個(gè)門平均相對豐度均低于0.80%（圖1A、B）。在屬水平，平均相對豐度前15 的分別為UCG-005、擬桿菌屬（Bacteroides）、Christensenellaceae R-7 group、Muribaculaceae_norank、UCG-002、Rikenellaceae RC9 gut group、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、NK4A214 group、［Eubacterium］coprostanoligenes group_norank、Prevotella_9、副桿菌屬（Parabacteroides）、UCG-010_norank、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、Clostridia UCG-014_norank和埃希氏-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）（圖1C、D）。

圖1 圈養(yǎng)金絲猴腸道微生物組分類學(xué)組成Fig.1 Overall taxonomical composition of gastrointestinal tract microbiota in fecal samples collected from captive golden monkeys

2.2 三種圈養(yǎng)健康金絲猴腸道微生物組差異

分析3 種圈養(yǎng)健康金絲猴樣本微生物群落的 豐富度和多樣性，結(jié)果顯示，Chao1、Richness 和ACE 3 種指數(shù)在3 種金絲猴間無顯著差異（p＞0.05）；川金絲猴的Shannon、Evenness 指數(shù)顯著低于滇、黔金絲猴（p＜0.05），而川金絲猴的Simpson 指數(shù) 顯著高于滇、黔金絲猴（p＜0.05），滇、黔金絲猴的Shannon、Evenness 和Simpson 指數(shù)差異不顯著（p＞0.05）（表2）。

表2 3種圈養(yǎng)健康金絲猴腸道微生物菌群α多樣性Tab.2 Difference of alpha diversity index of gut microbiota among the three species of captive healthy golden monkeys

基于Weighted UniFrac 算法的PCoA 和NMDS 分析圖（圖2A、B）顯示，滇金絲猴和黔金絲猴樣本各自聚類，川金絲猴樣本散布于滇、黔金絲猴樣本間；基于Weighted UniFrac 算法的多樣本相似度樹狀圖顯示，滇金絲猴5 個(gè)樣本聚類于同一分支，黔金絲猴 8個(gè)樣本聚類于同一分支，黔金絲猴tou.s2樣本聚類于滇金絲猴分支內(nèi)，川金絲猴大壯和祥云樣本散布于滇金絲猴和黔金絲猴分支內(nèi)（圖2C）；基于Weighted UniFrac 算法的ANOSIM 分析顯示3 種圈養(yǎng)健康金絲猴間差異顯著（p=0.001）。

圖2 3種圈養(yǎng)健康金絲猴腸道微生物組多樣性和分類組成Fig.2 Diversity and taxonomical composition of gastrointestinal tract microbiota in fecal samples collected from the three species of captive healthy golden monkeys

在門水平進(jìn)行細(xì)菌域相關(guān)物種的分類學(xué)差異分析，川金絲猴樣本檢測到15 門，而滇、黔金絲猴均檢測到16 門；與川金絲猴相比，滇金絲猴多檢測到綠彎菌門（Chloroflexi）相關(guān)物種，而黔金絲猴多檢測到脫鐵桿菌門（Deferribacterota）相關(guān)物種。川金絲猴樣本檢測到厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的平均相對豐度分別為54.13%、29.41% 和12.08%，三者總相對豐度達(dá)95.62%；滇金絲猴樣本檢測到厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的平均相對豐度分別為68.47%、23.36%和1.29%，三者總相對豐度達(dá)93.12%；黔金絲猴樣本檢測到厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的平均相對豐度分別為61.18%、30.27% 和2.53%，三者總相對豐度達(dá)93.98%。進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn)，川、滇金絲猴有2 個(gè)門的相對豐度存在顯著差異，表現(xiàn)為川金絲猴樣本內(nèi)厚壁菌門和脫硫桿菌門相對豐度顯著低于滇金絲猴（p=0.01）；川、黔金絲猴間有2 個(gè)門的相對豐度存在顯著差異，表現(xiàn)為川金絲猴樣本內(nèi)螺旋體門相對豐度顯著低于滇金絲猴（p=0.003），而彎曲桿菌門（Campylobacterota）相對豐度顯著高于黔金絲猴（p=0.04）；滇金絲猴樣本內(nèi)脫硫桿菌門、放線菌門（Actinobacteriota）、Patescibacteria 和彎曲桿菌門的相對豐度均顯著高于黔金絲猴（p＜0.05）（圖2D）。

在屬水平，川、滇、黔金絲猴分別檢測到246、235、243 屬，其中川金絲猴樣本內(nèi)相對豐度超過1%的屬有19 個(gè)，尤其是Christensenellaceae R-7 group、UCG-005、Erysipelotrichaceae_uncultured、Acinetobacter、Rikenellaceae RC9 gut group和Parabacteroides6 屬 的相對豐度超過5%；滇金絲猴樣本內(nèi)相對豐度超過1%的屬有23 個(gè)，其中Christensenellaceae R-7 group、UCG-005、Rikenellaceae RC9 gut group和NK4A214 group4個(gè)屬的相對豐度超過5%；黔金絲猴樣本內(nèi)相對豐度超過1% 的屬有22 個(gè)，其中Muribaculaceae_norank、UCG-005、Bacteroides、Ruminococcus和Christensenellaceae R-7 group5 個(gè)屬的相對豐度超過5%。物種差異分析發(fā)現(xiàn)，川金絲猴與滇金絲猴間有10 個(gè)屬間存在顯著差異，包括高豐度屬UCG-010_norank、Bradymonadales_norank、dgA-11 gut group（p＜0.05）；川金絲猴與黔金絲猴間有29個(gè)屬間存在顯著差異，包含高豐度的Erysipelotrichaceae_uncultured、Parabacteroides、Muribaculaceae_norank、［Eubacterium］coprostanoligenes group_norank、Monoglobus、密螺旋體屬（Treponema）和布勞特氏菌屬（Blautia）（p＜0.05）；而滇金絲猴與黔金絲猴有53 個(gè)屬的相對豐度存在顯著差異，包含高豐度的Christensenellaceae R-7 group、Rikenellaceae RC9 gut group、Parabacteroides、Bacteroides、Ruminococcus、Prevotella_9、Muribaculaceae_norank、［Eubacterium］coprostanoligenes group_norank、p-2534-18B5 gut group_norank、Clostridia UCG-014_norank、UCG-009、Bradymonadales_norank、Treponema、Blautia和dgA-11 gut group 15 個(gè)屬（p＜0.05），3 種圈養(yǎng)健康金絲猴腸道微生物菌群代表性及差異的高豐度屬見表3。

表3 3種圈養(yǎng)健康金絲猴腸道微生物菌群高豐度屬Tab.3 The relative abundance of gut microbiota at genus level of the three species of captive healthy golden monkeys

LEfSe 進(jìn)化分析顯示，3 種健康金絲猴OTUs 在不同分類水平共檢測到47 個(gè)微生物標(biāo)志物的相對豐度存在顯著差異，其中川金絲猴樣本內(nèi)特異性微生物標(biāo)志物較少，而滇、黔金絲猴標(biāo)志物相對較多；典型標(biāo)志物包括黔金絲猴樣本內(nèi)螺旋體門、螺旋體科（Spirochaetaceae）、螺旋體屬（Spirochaeta）的物種在各分類層級中的相對豐度均高于川金絲猴和滇金絲猴，滇金絲猴樣本內(nèi)脫硫桿菌門、脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）的相對豐度均高于川金絲猴和黔金絲猴（圖2E）。

2.3 健康與腹瀉滇金絲猴腸道微生物組差異

分析健康與腹瀉滇金絲猴樣本微生物群落的豐度和多樣性，結(jié)果顯示，健康組Chao1、Richness、Shannon、ACE和Evenness 5種指數(shù)顯著高于腹瀉組，而Simpson指數(shù)顯著低于腹瀉組（p＜0.05）（表4）。

表4 健康與腹瀉滇金絲猴腸道微生物菌群α多樣性Tab.4 Difference of alpha diversity index of gut microbiota between health and diarrhea Rhinopithecus brelichi

基于Weighted UniFrac算法的PCoA、NMDS分析圖及多樣本相似度樹狀圖顯示，健康和腹瀉樣本各自聚類（圖3A-C）；基于Weighted UniFrac 算法的ANOSIM 分析顯示健康與腹瀉樣本間差異顯著（p=0.045）。

圖3 健康與腹瀉滇金絲猴腸道微生物組多樣性和分類組成Fig.3 Diversity and taxonomical composition of gastrointestinal tract microbiota in fecal samples collected from the health and diarrhea Rhinopithecus brelichi

在門水平進(jìn)行細(xì)菌域相關(guān)物種的分類學(xué)差異分析，健康組檢測到16門，腹瀉組僅檢測到12門，未檢測到迷蹤菌門（Elusimicrobiota）、彎曲桿菌門、浮霉菌門（Planctomycetota）和綠彎菌門的相關(guān)物種；健康組和腹瀉組在門水平無顯著差異（p＞0.05）。然而，腹瀉組檢測到厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的平均相對豐度分別為23.32%、39.10%和26.33%，三者總相對豐度僅為88.75%；進(jìn)一步分析2 個(gè)腹瀉樣本的優(yōu)勢菌變化，發(fā)現(xiàn)hua.w1和hua.w2樣本內(nèi)厚壁菌門相對豐度分別下降至26.63%和20.02%，伴隨著hua.w1擬桿菌門相對豐度升高至59.57%和hua.w2 變形菌門相對豐度升高至48.48%。在屬水平進(jìn)行差異分析，健康組共檢測到235 個(gè)屬，而腹瀉組僅檢測到153 個(gè)屬，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示腸桿菌屬（Enterobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、Lachnospiraceae UCG-002、泛菌屬（Pantoea）、Erysipelotrichaceae UCG-006、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、Erysipelotrichaceae UCG-009、罕見小球菌屬（Subdoligranulum）和弧菌屬（Vibrio）9 個(gè)屬僅在腹瀉組被檢測到，且相對豐度均顯著高于健康組（p＜0.05）（圖3D）。

LEfSe 進(jìn)化分析顯示：健康與腹瀉黔金絲猴OTUs 在不同分類水平共檢測到28 個(gè)微生物標(biāo)志物的相對豐度存在顯著差異；其中，典型標(biāo)志物包括健康組樣本內(nèi)Elusimicrobia、Elusimicrobiales、Elusimicrobiaceae 的相對豐度顯著高于腹瀉組；腹瀉組樣本內(nèi)的腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、腸球菌科（Enterococcaceae）、弧菌科（Vibrionaceae）、韋榮氏菌科（Veillonellaceae）、拜葉林克氏菌科（Beijerinckiaceae）和根瘤菌目（Rhizobiales）的相對豐度顯著高于健康組（圖3E）。

3 討論

近些年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有研究者從基因組結(jié)構(gòu)、高海拔適應(yīng)性和進(jìn)化等多角度開展不同金絲猴物種間的差異分析，如不同種群金絲猴在遺傳多樣性、近親繁殖和突變負(fù)荷等方面存在差異，且長期近親繁殖可能導(dǎo)致金絲猴免疫能力下降，對種群的長期生存前景產(chǎn)生巨大影響［8-10］。在臨床上也發(fā)現(xiàn)，金絲猴對胃腸道寄生蟲，尤其是毛尾線蟲（Trichurissp.）極為敏感［11-12］，常引起間歇性腹瀉，甚至排血色水樣糞便［13］。采用驅(qū)蟲藥治療時(shí)，阿苯達(dá)唑?qū)Υ?、黔金絲猴毛首線蟲具有良好的驅(qū)蟲效果，高齡滇金絲猴可能因機(jī)體抵抗力相對較弱出現(xiàn)驅(qū)蟲效果不佳［14］，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力可能在胃腸道寄生蟲病的防控上發(fā)揮重要作用，基于物種的腸道微生物組差異分析可能為金絲猴胃腸道健康及疾病防控提供參考數(shù)據(jù)。

據(jù)報(bào)道，圈養(yǎng)環(huán)境會(huì)影響川金絲猴的腸道微生物組，致使圈養(yǎng)與野生種群在腸道微生物組結(jié)構(gòu)和功能上存在顯著差異［7］。本研究結(jié)果顯示，圈養(yǎng)川、滇和黔金絲猴健康個(gè)體的腸道微生物組的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，這與人類腸道微生物組的組成相似［15］，金絲猴暴露于人類影響和圈養(yǎng)環(huán)境中可能會(huì)引起腸道微生物組人源化，這與Jia等［16］報(bào)道的北京動(dòng)物園圈養(yǎng)北白頰長臂猿（Nomascus leucogenys）腸道微生物組結(jié)果也相似；且3 種圈養(yǎng)金絲猴3 種優(yōu)勢菌門的平均相對豐度相近，這提示，相似的圈養(yǎng)環(huán)境也可能使靈長類動(dòng)物腸道微生物組朝著相似的方向發(fā)展。本研究中圈養(yǎng)川金絲猴樣本內(nèi)厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度分別為54.13%和29.41%，這與Yao等［3］報(bào)道的人工投食的神農(nóng)架川金絲猴菌群結(jié)構(gòu)相似；而Wang 等［7］采用鳥槍法測序宏基因組關(guān)聯(lián)分析上海野生動(dòng)物園圈養(yǎng)川金絲猴腸道微生物組厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度分別為27.1%和37.6%，這與本研究結(jié)果呈現(xiàn)相反的豐度模式，即厚壁菌門相對豐度低于擬桿菌門，且厚壁菌門的相對豐度與本研究結(jié)果相差27.0%，這可能與圈養(yǎng)環(huán)境及研究方法差異有關(guān)，但具體的差異因素仍需更多的數(shù)據(jù)驗(yàn)證。在相對豐度前10 的優(yōu)勢菌屬中，UCG-005、Christensenellaceae R-7 group、UCG-002、Ruminococcus、NK4A214 group和［Eubacterium］coprostanoligenes group_norank隸屬于厚壁菌門，Bacteroides、Muribaculaceae_norank、Rikenellaceae RC9 gut group和Prevotella_9隸屬于擬桿菌門（圖1D），其中，UCG-005、UCG-002隸屬于顫螺旋菌科（Oscillospiraceae），UCG-005的豐度在3 種金絲猴中相對穩(wěn)定。已知顫螺旋菌屬（Oscillospira）在消化纖維素中發(fā)揮重要作用［17］，Ruminococcus在哺乳動(dòng)物纖維素分解過程中發(fā)揮著重要的協(xié)同作用［3］；Bacteroides在維持腸道健康，發(fā)酵有機(jī)物產(chǎn)生能量和營養(yǎng)元素，降解果膠和木質(zhì)素中發(fā)揮著重要作用［4，18-19］；Christensenellaceae 相關(guān)物種廣泛分布于人和動(dòng)物腸道黏膜中，可能與機(jī)體的脂質(zhì)代謝密切相關(guān)［20］；Prevotella與碳水化合物和單糖的消化相關(guān)［21］。這些微生物共同參與機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)代謝，維持著金絲猴健康和食葉的特性。

據(jù)報(bào)道，野生川金絲猴一般生活在海拔1 500～ 4 100 m 的針闊混交林或闊葉混交林內(nèi)，食物以芽、葉片、果實(shí)和樹皮為主，松蘿屬（Usnea）地衣在川金絲猴食譜中占很大比例，長松蘿（U.longissima）是神農(nóng)架地區(qū)常見的樹生枝狀地衣，是川金絲猴重要的食源地衣之一［22］，神農(nóng)架川金絲猴棲息地內(nèi)共有31科58屬85 種川金絲猴的食源植物，食源植物的無氮浸出物、粗纖維和粗灰分為夏季取食的主要影響因子；而食源植物的粗纖維、粗蛋白和相對豐富度為秋季取食的主要影響因子［23］。滇金絲猴主要棲息于海拔2 600～4 200 m 的針闊混交林和暗針葉林中［24］，白馬雪山自然保護(hù)區(qū)內(nèi)滇金絲猴的食物種類達(dá)113種，隸屬36科，其中菌類1種，地衣2種，種子植物110種，滇金絲猴對各種植物的喜食程度不一，長松蘿是主要采食對象，一年四季都食用，因食物供應(yīng)的波動(dòng)性導(dǎo)致食物組成出現(xiàn)明顯的季節(jié)性［25］。與川金絲猴和滇金絲猴不同，黔金絲猴的生境條件與川金絲猴和滇金絲猴有很大差異，主要生活在700～2 000 m 的常綠、落葉闊葉混交林中，主要食物常年供應(yīng)相對充足，而地衣類植物分布很少，未觀察到黔金絲猴采食地衣；夏季和秋季，作為黔金絲猴食物的葉和果實(shí)等種類多，數(shù)量充足；在冬季，落葉類樹種樹葉落盡，常綠樹種葉較老，黔金絲猴主要以芽、嫩皮為食，食物量少，豐富度低［26］。圈養(yǎng)條件下，3 種金絲猴腸道微生物群組成和豐度的差異可能反映了它們在物種、飲食、地理位置、溫度、降雨、管理和其他圈養(yǎng)條件等固有因素方面的差異。其中，飲食等環(huán)境因素作為改變腸道微生物菌群的有效手段，尤其令學(xué)者關(guān)注［27-28］。

進(jìn)一步分析健康金絲猴樣本，發(fā)現(xiàn)川金絲猴的Shannon、Evenness 指數(shù)顯著低于滇、黔金絲猴（p＜0.05），Simpson 指數(shù)顯著高于滇、黔金絲猴（p＜0.05），這提示川金絲猴樣本的微生物群落的豐富度和多樣性低于滇、黔金絲猴。此外，ANOSIM 分析顯示3 種金絲猴樣本間差異顯著（p=0.001），物種分類學(xué)分析顯示3 種金絲猴在細(xì)菌域不同分類水平上存在多物種的差異，LEfSe 進(jìn)化分析顯示3 種金絲猴OTUs 在不同分類水平共檢測到47 個(gè)微生物標(biāo)志物的相對豐度存在顯著差異。本研究中3 種金絲猴飼養(yǎng)于同一館舍內(nèi)，處于相似的圈養(yǎng)環(huán)境，分析北京動(dòng)物園圈養(yǎng)金絲猴食物組成發(fā)現(xiàn)，冬季供應(yīng)食物種類包括蘋果、香蕉等22種，為減少食物改變對動(dòng)物造成的應(yīng)激反應(yīng)，換季時(shí)僅將個(gè)別水果和樹葉做細(xì)微調(diào)整，且冬、夏季供應(yīng)食物總質(zhì)量和食物結(jié)構(gòu)基本平衡。此外，在同一季節(jié)，雖然供應(yīng)給川、滇、黔3 種金絲猴的食物總質(zhì)量不同，但食物種類和結(jié)構(gòu)基本一致，因此推測，腸道微生物組間的這種差異可能并非源于圈養(yǎng)環(huán)境下的食物組成。此外，PCoA、NMDS及多樣本相似度樹狀圖分析顯示，滇、黔金絲猴樣本各自聚類，而川金絲猴樣本散分于滇、黔金絲猴樣本之間；而彭燕章等［29］根據(jù)金絲猴形態(tài)特征及地質(zhì)變遷推測我國3 種特有金絲猴系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，滇金絲猴是屬中進(jìn)化較完善者，而黔金絲猴是最原始者，在進(jìn)化分離過程中，川、滇金絲猴最早分離，其次是川、黔金絲猴，最后是滇、黔金絲猴。3 種圈養(yǎng)金絲猴腸道微生物組與物種分離進(jìn)化并未表現(xiàn)出直接的相關(guān)性，這可能與腸道微生物組受諸多影響因素相關(guān)，同時(shí)限于圈養(yǎng)種群數(shù)量，本研究僅對7 只個(gè)體的冬、春季腸道微生物組進(jìn)行分析，未來仍需進(jìn)一步擴(kuò)充研究數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

與健康滇金絲猴樣本相比，腹瀉樣本腸道微生物組多樣性顯著降低，表現(xiàn)在α多樣性指數(shù)的下降、4 個(gè)門和82 個(gè)屬的相關(guān)物種的缺失。據(jù)報(bào)道，腸道微生物組多樣性低的個(gè)體會(huì)表現(xiàn)出應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)（糖皮質(zhì)激素水平升高）和免疫功能降低（局部的特異性IgA 分泌細(xì)胞較少）［30-33］，腹瀉個(gè)體相對較低的腸道微生物組多樣性是否意味著應(yīng)激反應(yīng)性增加及免疫功能降低有待更多的支持?jǐn)?shù)據(jù)驗(yàn)證。此外，腹瀉樣本優(yōu)勢菌結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，表現(xiàn)為厚壁菌門平均相對豐度下降至23.32%，而擬桿菌門和變形菌門平均相對豐度分別上升至39.10%和26.33%。已知厚壁菌門消化分解飲食中纖維素［34］；擬桿菌門主要促進(jìn)多糖、蛋白質(zhì)和脂肪的消化和分解［35］；變形菌門內(nèi)包含大量的病原菌［3］。在變形菌門中，Vibrio在水生生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在，一小部分物種可以與真核宿主形成致病或共生作用，如霍亂弧菌（V.cholerae）會(huì)周期性地引起嚴(yán)重的腹瀉疾病，該病通常是由于飲用了被病原體污染的飲用水所致［36］。Klebsiella的成員在過去10年中迅速進(jìn)化，產(chǎn)生了同時(shí)表現(xiàn)出多重耐藥和高毒力表型的菌種，它們與嚴(yán)重的醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染有關(guān)，且多重耐藥菌株常對碳青霉烯類抗生素耐受，沒有最佳的感染治療方案，對人類健康產(chǎn)生潛在的影響［37］。Enterobacter是一種全球性的重要病原體，是繼埃希氏菌和克雷伯氏菌之后，人類腸桿菌科第三大常見致病菌，碳青霉烯類抗生素是治療嚴(yán)重腸桿菌感染的主要藥物，但耐藥性的產(chǎn)生也削弱了治療選擇［38］；Pantoea通常是引起植物發(fā)病的潛在病原菌，近些年的研究證據(jù)表明，泛菌屬也常從醫(yī)院環(huán)境中被分離出來，它在人類疾病中的作用還存在較大的爭議［39］，某些泛菌屬物種可能是人類機(jī)會(huì)致病菌，免疫功能低下的個(gè)體通過植物材料所致的傷口或在醫(yī)院獲得性感染［40］。本研究中變形菌門Vibrio、Enterobacter、Klebsiella和Pantoea4個(gè)屬僅在腹瀉組樣本內(nèi)檢測到，而健康樣本未檢測到相關(guān)基因，且它們的相對豐度均顯著高于健康組（p＜0.05）。這提示，腸道微生物菌群的紊亂可能促進(jìn)個(gè)體腹瀉的發(fā)生［4］，已知變形菌門內(nèi)的病原菌可能與金絲猴腸道疾病相關(guān)［3］，本研究中變形菌門相關(guān)菌群的出現(xiàn)可能促進(jìn)或參與滇金絲猴的腹瀉。