熒光PCR 熔解曲線法對痰樣本結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測價值及耐藥特征分析

吳燕飛 徐麗霞 賴聰娟 季柏林 周琛博 許河南

隨著抗結(jié)核藥物廣泛、長期以及不規(guī)范使用等因素影響，結(jié)核分枝桿菌耐藥問題越來越復(fù)雜，耐藥結(jié)核病尤其耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB）的發(fā)病率日趨增高，耐藥性的產(chǎn)生使其具有病程長、病情復(fù)雜、治愈率低、病死率高等危害。2020 年全球上報耐多藥/利福平耐藥結(jié)核（MDR/RR-TB）13.2 萬例，準(zhǔn)廣泛耐藥或廣泛耐藥結(jié)核病2.6 萬例，合計約15.8 例，較2019 年下降22%，據(jù)估算我國耐藥結(jié)核病發(fā)病率居全球前三位[1]。2017 年，《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》把結(jié)核分枝桿菌（MTB）分子生物學(xué)檢查納入結(jié)核病病原學(xué)診斷范圍[2]。熔解曲線法是一種將基因擴(kuò)增與耐藥基因突變分析融為一體的實時熒光PCR 分子生物學(xué)檢測技術(shù)，與傳統(tǒng)液體藥敏試驗相比，該方法可直接應(yīng)用于臨床痰樣本MTB 耐藥基因檢測，縮短MTB 耐藥性檢出時間，作為耐藥結(jié)核病快速篩查、診斷的分子輔助檢查技術(shù)，該方法仍然需要大量臨床檢驗數(shù)據(jù)及方法學(xué)比較驗證其準(zhǔn)確性等檢測效能[3-5]。本研究采用熔解曲線法檢測臨床結(jié)核患者涂陽痰樣本MTB 對一線抗結(jié)核藥物鏈霉素（SM）、異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）耐藥基因突變情況，并與陽性痰樣本相應(yīng)培養(yǎng)的MTB 分離株液體表型藥敏試驗結(jié)果進(jìn)行比較，評價熔解曲線法在痰樣本中對耐藥MTB 快速檢測的臨床應(yīng)用價值。

1 實驗材料

1.1 樣本及菌株來源 收集2019 年11 月至2021年1 月浙江省麗水市中醫(yī)院（結(jié)核病定點醫(yī)院）就診的肺結(jié)核患者抗酸染色涂片陽性痰液樣本，通過MGIT 960 全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲取相應(yīng)陽性菌株，并經(jīng)過結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定，共獲得MTB 涂片陽性痰樣本（痰樣本提取核酸前凍存于-80 ℃冰箱）和相應(yīng)結(jié)核分枝桿菌分離株各142 例。

1.2 主要儀器、試劑 美國BD MGIT 960 全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)儀、液體藥敏檢測儀（型號：MGIT 960）；廣東希格生物科技細(xì)菌超聲分散計數(shù)儀（型號：1100c）；廈門致善生物科技公司全自動核酸提取儀（型號：Lab-Aid 824）；上海宏石科技公司全自動PCR 分析系統(tǒng)（型號：SLAN-96S）；美國BD MGIT 960 配套分枝桿菌培養(yǎng)試劑盒（營養(yǎng)添加劑：批號0230862，藥敏試劑盒：批號0364621）；珠海貝索抗酸染色液（冷染法，批號C200401）；杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒（膠體金法，批號GE210301）；廈門致善生物科技核酸提取及MTB 耐藥基因突變檢測試劑盒（鏈霉素：批號20102701，異煙肼：批號20090801，利福平：批號20102601，乙胺丁醇：批號20121801）。

2 方 法

2.1 抗酸染色法 采用萋尼抗酸染色法，挑取痰標(biāo)本膿樣、干酪樣部分0.05～0.1 mL，于玻片中間均勻涂抹1 cm×2 cm 卵圓形痰膜，干燥后固定；復(fù)紅染液染色15 min，沖去染液，脫色液脫色5 min，洗去脫色液，再次脫色至無可視紅色；輕緩沖洗，瀝水，亞甲蘭復(fù)染液復(fù)染30 s；輕緩沖洗，干燥后鏡檢。

2.2 BACTEC MGIT 960 液體培養(yǎng)及鑒定 將合格痰樣本加入樣本處理液（將6%NaOH 100 mL 和2.9%檸檬酸鈉溶液100 mL 混勻后加入1.0 g N-乙酰-L-半胱氨酸），液化處理15 min，離心后棄上清，1.5 mL PBS 重懸，取500 μL 加入已添加MTB 營養(yǎng)添加劑的MGIT 培養(yǎng)管，混勻后放入MGIT 960 分枝桿菌自動培養(yǎng)系統(tǒng)，待儀器報陽，取培養(yǎng)菌液涂片，萋-尼抗酸染色法確認(rèn)為抗酸分枝桿菌，經(jīng)結(jié)核分枝桿菌MTB64 抗原法檢測，確認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。

2.3 液體藥敏試驗 按說明書加4 mL 蒸餾水復(fù)溶藥液（鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇）；用無菌吸管吸取新鮮結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)菌液約1 mL，轉(zhuǎn)移到無菌試管中，采用細(xì)菌超聲分散濁度儀分散混勻，并用生理鹽水調(diào)整至0.5 麥?zhǔn)蠞岫裙ぷ骶海幌驅(qū)φ展堋⑺幟艄芨骷尤?.8 mL 營養(yǎng)添加劑，對照管中加0.5 mL 1∶100 稀釋后的工作菌液，向每個已配制含藥SM 1.0 μg/mL、INH 0.1 μg/mL、RFP 1.0 μg/mL、EMB 5.0 μg/mL 培養(yǎng)管中加0.5 mL 工作菌液，混勻后放入全自動培養(yǎng)儀，進(jìn)行液體比例法藥敏試驗，藥敏結(jié)果以儀器報告為準(zhǔn)。

2.4 痰樣本核酸提取 取合格MTB 痰樣本1 mL 加入等量樣本處理液（NaOH-N-乙酰-L-半胱氨酸），充分混勻液化處理15 min，3000 g 離心15 min，棄上清，加200 μL MTB 核酸提取液，99 ℃金屬浴20 min，轉(zhuǎn)入Lab-Aid824 自動磁珠法核酸提取試劑盒提取核酸。

2.5 熒光PCR 熔解曲線法 采用熒光探針PCR 熔解曲線法進(jìn)行MTB 耐藥基因突變檢測，提取核酸瞬間離心后，取5 μL 核酸上清液作PCR 模板，加入配制好的20 μL PCR 反應(yīng)液的反應(yīng)管，放入全自動PCR 熔解曲線分析儀，按照相應(yīng)藥物預(yù)設(shè)程序（UNG處理-預(yù)變性-Touchdown 循環(huán)-PCR 循環(huán)-熔解曲線分析）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)同時進(jìn)行熔解曲線分析，儀器根據(jù)熔點（TM 值）自動判讀試驗樣本對相應(yīng)藥物耐藥性。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩種方法結(jié)果比較采用χ2檢驗。以液體藥敏試驗為金標(biāo)準(zhǔn)，計算熔解曲線法結(jié)果的靈敏度、特異度、符合率[靈敏度=真耐藥例數(shù)/（真耐藥例數(shù)+假敏感例數(shù)）；特異度=真敏感例數(shù)/（真敏感例數(shù)+假耐藥例數(shù)）；符合率=（真耐藥例數(shù)+真敏感例數(shù)）/（真耐藥例數(shù)+假敏感例數(shù)+假耐藥例數(shù)+真敏感例數(shù)）；陽性預(yù)測值=真耐藥例數(shù)/（真耐藥例數(shù)+假耐藥例數(shù)）；陰性預(yù)測值=真敏感例數(shù)/（真敏感例數(shù)+假敏感例數(shù)）]，評價該方法檢測MTB 耐藥性臨床應(yīng)用價值。采用Kappa 值對兩種方法進(jìn)行一致性檢驗，若Kappa值≥0.60 提示兩者具有較好一致性。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 抗酸染色及分枝桿菌分離培養(yǎng)及鑒定 采用萋-尼染色法抗酸染色陽性痰樣本，經(jīng)MGIT 960 液體培養(yǎng)分離分枝桿菌陽性菌株，通過結(jié)核分枝桿菌MTB 64 蛋白抗原法檢測陽性，確定為MTB，得到142 例MTB 陽性痰樣本及相應(yīng)MTB 臨床分離株。

3.2 藥敏試驗結(jié)果 將收集的142 例涂片陽性痰樣本MTB 核酸采用熒光PCR 熔解曲線法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測，結(jié)果顯示，鏈霉素耐藥20 例，異煙肼耐藥18 例，利福平耐藥15 例，乙胺丁醇耐藥5例；同時將與涂陽痰樣本相對應(yīng)培養(yǎng)的142 例MTB菌株，經(jīng)液體表型藥敏試驗檢測，結(jié)果顯示，鏈霉素耐藥14 例，異煙肼耐藥20 例，利福平耐藥12 例，乙胺丁醇耐藥7 例。見表1。

3.3 方法學(xué)比較 以液體藥敏試驗結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對熔解曲線法檢測MTB 樣本耐藥性效能進(jìn)行分析，熔解曲線法檢測SM 靈敏度78.57%，特異度92.97%，符合率91.55%；檢測INH 靈敏度為70.00%，特異度96.72%，符合率92.96%；檢測RFP靈敏度100.00%，特異度97.69%，符合率97.89%；檢測EMB 靈敏度為71.43%，特異度100.00%，符合率98.59%；表明熔解曲線法四種MTB 耐藥檢測試劑盒靈敏度、特異度較高，熔解曲線法與液體藥敏檢測結(jié)果一致性較好，熔解曲線法對MTB 耐藥性檢測具有較好性能。見表2。

4 討論

熔解曲線法是一種快速熒光探針PCR 檢測技術(shù)。該法PCR 熒光探針設(shè)計可以進(jìn)行SM、INH、RFP、EMB 等抗結(jié)核藥物相關(guān)位點（rpsL、rrs、ahpC、inhA、katG、rpoB、embB）的耐藥基因突變檢測[6-8]；對一、二線抗結(jié)核藥物耐藥突變檢測的靈敏度、特異度和符合率均具有良好的檢驗效能[9-11]。

本研究結(jié)果顯示，熔解曲線法對SM 靈敏度78.57%，特異度92.97%，與鄒遠(yuǎn)嫵等[9]的研究結(jié)果（84.84%和93.18%）較一致。檢測INH 靈敏度為70.00%，特異度96.72%。靈敏度低于以往研究結(jié)果，主要原因可能有兩方面，一是納入檢測的INH 耐藥樣本數(shù)較少等原因引起，另外由于INH 耐藥與多基因位點突變相關(guān)，熔解曲線法檢測位點覆蓋不全造成。檢測RFP 靈敏度100.00%，特異度97.69%。這與劉立賓等[12]的研究結(jié)果（94.44%和96.21%）較一致。檢測EMB 靈敏度71.43%，特異度100.00%。EMB 靈敏度檢測較低，主要原因可能是熔解曲線法覆蓋embB 基因306、378、406、497 位點突變檢測，而無法檢測embA，embC、embR 等其他基因的突變。兩種檢驗方法對SM、INH、RFP、EMB 耐藥檢測的靈敏度和特異度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

研究中，熔解曲線法對142 例臨床結(jié)核涂陽痰樣本MTB 耐藥檢測，其中SM 耐藥20 例，假陽性9例，其中5 例存在雙峰現(xiàn)象，經(jīng)分析可能一部分是由于MTB 不均一性耐藥導(dǎo)致，另一部分原因可能是部分雜合峰樣本被判讀為陽性，需要復(fù)檢或結(jié)合表型藥敏試驗判斷最終結(jié)果；SM 敏感122 例，假陰性3例，分析可能由于熔解曲線法僅檢測MTB 由rpsL 基因43 位88 位密碼子以及rrs 基因513～517 位點突變引起的耐藥，而由其他基因突變或其他SM 耐藥機(jī)制引起的耐藥不能檢測導(dǎo)致；INH 耐藥18 例，假陽性4 例，分析可能與熔解曲線法只檢測核酸序列突變，因此，那些不引起氨基酸改變的突變（沉默突變）也會被判為突變型，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果；INH 敏感124 例，假陰性6 例，可能原因是熔解曲線法僅檢測MTB ahpC 啟動子區(qū)（-44～-30 以及-15～3 位點）、inhA 啟動子區(qū)（-17～-8）位點、inhA94 密碼子和katG315 密碼子突變引起耐藥，由其他突變或其他INH 耐藥機(jī)制引起的耐藥不能檢測。RFP 耐藥15例，假陽性3 例，經(jīng)分析考慮可能為沉默突變而未引起相關(guān)生物學(xué)功能變化，RFP 敏感127 例，假陰性0例；EMB 耐藥5 例，假陽性0 例，敏感135 例，假陰性2 例，可能原因是由于試劑盒未能覆蓋EMB 所有耐藥突變位點所致；另外，熔解曲線法假陽性可能由于試劑批次及熔解曲線偏峰、干擾峰等引起，假陰性可能與基因耐藥與表型耐藥不符導(dǎo)致，需要對MTB 耐藥機(jī)制進(jìn)一步探索分析。

綜上所述，熔解曲線法在檢測SM、INH、RFP、EMB 等抗結(jié)核藥物的耐藥性方面具有較好的特異性和符合率。與液體藥敏法相比，該方法能在短時間內(nèi)完成涂陽痰樣本MTB 耐藥性初步篩查，可為臨床提供耐藥結(jié)核病輔助診斷價值。由于檢測突變位點覆蓋率不全及陽性樣本數(shù)少等局限，致使檢驗效能比較可能存在偏倚，今后還需擴(kuò)大樣本數(shù)研究，熔解曲線法聯(lián)合多種耐藥檢測方案有助于進(jìn)一步提高M(jìn)TB耐藥性檢驗效能。