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    健脾益腎方對(duì)痛風(fēng)性腎損害患者尿液微RNA表達(dá)變化的研究

    2023-08-14 10:16:34陳堅(jiān)翱羅恒胡艷艷徐紅
    中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2023年22期
    關(guān)鍵詞:腎方痛風(fēng)性高尿酸

    陳堅(jiān)翱,羅恒,胡艷艷,徐紅

    健脾益腎方對(duì)痛風(fēng)性腎損害患者尿液微RNA表達(dá)變化的研究

    陳堅(jiān)翱1,羅恒2,胡艷艷1,徐紅1

    1.杭州市中醫(yī)院科教部,浙江杭州 310007;2.杭州市富陽(yáng)區(qū)中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,浙江杭州 311400

    分析健脾益腎方干預(yù)前后痛風(fēng)性腎損害患者尿液微RNA(microRNA,miRNA)的表達(dá)變化。通過高通量測(cè)序法檢測(cè)早期痛風(fēng)性腎損害患者干預(yù)前后尿液外泌體源性miRNA的表達(dá)譜,并比較表達(dá)變化情況。早期痛風(fēng)性腎損害患者與正常人群的尿液外泌體源性miRNA有明顯差異;早期痛風(fēng)性腎損害患者健脾益腎方中藥干預(yù)后,19個(gè)可作為生物標(biāo)記物的miRNA中有5個(gè)平均表達(dá)值上調(diào),14個(gè)平均表達(dá)值下調(diào)。健脾益腎方對(duì)痛風(fēng)性腎損害患者的miRNA表達(dá)有一定調(diào)節(jié)作用,差異表達(dá)的miRNA可能參與腎損害的發(fā)生發(fā)展。

    痛風(fēng)性腎損害;微RNA;健脾益腎方

    痛風(fēng)性腎病是由血尿酸產(chǎn)生過多和(或)排泄減少形成高尿酸血癥所致的腎損害。隨著我國(guó)居民生活水平的提高,痛風(fēng)性腎病發(fā)病率呈上升趨勢(shì),我國(guó)的痛風(fēng)患病率為0.34%~2.84%,臨床上5%~15%的高尿酸血癥患者發(fā)展為痛風(fēng)[1]。而沿海地區(qū)由于飲食等因素,痛風(fēng)及高尿酸血癥的發(fā)病率相對(duì)更高一些。目前高尿酸血癥的干預(yù)率低,痛風(fēng)缺乏規(guī)范性治療,約1/3的痛風(fēng)患者可出現(xiàn)腎臟病變并最終進(jìn)展為終末期腎病[2]。以腎臟功能為焦點(diǎn)的健康管理已逐漸進(jìn)入大眾視野,引起社會(huì)廣泛關(guān)注,未病先防、已病防傳、既病防變、瘥后防復(fù)的中醫(yī)“治未病”思想儼然成為早期防治的重要組成部分。早期診斷痛風(fēng)性腎病對(duì)保護(hù)腎功能、改善預(yù)后有重要意義。微RNA(microRNA,miRNA)是長(zhǎng)度為18~25個(gè)核苷酸的非編碼RNA,通過轉(zhuǎn)錄后與信使RNA的特定位點(diǎn)結(jié)合來調(diào)控靶基因的表達(dá)。研究顯示,差異表達(dá)的miRNA可通過炎癥反應(yīng)、腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、腎臟血管再生及修復(fù)和氧化應(yīng)激等途徑影響腎損傷的進(jìn)展[3-6]。尿液外泌體中的miRNA比尿液細(xì)胞中的更加穩(wěn)定,包含來自腎小球、腎小管、膀胱等泌尿系統(tǒng)細(xì)胞的生物學(xué)信息,且提取方便[7-8]。通過前期實(shí)驗(yàn)研究,課題組篩選出19個(gè)在早期痛風(fēng)性腎損害患者中表達(dá)差異的miRNA。基于此,本研究擬探討中藥干預(yù)前后痛風(fēng)性腎損害患者上述miRNA的變化情況。

    1 資料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    選取2016年7月至2018年3月就診于杭州市中醫(yī)院的早期痛風(fēng)性腎損害患者5例。納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡18~65歲;②符合《內(nèi)科學(xué)》[1]中痛風(fēng)及痛風(fēng)性腎病的診斷標(biāo)準(zhǔn);③104μmol/L<血肌酐<200μmol/L;④中醫(yī)辨證符合脾腎兩虛證。排除標(biāo)準(zhǔn):①有導(dǎo)致高尿酸血癥的繼發(fā)性疾??;②服用降脂、布美他尼等藥物引起的血尿酸增高者;③患有嚴(yán)重心、腦、肺、血液系統(tǒng)疾病及其他可能導(dǎo)致腎功能不全等疾病者;④近3個(gè)月有生育計(jì)劃者,妊娠期或哺乳期女性;⑤患有精神疾病者;⑥既往對(duì)中藥過敏者,或不能耐受口服中藥者;⑦正在參與其他臨床研究者;⑧研究人員認(rèn)為不適合參加的其他情況。另選取體檢中心的健康人群5名。所有研究對(duì)象均自愿參與并簽署知情同意書,本研究經(jīng)杭州市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):2016KY048)。

    1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

    乙酸、乙醇、異丙醇、氯仿購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司,糖原、TRIzol LS試劑購(gòu)自Invitrogent Corporation,DEPC水購(gòu)自Sigma Corporation,苯甲基磺酰氟、亮抑酶肽、二硫基蘇糖醇購(gòu)自Biosharp Corporation,磷酸鹽緩沖液購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。生物分析儀、測(cè)序儀、快速SR富集試劑盒、快速SBS試劑盒購(gòu)自Illumina Corporation,PCR試劑盒購(gòu)自Qiagen Corporation。–20℃低溫冰箱、–80℃超低溫冰箱、制冰機(jī)、電子天平、超凈工作臺(tái)、超速離心瓶、超速離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、量程移液槍及槍頭、EP管、全波長(zhǎng)紫外/可見光掃描分光光度計(jì)、恒溫水浴箱。

    1.3 藥物準(zhǔn)備

    健脾益腎方組成:黃芪15g,土茯苓30g,桑寄生15g,淫羊藿10g,丹參15g,秦艽10g,豨薟草10g,女貞子15g,當(dāng)歸12g。水煎取藥汁200ml,每日1劑,分2次服用。

    1.4 研究方法

    分別收集所有研究對(duì)象入組時(shí)及早期痛風(fēng)性腎損害患者中藥干預(yù)3個(gè)月后的中段尿,差速離心法收集尿液中的外泌體,TRIzol法提取總RNA。將提取的RNA使用高通量測(cè)序檢測(cè)miRNA表達(dá)譜,比對(duì)19個(gè)可作為生物標(biāo)記物的miRNA在早期痛風(fēng)性腎損害中藥干預(yù)前后的表達(dá)變化。

    1.4.1 尿液收集 尿液收集前一日22時(shí)后停止進(jìn)食、飲水,留取次日清晨第一次小便的中段尿液。使用2個(gè)100ml無菌離心管收集尿液,每管70ml,編號(hào)后置于低溫環(huán)境待測(cè)。

    1.4.2 尿液外泌體分離 將42μl 0.001mol/L的亮抑酶肽和350μl 0.1mol/L的苯甲基磺酰氟滴入裝有70ml尿液樣本的離心管中,緩緩搖勻;4℃ 17 000×g的轉(zhuǎn)速下離心0.5h;收集上清液,4℃ 200 000×g的轉(zhuǎn)速下離心1h;去除上清液,留取管底沉淀物,加入56μl 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液后搖勻,加入已編好序號(hào)的EP管,最后滴入56μl 60mg/ml的二硫基蘇糖醇緩沖液;EP管浸入60℃恒溫水箱中加熱10min;–80℃冰箱保存,以備后續(xù)操作使用。

    1.4.3 樣本總RNA的提取、質(zhì)控 使用TRIzol法提取外泌體中的總RNA,用NanoDrop?ND-1000測(cè)定樣本總RNA濃度和純度。

    1.4.4 制備miRNA測(cè)序文庫(kù) 在每個(gè)樣本總RNA的5’及3’端加入RNA接頭,運(yùn)用Illumina RT引物和擴(kuò)增引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增,合成cDNA,再用PCR擴(kuò)增。再?gòu)腜AGE膠上選出135~155bp的PCR擴(kuò)增片段,同時(shí)用QIAquick PCR Purification Kit進(jìn)行純化。最后運(yùn)用Agilent 2100 Bioanalyzer定量文庫(kù)。將樣本滴定到最后的濃度8pmol/L,再用TruSeq Rapid SR cluster Kit(GD-402-4001)在Illumina cBot上進(jìn)行簇生成。

    1.4.5 上機(jī)測(cè)序 運(yùn)用TruSeq Rapid SBS Kit(FC-402-4002),在Illumina NextSeq 500測(cè)序儀上開展50個(gè)周期的測(cè)序。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    運(yùn)用STEM軟件統(tǒng)計(jì)分析miRNA的表達(dá)趨勢(shì)。以正常人群miRNA的平均表達(dá)值為基準(zhǔn),經(jīng)STEM軟件轉(zhuǎn)換為0,將中藥干預(yù)前、后的平均表達(dá)值進(jìn)行比較,判斷表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)。

    2 結(jié)果

    2.1 樣本總RNA和文庫(kù)質(zhì)檢結(jié)果

    2.1.1 總RNA濃度和純度檢測(cè)結(jié)果 用NanoDrop?ND-1000檢測(cè)尿液外泌體總RNA的OD值,結(jié)果顯示OD260/OD280為1.33~1.68,OD260/OD230為0.69~1.61。說明RNA純度可,雜質(zhì)含量較少,經(jīng)上機(jī)前檢驗(yàn),各項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)均基本滿足后續(xù)miRNA測(cè)序?qū)嶒?yàn)要求。

    2.1.2 測(cè)序文庫(kù)質(zhì)控結(jié)果 利用Agilent 2100 Bioanalyzer,使用Agilent DNA 1000 chip kit測(cè)定測(cè)序文庫(kù)質(zhì)量,文庫(kù)長(zhǎng)度為142~146bp。

    2.1.3 miRNA數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估 將樣本中的片段去接頭后,長(zhǎng)度在16~30nt的片段主要集中在22nt左右,說明后續(xù)miRNA測(cè)序結(jié)果質(zhì)量可靠。

    2.2 miRNA的時(shí)間序列基因表達(dá)趨勢(shì)

    運(yùn)用STEM軟件分析發(fā)現(xiàn),早期痛風(fēng)性腎損害患者與正常人群的尿液外泌體源性miRNA有明顯差異;早期痛風(fēng)性腎損害患者中藥干預(yù)后19個(gè)可作為生物標(biāo)記物的miRNA中平均表達(dá)值上調(diào)5個(gè),平均表達(dá)值下調(diào)14個(gè),見表1。

    3 討論

    痛風(fēng)性腎病的損害是多方面的,一旦出現(xiàn)嚴(yán)重的腎損害,會(huì)給患者、家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。祖國(guó)醫(yī)學(xué)未曾有“痛風(fēng)性腎病”的病名記載,現(xiàn)根據(jù)其主要臨床表現(xiàn)可歸屬為尿濁、石淋、腎水等范疇?!吨T病源候論·石淋候》記載“石淋者,淋而出石也”。故尿酸性結(jié)石及血尿者可歸為石淋、血淋;若有蛋白尿者,可歸于尿濁、膏淋;出現(xiàn)腎功能不全者,可歸為水腫、腎水等。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,患者稟賦不足、脾腎虧虛是疾病發(fā)生的內(nèi)因,感受六淫邪氣、飲食不節(jié)是疾病發(fā)生的外因[9-12]。故本病的病機(jī)多屬脾腎虧虛,夾濕、夾瘀阻滯經(jīng)絡(luò)所致。

    痛風(fēng)性腎病是痛風(fēng)發(fā)展到后期出現(xiàn)的病癥,其中醫(yī)辨證雖與痹證有相似之處,但亦有不同。黃勇等[13]認(rèn)為在高尿酸血癥時(shí)即可祛除濕、痰、瘀,調(diào)節(jié)氣血陰陽(yáng),阻斷疾病進(jìn)展,為“治未病”范疇,正如《丹溪心法》所云“與其救療于有疾之后,不若攝養(yǎng)于無疾之先”。若發(fā)展至腎臟損害時(shí),根據(jù)四診辨證分型,各中醫(yī)學(xué)者觀點(diǎn)又有所不同。劉旭生將痛風(fēng)性腎病分為急性期、好轉(zhuǎn)期、緩解期,分別使用桃紅四物湯合四妙湯加減、濟(jì)生腎氣丸合參苓白術(shù)散加減、溫脾湯合真武湯加減予以治療[14]。丁穎迪[15]在結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上將痛風(fēng)性腎病分為脾腎虛衰、濕毒內(nèi)滯,氣陰兩虛、水濕內(nèi)停,濕熱痹阻、瘀血內(nèi)停等證。以上諸證在臨床診治中可單獨(dú)出現(xiàn),也可相互夾雜。

    本研究的健脾益腎方由經(jīng)驗(yàn)方“芪苓顆粒/尿酸利仙方”化裁而來。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)“芪苓顆粒/尿酸利仙方”可有效治療高尿酸血癥、痛風(fēng)、痛風(fēng)性腎病等,療效確切[16-19]。本方證因脾腎兩虛日久,濕瘀互結(jié)于腎,以致腎失封藏,精微物質(zhì)外泄。本病多屬邪實(shí)正虛,邪實(shí)宜攻,正虛宜補(bǔ),故當(dāng)健脾祛濕、益腎化瘀。方中以黃芪益氣健脾,脾健則水濕得化。土茯苓、豨薟草利水滲濕,使?jié)裥巴獬鲇新贰I<纳?、女貞子、淫羊藿補(bǔ)益腎臟,腎元充則精微藏。丹參、當(dāng)歸活血化瘀,佐以秦艽化濕通絡(luò),使?jié)耩鲩_解。諸藥合用,既能健脾益腎,又可清熱利濕、化瘀泄?jié)幔拐龤獾脧?fù),邪氣自去。

    本研究發(fā)現(xiàn),與干預(yù)前比較,中藥干預(yù)后19個(gè)可作為生物標(biāo)記物的miRNA有5個(gè)平均表達(dá)值上調(diào)(hsa-miR-5100、hsa-miR-4454、hsa-miR-4286、hsa-miR-1260a、hsa-miR-1260b),其余14個(gè)均下調(diào)。miRNA是基因表達(dá)負(fù)調(diào)控因子,最早在秀麗隱桿線蟲的lin-4和let-7中發(fā)現(xiàn),可通過靶向結(jié)合信使RNA的特定位點(diǎn)調(diào)控靶基因的表達(dá)。每個(gè)miRNA可有幾十甚至幾百個(gè)靶基因,而多個(gè)miRNA也可共同調(diào)節(jié)一個(gè)靶基因,從而在miRNA和靶基因間構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。迄今為止,人類基因組已測(cè)定的miRNA遠(yuǎn)超過2000種。miRNA具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性等特點(diǎn),在不同的物種之間有一定的價(jià)值。miRNA涉及動(dòng)物、植物和真菌等生物的廣泛生物過程,并發(fā)揮重要作用。失調(diào)的miRNA表達(dá)與多種人類疾病相關(guān),其還參與腫瘤、內(nèi)分泌等疾病的發(fā)生發(fā)展[20-21]。

    表1 miRNA的平均表達(dá)值(STEM軟件轉(zhuǎn)換后)

    注:A正常人群,B早期痛風(fēng)性腎損害患者中藥干預(yù)前,C早期痛風(fēng)性腎損害患者中藥干預(yù)后

    運(yùn)用健脾益腎方對(duì)痛風(fēng)性腎損害患者進(jìn)行干預(yù),對(duì)miRNA表達(dá)變化具有一定的調(diào)節(jié)作用,其中表達(dá)上調(diào)的5個(gè)miRNA中,hsa-miR-5100可能與腎損傷的系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān),hsa-miR-1260a可能與狼瘡性腎炎、巴爾干地方性腎病相關(guān),hsa-miR-1260b可能與Ⅳ級(jí)狼瘡性腎炎相關(guān)[22]。但miR-4454、miR-4286的相關(guān)研究較少,特別是在腎臟疾病方面,仍有很大的挖掘潛力,有待深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)的差異性miRNA暫未證實(shí)與痛風(fēng)性腎損害有直接關(guān)聯(lián),有待今后多中心、大樣本研究進(jìn)一步論證。通過生物信息學(xué)挖掘和潛在調(diào)控機(jī)制分析,可為痛風(fēng)性腎損害發(fā)病的機(jī)制研究提供新依據(jù),對(duì)保護(hù)腎功能的臨床治療提供早期預(yù)警標(biāo)識(shí),為中藥療效評(píng)價(jià)及中藥研發(fā)提供新思路。

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    Study on the changes of urinary microRNA expression of Jianpi Yishen decoction in patients with gout renal damage

    CHEN Jian’ao, LUO Heng, HU Yanyan, XU Hong

    1.Department of Science and Education, Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310007, Zhejiang, China; 2.Department of Neurology, Hangzhou Fuyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 311400, Zhejiang, China

    To analyze the changes of microRNA (miRNA) expression in urine of patients with gout renal damage before and after the intervention of Jianpi Yishen decoction.The expression profiles of urine exosome-derived miRNAs were detected by high-throughput sequencing before and after intervention in patients with early gout renal damage, and the expression changes were compared.Urine exosome-derived miRNAs were significantly different between the patients with early gout renal damage and the normal population. After the intervention of Jianpi Yishhen decoction, the expression of 19 miRNAs that could be used as biomarkers were up-regulated in 5 and down-regulated in 14.Jianpi Yishen decoction can regulate the expression of miRNA in patients with gout renal damage to some extent, and differentially expressed miRNA may be involved in the occurrence and development of renal damage.

    Gout renal damage; MicroRNA; Jianpi Yishen decoction

    R589.7

    A

    10.3969/j.issn.1673-9701.2023.22.019

    浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2017C33196)

    陳堅(jiān)翱,電子信箱:280185808@qq.com

    (2022–10–13)

    (2023–07–05)

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