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    過表達(dá)擬南芥NPR1增強(qiáng)黃瓜對(duì)枯萎病和白粉病的抗性

    2023-08-15 01:21:10馮向君王宏宇于靜池春玉丁國華
    中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年14期
    關(guān)鍵詞:植物

    馮向君,王宏宇,于靜,池春玉,丁國華

    過表達(dá)擬南芥增強(qiáng)黃瓜對(duì)枯萎病和白粉病的抗性

    馮向君,王宏宇,于靜,池春玉,丁國華

    哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,哈爾濱 150025

    【背景】黃瓜易感多種病害,特別是枯萎病和白粉病,化學(xué)藥物防治雖然有效但因殘留高和不易降解而被限制使用,培育廣譜、持久抗病的黃瓜品種是解決這一難題的根本策略。病程相關(guān)基因非表達(dá)子1(nonexpressor of pathogenesis- related genes 1,NPR1)是系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)中的關(guān)鍵調(diào)控因子,參與調(diào)控多種防御相關(guān)基因的表達(dá),影響植物的抗病能力?!灸康摹吭邳S瓜中過表達(dá),探究轉(zhuǎn)基因黃瓜對(duì)枯萎病和白粉病的抗性,為培育抗病能力更強(qiáng)、更持久的黃瓜品種提供試驗(yàn)依據(jù)。【方法】通過克隆擬南芥,構(gòu)建過表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黃瓜,獲得過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因黃瓜植株,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株中相關(guān)防御基因的表達(dá)量。選擇T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行枯萎病的抗性鑒定,T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行白粉病的抗性鑒定,測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株接種枯萎病菌(f. sp.)和白粉病菌()后,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)等抗氧化酶活性變化及丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量的變化。【結(jié)果】成功獲得8株T0代轉(zhuǎn)基因植株,OE#4和OE#5為高表達(dá)植株,OE#3為低表達(dá)植株;通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中相關(guān)防御基因的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn),過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中多個(gè)相關(guān)防御基因表現(xiàn)更強(qiáng)、更快的表達(dá),并且防御基因的表達(dá)量與在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量呈正相關(guān)。其中,、和的表達(dá)量上調(diào)極為顯著。轉(zhuǎn)基因植株的抗病性鑒定結(jié)果表明,在枯萎病和白粉病的脅迫下,轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更顯著的抗性,發(fā)病緩慢、癥狀輕微,病斑面積顯著低于野生型(WT)植株。轉(zhuǎn)基因T0代植株OE#4和OE#5在接種枯萎病菌3 d后未出現(xiàn)明顯病斑,接種7 d后出現(xiàn)灰褐色病斑,但未呈現(xiàn)萎蔫等狀態(tài);WT植株在接種3 d時(shí)出現(xiàn)灰褐色病斑并且輕微萎蔫,7 d時(shí)葉片出現(xiàn)嚴(yán)重萎蔫。接種白粉病菌7 d后,T1代植株OE#2和OE#7和WT植株均出現(xiàn)病斑,但OE#2和OE#7植株病斑面積顯著低于WT植株;接種15 d后WT植株出現(xiàn)葉片黃化失綠,而轉(zhuǎn)基因植株OE#2和OE#7病情較輕。與WT植株相比,接種病原菌后,轉(zhuǎn)基因植株中MDA含量較低,SOD、POD、CAT活性保持較高水平,ROS含量累積較少?!窘Y(jié)論】黃瓜中過表達(dá)可以提高黃瓜對(duì)枯萎病和白粉病的抗性。

    黃瓜;;枯萎病;白粉??;抗病性

    0 引言

    【研究意義】黃瓜()是重要的蔬菜作物,其產(chǎn)量水平已躍居全球第四大蔬菜作物[1]。隨著種植技術(shù)及方式的提升,黃瓜的產(chǎn)量不斷增加,但在北方溫室內(nèi)極易滋生白粉病菌,使黃瓜葉片褪綠,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致葉片完全枯死,造成黃瓜減產(chǎn)或絕收[2]。此外,枯萎病也是黃瓜生產(chǎn)中主要的真菌病害,同樣會(huì)導(dǎo)致黃瓜減產(chǎn)甚至絕收[3]。目前,針對(duì)白粉病和枯萎病的防治策略主要集中在化學(xué)防治和生物防治等方面[4-5],但化學(xué)農(nóng)藥的使用容易產(chǎn)生抗藥性使防治效果逐漸降低,并且會(huì)引起環(huán)境和安全問題;近年來,利用有益、高效的生防細(xì)菌來防治黃瓜病害更加綠色環(huán)保,但生物防治見效慢且不具有長效性,在生產(chǎn)上應(yīng)用于黃瓜病害防治的高效生防菌株比較有限[6-7]。因此,培育抗病品種是比較經(jīng)濟(jì)有效的防治黃瓜白粉病、枯萎病等病害的策略?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物為了抵御病原菌會(huì)誘導(dǎo)一系列防御機(jī)制。其中,系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)是一種依賴于水楊酸(SA)的防御反應(yīng),SAR的發(fā)生伴隨著SA含量的增加和大量抗病相關(guān)基因(pathogenesis-related gene,)在局部和全身組織中的表達(dá)增加,從而增強(qiáng)植物的抵抗力[8],為植物提供更加長久有效的保護(hù)機(jī)制。病程相關(guān)基因非表達(dá)子1(nonexpressor of pathogenesis-related genes 1,NPR1)是依賴SA的SAR途徑中的關(guān)鍵調(diào)控因子,其下游所調(diào)控的基因主要是與抗病相關(guān)的防御基因[9]。Cao等[10]在SA缺陷的擬南芥()突變體中發(fā)現(xiàn),基因功能缺陷的擬南芥植株的表達(dá)受損,幾乎不能建立起有效的SAR,表明擬南芥是SA誘導(dǎo)的表達(dá)和抵抗病原體所必需的。正常狀態(tài)下,NPR1以寡聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中[11]。病原體感染后,宿主植物迅速積累SA誘導(dǎo)產(chǎn)生大量抗氧化劑,進(jìn)而誘導(dǎo)NPR1寡聚體解體為單體化,NPR1單體進(jìn)入細(xì)胞核與TGA(TGACG motif-binding factor)轉(zhuǎn)錄因子相互作用,然后激活下游靶基因如的表達(dá)[12]。在擬南芥中組成型表達(dá),轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)霜霉病菌和丁香假單胞菌的抗性增強(qiáng),PR蛋白的表達(dá)量也有所提高[13]。隨后,擬南芥陸續(xù)被轉(zhuǎn)入多種植物中,在多種植物中過表達(dá)與植物的抗病性呈現(xiàn)直接相關(guān)[14]。轉(zhuǎn)的小麥對(duì)鐮孢菌頭枯病抗性顯著增強(qiáng)與真菌攻擊時(shí)防御反應(yīng)的更快激活有關(guān)[15];轉(zhuǎn)基因油菜表現(xiàn)出對(duì)丁香假單胞菌的抗性[16];轉(zhuǎn)基因胡蘿卜對(duì)核盤霉等病菌的抗性均明顯提高[17]。目前已從多種植物中分離到了及同源基因,并證實(shí)了這些植物中及其同源基因的作用。葡萄中超表達(dá)能夠增強(qiáng)對(duì)白粉病的抗性,誘導(dǎo)PR蛋白的積累[18];谷子中在抵御禾生指梗霉侵染方面發(fā)揮重要作用[19];獼猴桃中在獼猴桃抗病脅迫方面具有積極作用[20];此外,南瓜中克隆到同源基因,該基因與美洲南瓜中同源基因親緣關(guān)系較近,但研究發(fā)現(xiàn)該同源基因?qū)δ瞎洗苹ㄓ绕涫谴迫锏陌l(fā)育具有重要作用[21]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于黃瓜及其同源基因的研究較少,目前黃瓜未見公開報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)黃瓜及其同源基因進(jìn)行全基因組鑒定,未發(fā)現(xiàn),但鑒定到了3條同源基因、和,同源性分析發(fā)現(xiàn),和與和的同源性最高,與和的同源關(guān)系最近。鑒于調(diào)控SAR的重要作用,擬將擬南芥轉(zhuǎn)入黃瓜,驗(yàn)證過表達(dá)的黃瓜植株對(duì)枯萎病和白粉病的抗性?!緮M解決的關(guān)鍵問題】明確黃瓜中過表達(dá)對(duì)枯萎病和白粉病的誘導(dǎo)抗性,探究對(duì)黃瓜枯萎病和白粉病的誘導(dǎo)抗性機(jī)理,為有效利用該抗病材料,培育黃瓜復(fù)合抗病新品種提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    試驗(yàn)于2021年3月至2023年1月在哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物生物學(xué)省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

    1.1 材料

    野生型擬南芥種子為本實(shí)驗(yàn)室保存,黃瓜品種采用‘長春密刺’,黃瓜枯萎病菌種H46-5為尖孢鐮孢菌黃瓜專化型(f. sp.),由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)張艷菊教授提供。白粉病孢子采集于哈爾濱師范大學(xué)試驗(yàn)田,鑒定為二孢型白粉病菌()。

    1.2 儀器與試劑

    低溫高速離心機(jī)、PCR儀(eppendorf);高溫滅菌鍋(致微儀器有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);超凈工作臺(tái)、紫外分光光度計(jì)、MS培養(yǎng)基、特美汀;植物總RNA提取試劑盒、植物DNA提取試劑盒(康為世紀(jì)公司)等。

    1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建與黃瓜轉(zhuǎn)化

    根據(jù)NCBI中的CDS序列設(shè)計(jì)全長擴(kuò)增引物5′CGGGATCCATGGACACCACCATTGATGGA TTCG3′和5′CGAGCTCTCACCGACGACGATGAGA GAGTTTA3′,內(nèi)含H I和I酶切位點(diǎn),以野生型擬南芥總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,PCR擴(kuò)增獲得。測(cè)序驗(yàn)證序列后,H I和I酶切與pBI121質(zhì)粒連接,構(gòu)建CaMV 35S啟動(dòng)的表達(dá)載體,凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。農(nóng)桿菌侵染發(fā)芽培養(yǎng)基上生長5—6 d的‘長春密刺’黃瓜子葉節(jié),培養(yǎng)基加卡那霉素進(jìn)行篩選培養(yǎng),15 d后轉(zhuǎn)入伸長培養(yǎng)基培養(yǎng),待再生植株生長至2—3 cm高后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)至根系粗壯時(shí),馴化培養(yǎng)。

    1.4 轉(zhuǎn)NPR1植株的PCR鑒定及PR表達(dá)量測(cè)定

    提取轉(zhuǎn)化植株幼葉基因組DNA,使用擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性94 ℃,5 min;變性94 ℃,30 s;退火62 ℃,30 s;延伸72 ℃,2 min;重復(fù)35個(gè)循環(huán)后,4 ℃保存。提取待測(cè)植株總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)測(cè)定、抗病相關(guān)基因、、、防御相關(guān)基因、、、及NPR1下游因子靶基因的表達(dá)量,上述基因的熒光定量PCR引物見表1。

    1.5 枯萎病抗性鑒定

    在PDA平板上繼代培養(yǎng)3次,挑取白色菌絲在PDB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)5—7 d后,用滅菌紗布過濾菌絲,將過濾后的菌液4 ℃,3 000 r/min,離心15 min,棄去上清液;PDB液體培養(yǎng)基重懸菌體沉淀后,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定菌液濃度為1×106個(gè)孢子/mL即可。接種方法參考劉縉等[22]苗期人工接種方法,后進(jìn)行了改良采用點(diǎn)滴法,將菌液滴于T0代轉(zhuǎn)基因植株和WT植株葉片上,進(jìn)行苗期人工接種。觀察T0代轉(zhuǎn)基因植株和WT植株接種枯萎病菌后發(fā)病情況,病情嚴(yán)重程度參考周紅梅等[23]方法。分別取發(fā)病初期3 d和發(fā)病后期7 d時(shí)的葉片,利用Image J軟件測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株和WT植株的病斑面積[24]。以WT植株為對(duì)照,測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株接種枯萎病菌前后不同時(shí)間轉(zhuǎn)基因植株葉片內(nèi)MDA含量、SOD、POD、CAT活性,測(cè)定方法詳見李小方等[25];摘取WT植株和轉(zhuǎn)基因植株發(fā)病3和7 d時(shí)的葉片進(jìn)行NBT和DAB染色,分析轉(zhuǎn)基因植株染病后葉片內(nèi)超氧陰離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)的變化,上述試驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

    表1 下游相關(guān)基因的qPCR引物

    1.6 白粉病抗性鑒定

    用干毛筆掃去病葉上的白粉病孢子于含有無菌水的培養(yǎng)皿中,用10 μg·mL-1的SDS溶液配制成孢子數(shù)量為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液,使用噴霧接種法接種于T1代轉(zhuǎn)基因植株和WT植株葉片上[26]。在相同條件下培養(yǎng),觀察T1代轉(zhuǎn)基因植株和WT植株接種白粉病菌后葉片的癥狀,病情鑒定參照病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[27]。取T1代轉(zhuǎn)基因植株和WT植株發(fā)病7和15 d時(shí)的葉片,使用Image J軟件測(cè)定T1代轉(zhuǎn)基因植株和WT植株的病斑面積,鑒定T1代轉(zhuǎn)基因植株對(duì)白粉病的抗性。以WT植株為對(duì)照,測(cè)定T1代轉(zhuǎn)基因植株接種白粉病菌前后不同時(shí)間葉片內(nèi)相關(guān)生理指標(biāo),方法同上所述。

    1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

    qPCR分析基因表達(dá)量中以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,數(shù)據(jù)均為具有標(biāo)準(zhǔn)差的3個(gè)生物重復(fù)的平均值,采用2-ΔΔCt法分析。采用excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,Graphad Prism軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

    2 結(jié)果

    2.1 轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的培育及鑒定

    為了在黃瓜中表達(dá)擬南芥,構(gòu)建了一個(gè)重組質(zhì)粒,由CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)(圖1-A);通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至黃瓜中,共得到10棵轉(zhuǎn)化植株,提取轉(zhuǎn)化植株葉片的DNA,以的特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè),其中8個(gè)單株中檢測(cè)到(1 782 bp),與陽性對(duì)照一致,共獲得8株轉(zhuǎn)基因陽性植株(圖1-B);以WT植株為對(duì)照,隨機(jī)選取3株轉(zhuǎn)基因陽性植株OE#3、OE#4和OE#5,利用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株葉片內(nèi)目的基因的表達(dá)量,其中OE#4和OE#5植株中目的基因的表達(dá)量顯著高于WT植株,分別達(dá)到24和63倍,被認(rèn)為具有相對(duì)較高的表達(dá)水平;而OE#3株系植株中目的基因的表達(dá)量低,僅為1.7倍,與WT植株相比無顯著差異(圖1-C)。OE#4和OE#5兩個(gè)植株的親本自交獲得的T1代植株可用于后續(xù)抗病性研究。

    2.2 AtNPR1過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株NPR1下游基因的表達(dá)

    選擇OE#3、OE#4和OE#5轉(zhuǎn)基因植株作為代表,qRT-PCR詳細(xì)評(píng)估了防御相關(guān)基因的表達(dá)量(圖2)。病程相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達(dá),在OE#4和OE#5轉(zhuǎn)基因植株中觀察到的表達(dá)量顯著上調(diào)。在OE#4和OE#5轉(zhuǎn)基因植株中觀察到表達(dá)量的顯著提高,是WT植株中表達(dá)量的13和18倍。與對(duì)照相比,在轉(zhuǎn)基因植株OE#4和OE#5中的表達(dá)量極顯著上調(diào),達(dá)到5和23倍。在轉(zhuǎn)基因植株OE#5中的表達(dá)量顯著上升,達(dá)到5.7倍;作為JA介導(dǎo)的植物抗病信號(hào)通路的關(guān)鍵基因,在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量降低。清除活性氧相關(guān)基因在OE#4和OE#5中的表達(dá)量分別達(dá)到3.9和5倍;在OE#5中的表達(dá)量達(dá)到7.8倍。結(jié)果表明,上述防御相關(guān)基因在各轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)水平不同。在轉(zhuǎn)基因植株OE#4和OE#5中,的過表達(dá)導(dǎo)致下游防御相關(guān)基因表達(dá)水平的顯著提高;然而在OE#3中沒有觀察到這些防御相關(guān)基因與表達(dá)的相關(guān)性。并且,在高表達(dá)水平轉(zhuǎn)基因植株(OE#4和OE#5)中,轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的提高會(huì)誘導(dǎo)防御相關(guān)基因表達(dá)水平更顯著上調(diào),的表達(dá)水平與防御相關(guān)基因表達(dá)水平呈正相關(guān)。

    A:AtNPR1表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖The structure of AtNPR1 expression vector。B:轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定PCR identification of transformed plants。M:DNA Marker 2000;1:模板為水the template is water;2:模板為pBI121:AtNPR1 the template is pBI121: AtNPR1;3:模板為非轉(zhuǎn)化植株DNA non-transgenic cucumber materials;4—13:模板為轉(zhuǎn)化植株DNA Transgenic plants。C:轉(zhuǎn)基因植株中AtNPR1表達(dá)量分析Analysis of AtNPR1 expression in transgenic plants。WT:野生型wild type;OE#3、OE#4、OE#5:轉(zhuǎn)基因植株transgenic lines;*:與WT的顯著性Significance with WT;:組內(nèi)差異顯著性分析intra-group difference significance analysis;*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001,****:p<0.0001。下同The same as below

    2.3 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)枯萎病的抗性增強(qiáng)

    以WT植株作為對(duì)照,選取轉(zhuǎn)基因植株OE#3、OE#4和OE#5接種枯萎病菌。接種3 d后,WT植株出現(xiàn)明顯的褐色病斑,并且呈輕微萎蔫,葉片發(fā)黃狀態(tài);轉(zhuǎn)基因植株葉片上出現(xiàn)灰色霉層,未呈現(xiàn)明顯的褐色病斑;接種7 d時(shí),轉(zhuǎn)基因植株和WT植株均呈現(xiàn)不同程度的病情加重,WT植株葉片出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮,葉柄基部呈現(xiàn)嚴(yán)重灰褐色病斑;OE#3、OE#4、OE#5植株葉片病斑面積擴(kuò)大,病灶處呈現(xiàn)輕微萎蔫狀態(tài)(圖3-A)。測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株和WT植株葉片接種枯萎病菌后不同時(shí)間的病斑面積,發(fā)現(xiàn)接種枯萎病菌后轉(zhuǎn)基因植株的病斑面積顯著低于WT植株(圖3-B)。與WT植株相比,轉(zhuǎn)基因植株在接種枯萎病后癥狀較輕、病斑面積較小、發(fā)病較慢并且在OE#4和OE#5中更加顯著,表明在黃瓜中的表達(dá)可以提高黃瓜對(duì)枯萎病的抗性。

    從對(duì)枯萎病表現(xiàn)出抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株中選出OE#4和OE#5,測(cè)定接種枯萎病菌前后轉(zhuǎn)基因植株和WT植株葉片內(nèi)MDA含量及SOD、POD、CAT活性的變化。接種枯萎病菌后,WT植株和轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量均呈逐漸升高趨勢(shì),但轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量始終低于WT植株,特別是在接種7 d時(shí),轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量顯著低于WT植株(圖4-A)。接種枯萎病菌前后,轉(zhuǎn)基因植株葉片內(nèi)SOD、POD、CAT活性均高于WT植株(圖4-B、4-C、4-D)。接種枯萎病菌3 d時(shí),轉(zhuǎn)基因植株和WT植株葉片內(nèi)均產(chǎn)生了O2-和H2O2,WT植株葉片內(nèi)積累的ROS含量略高于轉(zhuǎn)基因植株,但差異不明顯;接種7 d時(shí),轉(zhuǎn)基因植株葉片NBT染色和DAB染色的情況均比WT植株更輕,這表明轉(zhuǎn)基因植株葉片內(nèi)積累的O2-和H2O2含量均低于WT植株,且差異明顯(圖4-E)。

    圖2 轉(zhuǎn)基因植株下游防御基因的表達(dá)量

    2.4 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)白粉病的抗性增強(qiáng)

    接種白粉病菌7 d時(shí),WT植株葉片上出現(xiàn)明顯的白粉病病斑,病斑面積達(dá)到17%;轉(zhuǎn)基因T1代植株OE#2和OE#7葉片上出現(xiàn)小面積的白粉病病斑,病情較輕,病斑面積分別為9%和8.5%,顯著低于WT植株。接種15 d時(shí),隨著病情的加重,轉(zhuǎn)基因植株和WT植株葉片上均呈現(xiàn)明顯的白粉病病斑,然而與轉(zhuǎn)基因植株相比,WT植株葉片出現(xiàn)邊緣黃化失綠等特征,病情更為嚴(yán)重;并且,轉(zhuǎn)基因植株OE#2和OE#7葉片的病斑面積極顯著低于WT植株(圖5)。

    未接種白粉病菌時(shí),轉(zhuǎn)基因植株和WT植株葉片內(nèi)MDA含量無明顯差異;接種白粉病菌后,轉(zhuǎn)基因植株和WT植株葉片內(nèi)MDA含量均呈上升趨勢(shì),與WT植株相比,OE#2、OE#7植株葉片內(nèi)MDA含量上升幅度較慢,且始終顯著低于WT植株(圖6-A)。接種白粉病菌前后,轉(zhuǎn)基因植株葉片內(nèi)SOD、POD、CAT活性均高于WT植株(圖6-B、6-C、6-D)。接種白粉病菌7、15 d時(shí),OE#2和OE#7葉片內(nèi)ROS含量均低于WT型植株,但接種15 d時(shí)差異達(dá)顯著水平(圖6-E)。結(jié)果表明,T1代轉(zhuǎn)基因植株OE#2和OE#7對(duì)白粉病的抗性提高。

    A:表型觀察Phenotypic observation;B:病斑相對(duì)面積Relative area of disease spots

    A:表型觀察Phenotypic observation;B:病斑相對(duì)面積Relative area of disease spots

    A—D:分別為接種白粉病菌前后T1代轉(zhuǎn)基因植株葉片MDA含量,SOD、POD、CAT活性MDA content, SOD, POD and CAT activities in leaves of T1 generation transgenic plants before and after G. cichoracearum inoculation, respectively;E:T1代轉(zhuǎn)基因植株接種白粉病菌后ROS含量的變化(NBT染色:葉片染色后呈現(xiàn)深藍(lán)色,表示O2-含量;DAB染色:葉片染色后呈現(xiàn)棕褐色,表示H2O2含量)Changes of ROS content in T1 transgenic plants after inoculation with G. cichoracearum (NBT staining: the leaves show dark blue after dyeing, indicating O2- content; DAB staining: leaves are brown after staining, indicating H2O2 content)

    3 討論

    3.1 轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定及相關(guān)防御基因的表達(dá)分析

    在本研究中,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,在CaMV35S啟動(dòng)子的控制下將轉(zhuǎn)入黃瓜,獲得過表達(dá)轉(zhuǎn)基因黃瓜。研究發(fā)現(xiàn),在3個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)水平有差異,OE#4和OE#5植株為高表達(dá)植株,OE#3植株為低表達(dá)植株。在本研究中,根據(jù)的不同表達(dá)水平,評(píng)估了參與植物防御信號(hào)通路的下游基因的表達(dá)量。作為病程相關(guān)基因,與植物的抗病性密切相關(guān)。先前的研究表明,、和在轉(zhuǎn)基因植物中的組成性高水平表達(dá)賦予了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)真菌感染更高的耐受性[28-29],表明這些基因具有抗真菌感染的功能。本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株中、、、的表達(dá)量整體呈上升趨勢(shì)。其中,和的表達(dá)量上調(diào)極為顯著,這可能是因?yàn)楹蜑镾A介導(dǎo)的SAR途徑中的主要標(biāo)志基因。

    位于的下游,是的直接作用目標(biāo),在SA介導(dǎo)的抗病途徑中發(fā)揮積極作用。在柑橘中過表達(dá)引起的表達(dá)上調(diào),并且顯示出對(duì)黃龍病更高的抗性[30]。本研究發(fā)現(xiàn),的過表達(dá)使得轉(zhuǎn)基因植株OE#4和OE#5中的顯著上調(diào)表達(dá)。、是JA介導(dǎo)的信號(hào)途徑中的關(guān)鍵基因,此外還參與植保素和ROS的產(chǎn)生來抵抗病原體的侵染,與植物的防御反應(yīng)緊密相關(guān)[31-32]。本研究中,轉(zhuǎn)基因植株OE#4和OE#5中呈下調(diào)表達(dá),表明在黃瓜中的過表達(dá)對(duì)JA介導(dǎo)的抗病信號(hào)途徑?jīng)]有顯著激活作用。和是清除ROS相關(guān)基因,可以分解H2O2從而降低氧自由基濃度,減輕對(duì)細(xì)胞的傷害,增強(qiáng)植物抗性。本研究發(fā)現(xiàn),的過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株OE#4和OE#5中和的表達(dá)量上調(diào)。這表明,轉(zhuǎn)基因株系中抗氧化酶基因的上調(diào)表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致其抗氧化酶活性的升高。此外,本研究表明,與非轉(zhuǎn)基因植株相比,轉(zhuǎn)基因植株OE#3中下游防御基因的表達(dá)沒有呈現(xiàn)出顯著差異,這可能與在轉(zhuǎn)基因植株OE#3中的表達(dá)水平較低有關(guān)??傊倪^表達(dá)誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因黃瓜中下游防御基因的上調(diào)表達(dá),這可能與轉(zhuǎn)基因黃瓜抗病性的提高直接相關(guān)。

    3.2 AtNPR1在黃瓜中的過表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)枯萎病、白粉病的抗性

    研究表明,在植物中的過表達(dá)與植物的抗病性直接相關(guān)。轉(zhuǎn)基因番茄不僅對(duì)番茄花葉病毒產(chǎn)生抗性,而且對(duì)多種真菌性和細(xì)菌性病害表現(xiàn)出廣譜抗性;積累較高水平的轉(zhuǎn)基因番茄品系表現(xiàn)出更廣譜的抗病性,并且增強(qiáng)的抗病性穩(wěn)定遺傳[33]。轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)黑根腐病有顯著程度的耐受性,過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物根部可更強(qiáng)、更快地誘導(dǎo)大多數(shù)防御相關(guān)基因[34];本研究結(jié)果與這些報(bào)道一致,在黃瓜中過表達(dá)提高了對(duì)真菌病原體的抗病性,表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因植物癥狀出現(xiàn)的延遲、病灶面積的減少。這些結(jié)果證明,至少在枯萎病和白粉病感染的早期,過表達(dá)延遲了發(fā)病進(jìn)程。

    通過測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株感染枯萎病及白粉病后相關(guān)生理指標(biāo),進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因植株的抗病生理機(jī)制。結(jié)果表明,接種枯萎病菌和白粉病菌導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株和WT植株葉片內(nèi)MDA含量均上升,但轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)MDA含量顯著低于WT植株。秦智偉等[35]研究表明,霜霉病菌處理后,過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因黃瓜植株中MDA含量顯著低于對(duì)照組。本研究中,轉(zhuǎn)基因植株在接種枯萎病菌及白粉病菌后SOD、POD、CAT活性均顯著高于WT植株。朱金成等[36]對(duì)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因棉花株系接種枯萎病菌后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因棉花葉片內(nèi)SOD、POD、CAT活性逐漸增高,并且其酶活性顯著高于野生型材料;沙仁和等[37]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因蘋果在接種白粉病菌后,抗氧化酶活性顯著提高,產(chǎn)生的ROS顯著低于WT植株,對(duì)白粉病的抗性增強(qiáng)。本研究結(jié)果與上述報(bào)道的結(jié)果一致,表明轉(zhuǎn)基因植株中抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)植株的抗病性起到積極調(diào)控作用。此外,本研究表明,轉(zhuǎn)基因植株在受到病原菌侵染的早期,SOD活性迅速上升、POD和CAT活性上升速度較慢;但在病原菌侵染的后期,與WT植株相比,轉(zhuǎn)基因植株葉片內(nèi)SOD、POD、CAT活性的下降速度慢,維持較高的酶活性,更有利于積累抗性物質(zhì),從而增強(qiáng)植物抗性。

    ROS可以作為一種信號(hào)分子啟動(dòng)植物的抗病反應(yīng),適量ROS的產(chǎn)生與積累可以增強(qiáng)植物的抗病性,但ROS的過量產(chǎn)生與積累會(huì)對(duì)植物造成損害,植物會(huì)通過抗氧化酶來清除ROS,維持ROS的動(dòng)態(tài)平衡[38]。在黃瓜霜霉病菌的侵染下,黃瓜的過表達(dá)植株中抗氧化酶表達(dá)水平較對(duì)照植株更高,積累的ROS較少[39]。本研究發(fā)現(xiàn),在接種枯萎病菌和白粉病菌早期,轉(zhuǎn)基因植株葉片內(nèi)ROS含量較少;在接種病原菌的后期,轉(zhuǎn)基因植株葉片內(nèi)累積的ROS含量顯著少于WT植株。病原菌侵染植物體后,會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生,ROS的平衡對(duì)植物起著重要作用。轉(zhuǎn)基因植株中抗氧化酶活性的提高,有利于轉(zhuǎn)基因植株清除累積的ROS,維持ROS的動(dòng)態(tài)平衡,從而進(jìn)一步提高抗病能力。

    植物體內(nèi)的防御機(jī)制比較復(fù)雜,通過多種途徑來抵抗病原菌的入侵。NPR1作為植物不同抗病信號(hào)途徑的交叉點(diǎn),在植物防御信號(hào)途徑中起到調(diào)節(jié)作用。其中,研究較為清晰的SA介導(dǎo)的SAR途徑中,NPR1起到關(guān)鍵作用,通過激活下游防御相關(guān)基因提高植物對(duì)病原菌的抗性。此外,黃瓜對(duì)枯萎病和白粉病的抗性還與結(jié)構(gòu)抗性和生理抗性相關(guān)。當(dāng)枯萎病菌侵染植株后,黃瓜抗病材料較感病材料會(huì)更早形成一系列防衛(wèi)反應(yīng)[40]。黃瓜抗病品種‘津研7號(hào)’感染白粉病后,其POD、PPO和PAL活性較感病品種均明顯升高[41]。本研究表明,在黃瓜中的組成型表達(dá)賦予了黃瓜對(duì)枯萎病和白粉病更強(qiáng)的抵抗力。轉(zhuǎn)基因黃瓜抗病能力的提高,是通過SA介導(dǎo)的防御信號(hào)途徑來提高下游防御相關(guān)基因的表達(dá)以及通過提高抗氧化酶活性,維持ROS的動(dòng)態(tài)平衡,調(diào)控植物積極參與抗病反應(yīng)。然而,關(guān)于在黃瓜中的表達(dá)對(duì)提高黃瓜抗病性的具體分子機(jī)制需要結(jié)合多組學(xué)分析進(jìn)行深入研究,并且進(jìn)一步挖掘更多潛在的廣譜抗病基因。本研究證實(shí)了通過轉(zhuǎn)基因手段將轉(zhuǎn)入黃瓜,有助于黃瓜抗病性的遺傳改良,為培育更強(qiáng)、更持久的抗病黃瓜品種提供了理論依據(jù)。

    4 結(jié)論

    在黃瓜中過表達(dá)誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因植株中下游防御基因的上調(diào)表達(dá)。白粉病菌和枯萎病菌處理后,與WT植株相比,轉(zhuǎn)基因植株中MDA含量降低,抗氧化酶活性升高,ROS含量的累積較少,病斑面積顯著降低,病情較輕,表明過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因黃瓜對(duì)枯萎病和白粉病的抗性。

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    Overexpressingfromenhanced resistance to Fusarium wilt and Powdery mildew in

    Feng XiangJun, Wang HongYu, Yu Jing, Chi ChunYu, Ding GuoHua

    School of Life Science & Technology, Harbin Normal University, Harbin 150025

    【Background】Cucumber () is susceptible to many diseases, especially Fusarium wilt and powdery mildew. Although chemical control is effective, it is limited due to high residue and difficult degradation. Breeding cucumber varieties with broad-spectrum and long-lasting disease resistance is the fundamental strategy to solve this problem. nonexpressor of pathogenesis-related genes 1 (NPR1) is a key regulator in systemic acquired resistance (SAR), which is involved in regulating the expression of a variety of defense-related genes and affecting plant disease resistance.【Objective】Overexpression ofto explore the resistance of transgenic cucumber to Fusarium wilt and powdery mildew, and to provide experimental basis for breeding cucumber varieties with stronger and more lasting disease resistance.【Method】Theofwas cloned, theoverexpression vector was constructed, and the cucumber was transformed by-mediated method to obtain transgenic cucumber plants with overexpression of. The expression levels of related defense genes in transgenic plants were determined by real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) method. Transgenic plants of T0generation were selected for resistance identification of Fusarium wilt, and transgenic plants of T1generation were selected for resistance identification of powdery mildew. After inoculation transgenic plants withf. sp.and, the activities of antioxidant enzymes, including superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) , as well as the levels of malondialdehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS) were quantified.【Result】Eight transgenic plants of the T0generation were successfully obtained, among which OE#4 and OE#5 exhibited high expression levels of, while OE#3 showed low expression levels. Analysis of the expression level of related defense genes in transgenic plants revealed that those plants overexpressingexhibited stronger and faster expression of several defense genes. Furthermore, there was a positive correlation between the expression levels of defense genes andAmong them, the expression levels of,andwere significantly up-regulated.The results of disease resistance identification of transgenic plants showed that the transgenic plants exhibited more significant resistance, slower onset, mild symptoms, and significantly lower lesion area than wild type (WT) plants when subjected to the stress of Fusarium wilt and powdery mildew.The transgenic T0plants OE#4 and OE#5 exhibited no discernible lesions 3 days post-inoculation withf. sp., but displayed gray-brown lesions after 7 days without any signs of wilting. Conversely, the WT plants showed gray-brown lesions and slight wilting at 3 d post-inoculation, followed by severe leaf wilting at 7 d. After 7 days of inoculation with, both T1generation plants OE#2 and OE#7 as well as wild type (WT) plants exhibited lesions. However, the lesion area in OE#2 and OE#7 was significantly smaller than that in WT. After 15 days of inoculation, chlorosis appeared on the leaves of WT plants while the transgenic plants remained mildly affected.Compared with WT plants, transgenic plants exhibited lower MDA content and maintained higher levels of SOD, POD and CAT activities after inoculation. Additionally, the accumulation of ROS was less.【Conclusion】Overexpression of

    cucumber ();; Fusarium wilt; powdery mildew; disease resistance

    10.3864/j.issn.0578-1752.2023.14.006

    2023-04-17;

    2023-05-17

    國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31770350)、哈爾濱師范大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(HSDBSCX2021-02)

    馮向君,E-mail:fxj258091@126.com。王宏宇,E-mail:wanghongyu0828@163.com。馮向君和王宏宇為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者丁國華,E-mail:hsddgh@hrbnu.edu.cn

    (責(zé)任編輯 岳梅)

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