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    微陣列芯片技術(shù)在耐多藥結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用研究

    2023-08-14 10:18:06張國翠王建勞海黎張盟孟慶捷
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2023年22期
    關(guān)鍵詞:結(jié)核結(jié)核病肺結(jié)核

    張國翠,王建,勞海黎,張盟,孟慶捷

    微陣列芯片技術(shù)在耐多藥結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用研究

    張國翠,王建,勞海黎,張盟,孟慶捷

    濱州市中心醫(yī)院檢驗科,山東濱州 251700

    探討微陣列芯片技術(shù)在耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug resistant tuberculosis,MDR-TB)臨床診斷中的應(yīng)用。收集2020年6月至2021年5月經(jīng)濱州市中心醫(yī)院確診的245例住院肺結(jié)核患者的標(biāo)本(痰液標(biāo)本125例和痰培養(yǎng)分離菌株120例)。痰液標(biāo)本同時采用DNA微陣列芯片技術(shù)和傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測其結(jié)核桿菌陽性率。痰液標(biāo)本和分離菌株均采用DNA微陣列芯片技術(shù)進行肺結(jié)核耐多藥檢測和分枝桿菌菌種鑒定。125例痰液標(biāo)本經(jīng)DNA微陣列芯片技術(shù)和痰培養(yǎng)法檢測,陽性率分別為58.4%(73/125)和24.8%(31/125),兩種方法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=14.520,<0.001)。采用DNA微陣列芯片技術(shù)檢測125例痰液標(biāo)本和120例分離菌株,共檢出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群192例,非結(jié)核分枝桿菌7例。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群192例檢出耐藥者41例,其中耐異煙肼15例,耐利福平19例,同時耐兩種藥物7例。非結(jié)核分枝桿菌包括胞內(nèi)分枝桿菌4例,堪薩斯分枝桿菌2例,鳥分枝桿菌1例。DNA微陣列芯片技術(shù)檢測周期短,能同時進行結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測和菌種鑒定,對MDR-TB的早期診斷和治療有較大的臨床應(yīng)用價值。

    肺結(jié)核;非結(jié)核分枝桿菌;耐多藥肺結(jié)核?。划悷熾?;利福平

    世界衛(wèi)生組織報道的全球每年新發(fā)耐多藥結(jié)核病(multidrug resistant tuberculosis,MDR-TB)患者37.8萬例,中國的新發(fā)病例數(shù)約11萬[1-3]。我國結(jié)核病控制的總體形勢仍然嚴(yán)峻,耐藥結(jié)核病尤其是MDR-TB是目前結(jié)核病防治的重點和難點。MDR-TB引起的高發(fā)病率及高病死率在結(jié)核病控制中引起更多的關(guān)注[2-4]。傳統(tǒng)耐多藥檢測方法耗時且敏感度較低,無法滿足臨床需求,本研究利用DNA微陣列芯片技術(shù)快速診斷和鑒別診斷肺結(jié)核及其耐藥情況,為臨床早期診斷治療提供依據(jù),現(xiàn)報道如下。

    1 資料與方法

    1.1 標(biāo)本來源

    收集2020年6月至2021年5月經(jīng)濱州市中心醫(yī)院確診的245例住院肺結(jié)核患者的標(biāo)本(痰液標(biāo)本125例和痰培養(yǎng)分離菌株120例)。納入標(biāo)準(zhǔn):符合《肺結(jié)核診斷 WS 288—2017》中診斷標(biāo)準(zhǔn);有肺結(jié)核典型臨床癥狀;經(jīng)影像學(xué)檢查,肺部有活動性肺結(jié)核病變。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他肺部疾??;精神異?;颊摺<{入患者中男127例,女118例,年齡18~76歲,平均年齡46.9歲。所有患者均簽署知情同意書,本研究經(jīng)濱州市中心醫(yī)院內(nèi)部倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批號:2020005)。

    1.2 試劑和儀器

    晶芯?結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒(DNA微陣列芯片法)和晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)購自博奧生物技術(shù)有限公司。使用儀器有ABI500熒光聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀;晶芯?E-Cycler?96 PCR儀;晶芯?BioMixer?Ⅱ芯片雜交儀;晶芯?SlideWasher?芯片洗干儀;晶芯?LuxScan?10K/B微陣列芯片掃描儀等。

    1.3 方法

    125份合格痰液標(biāo)本取半量(約2.5ml)加入兩倍體積4%NaOH溶液,震蕩15min,取0.1ml液化痰液接種酸性羅氏培養(yǎng)基中,37℃孵育,4周報告結(jié)果,操作按《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[5]要求;剩余半量(約2.5ml)痰液標(biāo)本加入兩倍體積4%NaOH溶液,反復(fù)震蕩后靜置30min,取1ml液化痰液加入1.5ml離心管中,高速離心(14 000轉(zhuǎn)/min)10min,棄上清,加1ml生理鹽水于沉淀中離心(15 000轉(zhuǎn)/min)10min,棄上清,再加50μl核酸提取液于沉淀中,充分震蕩,100℃金屬浴10min,離心(15 000轉(zhuǎn)/min)5min,取其上清作為反應(yīng)模板,然后進行PCR擴增、芯片雜交和掃描判讀。

    120例患者支氣管肺泡灌洗液經(jīng)BACTEC MGIT 960培養(yǎng)報告陽性的分離菌株,用取菌環(huán)直接挑取單個菌落加入80μl核酸提取液中,置100℃金屬浴10min,離心5min,取上清。所得核酸進行PCR擴增、芯片雜交和掃描判讀。結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測和分枝桿菌菌種鑒定實驗嚴(yán)格按《結(jié)核病實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[6]基因芯片法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行。

    1.4 質(zhì)量控制

    每個標(biāo)本進行耐藥檢測時,芯片內(nèi)部設(shè)有內(nèi)部質(zhì)控。一個分枝桿菌屬質(zhì)控,一個結(jié)核分枝桿菌質(zhì)控,2個芯片制備質(zhì)控,2個芯片雜交質(zhì)控,一個空白對照質(zhì)控,一個陰性對照質(zhì)控,以及靶基因ropB、KatG和inhA擴增質(zhì)控。如果其中任何一個質(zhì)控結(jié)果錯誤,則標(biāo)本結(jié)果定位無效,需要進行復(fù)檢;每個標(biāo)本進行實時熒光定量PCR檢測時設(shè)有空白對照質(zhì)控、陰性對照質(zhì)控、陽性對照質(zhì)控、四個濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 兩種方法檢測痰液的結(jié)核桿菌陽性率比較

    125份痰液標(biāo)本采用DNA微陣列芯片技術(shù)和痰培養(yǎng)法檢測,DNA微陣列芯片技術(shù)檢出陽性73例(58.4%),痰培養(yǎng)法檢出陽性31例(24.8%),兩種方法檢出陽性結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=14.520,<0.001)。

    2.2 125例痰液和120例分離菌株的菌種鑒定情況

    采用DNA微陣列芯片技術(shù)檢測125例痰液和120例分離菌株,共檢出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群192例(痰液73例,分離菌株119例),非結(jié)核分枝桿菌7例(痰液6例,分離菌株1例)。7例非結(jié)核分枝桿菌包括胞內(nèi)分枝桿菌4株,堪薩斯分枝桿菌2株,鳥分枝桿菌1株。

    2.3 192例結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐多藥檢測情況

    DNA微陣列芯片技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群192例,檢出野生型151例,耐藥者41例,總耐藥率21.4%;其中,檢出耐異煙肼(isoniazid,INH)單藥者15例(7.8%),耐利福平(rifampicin,RIF)單藥者19例(9.9%);同時耐INH和RIF者7例(3.6%),其基因型分布見表1。

    3 討論

    MDR-TB是指同時對包括INH和RIF兩種或兩種以上抗結(jié)核藥物發(fā)生耐藥的結(jié)核分枝桿菌所致的結(jié)核病。傳統(tǒng)MDR-TB的表型診斷方法主要有絕對濃度法和比例法,上述兩種方法必須在獲得菌株的基礎(chǔ)上進行藥敏試驗,耗時較長且培養(yǎng)的敏感度較低,導(dǎo)致部分患者漏診或不能及時被檢出。DNA微陣列芯片技術(shù)在固相載體上很小面積內(nèi)包被多達千萬個核酸分子,組成微點陣列,在一定條件下載體上的核酸分子可與來自標(biāo)本互補的核酸片段雜交,然后把標(biāo)本中的核酸片段進行標(biāo)記,在專用的芯片閱讀儀上可檢測到雜交信號,敏感度和特異性較高。DNA微陣列芯片技術(shù)操作僅需兩步,即擴增和雜交,可將檢測時間由傳統(tǒng)方法的2~3個月縮短到6h左右,檢測RIF和INH耐藥情況的同時還能完成菌種鑒定分型。

    表1 耐藥結(jié)核桿菌DNA微陣列芯片法檢測結(jié)果

    研究顯示,采用DNA微陣列芯片技術(shù)檢測的INH和RIF總耐藥率為17.81%~27.5%,耐多藥率為6.85%,INH和RIF單耐藥率分別為13.3%、7.5%[1-4]。本研究DNA微陣列芯片技術(shù)共檢測245例患者,結(jié)核分枝桿菌檢出率78.4%,總耐藥率21.4%,INH、RIF耐藥率分別7.8%和9.9%,耐多藥率3.6%。本研究結(jié)果顯示,41例耐藥者基因突變位點前兩位的是katG315(G→C)突變型、rpoB531(C→T)突變型,其突變發(fā)生率分別為36.6%(15/41)和39.0%(16/41),與相關(guān)研究有所差異[7]。

    國內(nèi)報道,臨床分離株藥物作用靶基因發(fā)生突變是結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥的主要分子機制,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)96%耐RIF菌株的rpoB基因中一個81bp區(qū)域出現(xiàn)點突變;耐INH菌株中約70%與katG基因突變有關(guān),20%~35%與inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)突變有關(guān),katG/inhA位點總突變率為35.1%(33/94)[8-10]。

    非結(jié)核分枝桿菌感染有逐年升高趨勢,由1984年的4.2%升至2010年的22.9%[9]。山東省2625株分離菌株檢出36株非結(jié)核分枝桿菌,占1.4%,其中29株為胞內(nèi)分枝桿菌(80.6%)[10]。北京市721株分離菌株檢出非結(jié)核分枝桿菌93株(12.9%),以膿腫分枝桿菌占首位[11]。上海市877株分離菌株P(guān)CR快速鑒定法檢出非結(jié)核分枝桿菌96株(10.9%)[12]。本研究結(jié)果中,非結(jié)核分枝桿菌占比2.9%(7/245),胞內(nèi)分枝桿菌居首位,其次為堪薩斯分枝桿菌和鳥分枝桿菌。提示我國非結(jié)核分枝桿菌發(fā)病率有一定差異,可能與患者所在區(qū)域、生活環(huán)境和生活習(xí)性有關(guān)。

    綜上所述,DNA微陣列芯片技術(shù)檢測周期短,操作簡單,能同時進行結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測和菌種鑒定,對MDR-TB的早期診斷和治療有較大的臨床應(yīng)用價值。

    [1] 蔡鶯鶯, 石慶新, 周秋菊, 等. 臺州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥基因的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生, 2021, 59(20): 146–149.

    [2] 王艷紅, 于鳳翥, 許廣慧. 基因芯片技術(shù)在耐藥肺結(jié)核臨床診斷中的應(yīng)用[J]. 中國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理, 2021, 12(8): 28–29.

    [3] 馮剛. 基因芯片技術(shù)在耐藥結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用價值研究[J]. 實驗與檢驗醫(yī)學(xué), 2021, 39(3): 559–562.

    [4] 孫勒, 沙巍. 耐多藥結(jié)核病在美國的傳播: 一項橫斷面研究[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2014, 37(10): 773.

    [5] 王黎霞. 分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2012.

    [6] 趙雁林, 劉志敏. 結(jié)核病實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2013.

    [7] 孫毅, 胡耀仁, 孫春麗, 等. 基因芯片技術(shù)檢測分枝桿菌的臨床應(yīng)用研究[J]. 現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué), 2021, 33(5): 581–583, 封4.

    [8] 鐘業(yè)騰, 林明冠, 林翀, 等. DNA微陣列芯片法檢測結(jié)核分枝桿菌耐異煙肼基因的研究[J]. 中國熱帶醫(yī)學(xué), 2017, 17(3): 270–273, 288.

    [9] 全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組, 全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室. 2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告[J]. 中國防癆雜志, 2012, 34(8): 485–508.

    [10] 景輝, 王燕, 李欣欣, 等. 山東省非結(jié)核分枝桿菌感染的菌種分布研究[J]. 中國防癆雜志, 2009, 31(5): 273–276.

    [11] 方木通, 蘇優(yōu)峰, 劉厚明, 等. 93例非結(jié)核分枝桿菌肺病患者臨床分析[J]. 北京醫(yī)學(xué), 2013, 35(9): 777–779.

    [12] 高榮樑, 王洪秀, 陳晉. PCR在臨床分枝桿菌菌型初篩中的應(yīng)用[J]. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 36(10): 936–938.

    Application of microarray chip technology in clinical diagnosis of multidrug resistant tuberculosis

    Department of Clinical Laboratory, Binzhou Central Hospital, Binzhou 251700, Shandong, China

    To explore the application of microarray chip technology in the clinical diagnosis of multidrug resistant tuberculosis (MDR-TB).Samples (125 sputum specimens and 120 strains isolated from sputum culture) were collected from 245 patients diagnosed with pulmonary tuberculosis in Binzhou Central Hospital from June 2020 to May 2021. Sputum samples were tested by DNA microarray chip technology and traditional culture method. DNA microarray chip technology was used to detect multidrug resistance and identify mycobacterium strains in sputum samples and isolated strains.The positive rates of 125 sputum samples were 58.4% (73/125) and 24.8% (31/125) by DNA microarray chip technology and sputum culture, respectively, and the difference between the two methods was statistically significant (2=14.520,<0.001). Using DNA microarray chip technology, 125 sputum samples and 120 isolated strains were detected. A total of 192 mycobacterium tuberculosis complex and 7 nontuberculous mycobacteria were detected. Among 192 cases of mycobacterium tuberculosis complex, 41 cases were drug resistant, including 15 cases resistant to isoniazid, 19 cases resistant to rifampicin and 7 cases resistant to both drugs. Nontuberculous mycobacteria included 4 cases Mycobacterium intracellulare, 2 case Mycobacterium kansasii and 1 case Mycobacterium avium.DNA microarray chip technology has a short detection cycle, can be used to detect multidrug resistance and strain identification of mycobacterium tuberculosis at the same time, and has great clinical application value for early diagnosis and treatment of MDR-TB.

    Tuberculosis; Nontuberculous mycobacteria; Multidrug resistant tuberculosis; Isoniazid; Rifampicin

    R372

    A

    10.3969/j.issn.1673-9701.2023.22.018

    張國翠,電子信箱:15215437913@163.com

    (2023–01–15)

    (2023–07–18)

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