銅依賴性細(xì)胞死亡及銅在乳腺癌治療中的研究現(xiàn)狀

文世超 綜述 王靜萱 審校

銅是一種重要的金屬元素,參與多種生物過程,包括線粒體呼吸和抗氧化等,銅離子動(dòng)態(tài)平衡紊亂會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激[1],引起相關(guān)細(xì)胞損傷而誘發(fā)某些疾病,如威爾遜病(Wilson′s disease)[2]?！般~死亡(Cuprotosis)”是2022年由Tsvetkov等[3]首次提出的一種銅依賴的、新型細(xì)胞死亡方式,研究表明,銅死亡參與多種腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移,包括乳腺癌和宮頸癌等,而且與惡性腫瘤的治療密切相關(guān)。目前,乳腺癌已位于全球女性惡性腫瘤之首[4]。研究發(fā)現(xiàn),不平衡的微量元素與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)[5],已證實(shí)乳腺癌患者體內(nèi)的銅水平較高,并且與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本文就銅依賴性細(xì)胞死亡的發(fā)生機(jī)制及銅在乳腺癌治療中的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 銅的分布與代謝過程

銅是人體必不可少的微量元素,僅次于鐵和鋅位于第三位,主要從食物中攝取,在腸道中被吸收,大部分存在于肌肉和骨骼(50%～70%),約20%分布在肝臟,其余存于血液等[6]。成人體內(nèi)約含有100～200 mg銅,進(jìn)入血液中的銅與血清白蛋白結(jié)合,轉(zhuǎn)運(yùn)至人體各器官,存儲(chǔ)于肝臟,最后經(jīng)膽道排泄。銅主要以Cu+和Cu2+兩種形式存在,胞外的Cu2+與二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體1(Devalent mental transporter1,DMT1)結(jié)合,經(jīng)還原酶還原為Cu+,再由跨膜銅轉(zhuǎn)運(yùn)體1(Copper transporter1,CTR1)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[6-7]。CTR1是負(fù)責(zé)飲食銅攝取到腸上皮的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體,由腸道吸收的Cu+通過銅伴侶蛋白抗氧化物1(Antioxidant 1 copper chaperone,ATOX1)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體內(nèi),結(jié)合銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶α(Copper-transporting ATPase alpha,ATP7A)后泵入門靜脈循環(huán),儲(chǔ)存于肝臟。因此當(dāng)銅缺乏時(shí),ATP7A將發(fā)揮作用。另一種銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶β(Copper-transporting ATPase beta,ATP7B)作用于銅,使其裝載到銅藍(lán)蛋白上。銅藍(lán)蛋白是血漿中分泌的銅氧化酶,在調(diào)節(jié)銅在機(jī)體的分布、合成含銅的酶蛋白等方面至關(guān)重要[8]。ATP7B可以防止銅過量,將多余的銅轉(zhuǎn)運(yùn)至膽汁,然后通過糞便排出或在消化道重吸收[9]。

2 銅依賴性細(xì)胞死亡的發(fā)生機(jī)制

細(xì)胞死亡分為意外性細(xì)胞死亡(Accidental cell death,ACD)和調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡(Regulated cell death,RCD),其中RCD包括細(xì)胞凋亡、焦亡、壞死性凋亡、自噬和鐵死亡[10]等。不同于之前的RCD形式,Tsvetkov等[3]提出“銅死亡”是一種依賴于細(xì)胞內(nèi)銅的聚集,新型的細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞內(nèi)的銅與線粒體三羧酸(Tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)中的酯?；牡鞍踪|(zhì)結(jié)合,經(jīng)酯?；牡鞍踪|(zhì)聚集后鐵硫簇蛋白丟失,使蛋白質(zhì)發(fā)生毒性應(yīng)激最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。銅離子載體是一種可以與銅結(jié)合的小分子,先前發(fā)現(xiàn)的伊利司莫通過與Cu2+結(jié)合形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Cu2+在鐵氧化還原蛋白1(Ferredoxin 1,FDX1)的作用下還原為具有毒性的Cu+,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11-12]。Tsvetkov團(tuán)隊(duì)[3]發(fā)現(xiàn)伊利司莫單獨(dú)應(yīng)用或者加入其他金屬均不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng),然而當(dāng)銅離子加入時(shí),胞內(nèi)銅的積累,會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制,這說明銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要為銅依賴性細(xì)胞死亡。

研究者們發(fā)現(xiàn)與依賴糖酵解的細(xì)胞相比,依賴線粒體呼吸的細(xì)胞對(duì)銅離子載體的敏感度是前者的1 000倍左右,缺氧條件也能使銅死亡減輕,此外,采用抑制線粒體功能藥物后,細(xì)胞對(duì)銅離子載體的敏感性的影響非常明顯,這說明銅死亡主要依靠于線粒體的呼吸,同時(shí)線粒體解偶聯(lián)劑的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)對(duì)銅毒性無顯著影響,這證實(shí)銅死亡并非依賴三磷酸腺苷的產(chǎn)生。

通過對(duì)全基因組CRISPR-Cas9功能喪失篩選,研究者們瞄準(zhǔn)了銅誘導(dǎo)死亡的關(guān)鍵基因FDX1[13],其被伊利司莫直接靶向,將Cu2+還原為Cu+,其他銅死亡相關(guān)基因,包括硫辛酸合成酶(Lipoic acid synthetase,LIAS)、酯酰轉(zhuǎn)移酶(Lipoyltransferase,LIPT1)、二氫硫辛酰轉(zhuǎn)乙?；?Dihydrolipoamide S-acetyltransferase,DLAT)等[14]。對(duì)FDX1、LIAS進(jìn)行基因敲除后可以增加對(duì)銅死亡的抵抗力,進(jìn)一步說明FDX1、蛋白質(zhì)酯酰化與銅死亡之間的關(guān)系。同樣,在糖酵解的環(huán)境下,大多數(shù)銅離子載體喪失殺傷功能,再次證實(shí)這個(gè)過程依賴于線粒體的代謝。蛋白質(zhì)酯?；且环N高度保守的賴氨酸翻譯后修飾[15],僅發(fā)生在四種酶且都參與調(diào)節(jié)碳開啟TCA循環(huán)的入口的代謝復(fù)合物,這些蛋白質(zhì)的酯酰化促成了酶促反應(yīng)。研究者發(fā)現(xiàn)通過敲除FDX1或酯酰化相關(guān)酶可以阻止銅死亡[16]。為了證實(shí),Tsvetkov等[3]先通過數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)FDX1和硫辛酸通路的成分與細(xì)胞活力高度相關(guān)。然后對(duì)208例腫瘤標(biāo)本進(jìn)行FDX1和硫辛酸的免疫組化染色,驗(yàn)證了FDX1與酯化蛋白表達(dá)相關(guān),且FDX1敲除會(huì)導(dǎo)致完全喪失蛋白質(zhì)酯?；?同時(shí)細(xì)胞呼吸也顯著下降,因此證實(shí)FDX1是蛋白質(zhì)酯酰化上游調(diào)控因子并參與銅死亡。另一方面,研究發(fā)現(xiàn)銅與酯酰化的蛋白質(zhì)直接結(jié)合導(dǎo)致DLAT的酯?；蕾囆怨丫刍?使鐵-硫簇蛋白丟失誘導(dǎo)蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。

此前,沒有明確的數(shù)據(jù)指明銅死亡對(duì)三陰性乳腺癌存在影響,Sha等[17]發(fā)表的關(guān)于銅死亡相關(guān)基因(Cuproptosis-related genes,CRGs)在三陰性乳腺癌預(yù)后中的研究,包含16個(gè)CRGs,通過記錄CRGs在乳腺癌中的拷貝變異數(shù)(Copy number variation,CNV)和體細(xì)胞突變的發(fā)生率分析,證實(shí)了CRGs的失衡在對(duì)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中有重要作用。通過風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)中位數(shù)將患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組,低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存時(shí)間更長(zhǎng),預(yù)后更好,而高風(fēng)險(xiǎn)組的患者更容易發(fā)生免疫抑制。CRGs對(duì)三陰性乳腺癌的預(yù)后存在預(yù)測(cè)作用,因此,銅死亡在乳腺癌治療中的研究值得深入探索。

3 銅在乳腺癌治療中的研究現(xiàn)狀

3.1 銅配合物在乳腺癌治療中的研究

目前,臨床中乳腺癌的治療主要以手術(shù)、化療、放療、靶向和免疫治療等為主[18],但傳統(tǒng)的治療常會(huì)產(chǎn)生耐藥,因此正在探索新興的治療手段。銅參與腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移[19],許多研究發(fā)現(xiàn),腫瘤患者體內(nèi)的銅水平高于健康人群[20],包括乳腺癌、宮頸癌和口腔癌等。因此銅被認(rèn)為是一種新的抗腫瘤治療靶點(diǎn),20世紀(jì)60年代,銅配合物的抗腫瘤活性第一次被Booth團(tuán)隊(duì)提出[21]。

銅配合物目前主要有銅絡(luò)合劑和銅離子載體兩種類型[22]。前者是與銅離子結(jié)合,降低其生物利用度,減少腫瘤細(xì)胞中銅離子的含量發(fā)揮抗腫瘤作用[23]。美國(guó)安德森癌癥中心使用銅絡(luò)合劑聯(lián)合卡鉑治療卡鉑耐藥的卵巢癌患者,證實(shí)銅絡(luò)合劑可能是克服鉑耐藥的關(guān)鍵[24]。而后者銅離子載體則將銅轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi),增加胞內(nèi)銅離子水平,產(chǎn)生活性氧,激活氧化應(yīng)激,引起相關(guān)細(xì)胞的損傷,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[25]。來自美國(guó)杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)雙硫侖(Disulfiram,DSF)作為銅離子載體誘導(dǎo)銅發(fā)生氧化應(yīng)激,介導(dǎo)炎性乳腺癌發(fā)揮抗腫瘤作用[26]。雙硫侖是一種酒精戒斷藥物,作為氧化還原調(diào)節(jié)劑,它與Cu2+結(jié)合形成雙硫侖-銅復(fù)合物(DSF-Cu)[27],使胞內(nèi)銅離子含量增加,DSF-Cu能拮抗NF-kB信號(hào)[28]、醛脫氫酶活性和抗氧化水平,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,使多種乳腺癌細(xì)胞凋亡,因此,DSF可以顯著抑制乳腺癌生長(zhǎng),可能是乳腺癌治療的新思路。

3.2 銅依賴蛋白在乳腺癌治療中的研究

在最近的一項(xiàng)Meta分析中,Feng的團(tuán)隊(duì)納入36項(xiàng)研究共5 747例患者,其中2 369例乳腺癌患者,其余為良性乳腺疾病組和健康對(duì)照組,通過監(jiān)測(cè)血清銅水平,得出乳腺癌組血清銅水平明顯高于其他兩組(P<0.001)[29],一部分因?yàn)殂~是腫瘤細(xì)胞增殖的細(xì)胞啟動(dòng)子,另一原因是在乳腺癌組織中,銅依賴蛋白的表達(dá)上調(diào)。銅依賴蛋白已被證明可以刺激血管生成及腫瘤的轉(zhuǎn)移,包括細(xì)胞運(yùn)動(dòng)介質(zhì)1(Mediator of ErbB2-driven cell motility 1,MEMO1)[30]、溶質(zhì)載體家族3成員1(Solute carrier family 3 member 1,SLC31A1)[31]、ATOX1[32]和賴氨酰氧化酶2(Lysyl oxidase like 2,LOXL2)[33]。

Karginova等[34]研究發(fā)現(xiàn)銅和一些銅依賴性蛋白是新興治療靶點(diǎn)。DCAC50是一種胞內(nèi)銅伴侶蛋白的小分子抑制劑,可以減少腫瘤細(xì)胞增殖并提高氧化應(yīng)激,從而使三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡。DCAC50抑制ATOX1活性與破壞銅穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)銅水平升高[32]。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在異種移植的小鼠模型中,DCAC50可以減緩腫瘤的生長(zhǎng)速度同時(shí)抑制血管生成;在體外可以阻止內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的形成,其與紫杉醇的聯(lián)用可以增強(qiáng)三陰性乳腺癌的細(xì)胞毒性,同時(shí)可減少兩種藥物使用劑量,因此抑制胞內(nèi)銅的轉(zhuǎn)運(yùn)是治療乳腺癌的潛在療法。

3.3 其他銅相關(guān)因素在乳腺癌中的研究

銅穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因(FOXO1)促進(jìn)含銅蛋白的表達(dá),在維持銅平衡中發(fā)揮重要作用,同時(shí)FOXO1與腫瘤發(fā)生有關(guān),包括乳腺癌和卵巢癌[35]等。Zeng等[36]研究發(fā)現(xiàn)FOXO1在乳腺癌中顯著下調(diào),并且FOXO1高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后良好,此外還發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平可能影響免疫治療的反應(yīng),因此可將FOXO1作為乳腺癌患者治療的新方向。

此外,銅介導(dǎo)的腫瘤局部光療法在乳腺癌治療也初步得到證實(shí)[37]。在小鼠試驗(yàn)中,Shrestha等[38]發(fā)現(xiàn),新型光敏劑銅半胱胺納米粒子激活后可使小鼠的乳腺癌腫瘤組織明顯減小,盡管目前暫時(shí)無相關(guān)的人體試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐,但可以預(yù)期的是光療可作為乳腺癌的一種治療。除以上之外,銅介導(dǎo)的其他療法的研究也正在進(jìn)行中,如化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法(Chemodynamic therapy,CDT)[39]和聯(lián)合免疫治療[40]等。

4 小結(jié)與展望

銅參與線粒體呼吸、鐵吸收等重要的細(xì)胞代謝,維持銅的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)機(jī)體的健康至關(guān)重要,銅動(dòng)態(tài)平衡紊亂可誘發(fā)多種疾病,包括心血管疾病和惡性腫瘤等。銅死亡作為一種新型細(xì)胞死亡方式,依賴于細(xì)胞內(nèi)銅聚集,通過銅與線粒體TCA循環(huán)中酯?；牡鞍踪|(zhì)結(jié)合后聚集,鐵硫簇蛋白丟失,蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究表明,銅死亡與乳腺癌和宮頸癌等惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān),同時(shí)作為一種新興的抗腫瘤治療靶點(diǎn),銅死亡在乳腺癌的治療應(yīng)用中也有所突破。盡管目前尚未在臨床中廣泛應(yīng)用,但銅絡(luò)合劑、銅離子載體、銅伴侶蛋白抑制劑及銅相關(guān)聯(lián)合方案等已經(jīng)在乳腺癌的治療中展開研究。未來,我們可以通過進(jìn)一步對(duì)銅死亡在乳腺癌中作用機(jī)制的研究,研發(fā)靶向銅死亡的乳腺癌治療新藥物,通過不同的機(jī)制達(dá)到抗腫瘤目的。