基于DNA條形碼技術(shù)的虹鱒分子鑒定

李昭楠，李長忠，保長虹，賀彩霞，金文杰，陳艷霞

(青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016)

黃河流域是中國重要的生態(tài)屏障和經(jīng)濟(jì)地帶，整個(gè)流域的生態(tài)保護(hù)和高質(zhì)量發(fā)展已經(jīng)成為國家戰(zhàn)略。青海省地處黃河源頭，擁有天然有魚水域131.36×104hm2、宜魚水域5.49×104hm2，水體潔凈、水質(zhì)優(yōu)良，常年水溫在3～22 ℃之間，冬季不封凍、無大風(fēng)浪，是養(yǎng)殖鮭鱒等冷水魚的理想場所，也是國內(nèi)外公認(rèn)的養(yǎng)殖鮭鱒條件較好的地區(qū)之一[1-2]。近年來，青海省黃河沿岸的鮭鱒網(wǎng)箱養(yǎng)殖始終堅(jiān)持生態(tài)優(yōu)先的理念，保持了穩(wěn)步發(fā)展的勢頭，高原冷水魚品牌的優(yōu)勢顯現(xiàn)，青海省也成為國內(nèi)最重要的鮭鱒生產(chǎn)基地[3]。

目前，國內(nèi)外市場三文魚的銷售量穩(wěn)步增加，挪威、芬蘭和美國分別以生產(chǎn)大西洋鮭(Salmosalar)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和阿拉斯加鮭(Oncorhynchusnerka)為主，中國以生產(chǎn)虹鱒為主。虹鱒是鮭科的一員，在世界范圍內(nèi)具有重要的生態(tài)價(jià)值[4]。其中，三倍體虹鱒因體內(nèi)有三套染色體、無法進(jìn)行減數(shù)分裂、不能產(chǎn)生精子和卵子以及不存在性腺發(fā)育等特點(diǎn)，具有生長快、肉質(zhì)好、個(gè)體大和能夠有效防范物種入侵[5]等優(yōu)勢，而成為黃河上游青海段的主要養(yǎng)殖品種，促進(jìn)青海省冷水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的效益穩(wěn)步提升。目前，有關(guān)三倍體虹鱒的研究主要集中在能量代謝[6-7]、發(fā)育過程[8-9]以及不同發(fā)育階段基因的表達(dá)[10-11]等方面，在魚種鑒定方面鮮有報(bào)道。市售的三倍體虹鱒主要以冰鮮、腌制和煙熏的形式存在，急需一種有效的鑒定方法，以利于保護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益，規(guī)范市場監(jiān)管。

隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，魚類的物種鑒定研究已逐漸從形態(tài)學(xué)方法轉(zhuǎn)向形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法[12]。DNA作為生物體最核心的信息遺傳載體，其遺傳序列直接決定了生物體的本質(zhì)。以DNA為基礎(chǔ)的分子檢測技術(shù)由于具有較高的靈敏度、特異性、可靠性，己成為魚類物種鑒定的主要檢測技術(shù)[13]。分子鑒定技術(shù)主要包括隨機(jī)引物 PCR(Arbitrarily primed PCR，AP-PCR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)、擴(kuò)增性簡單序列重復(fù)(Inter-simple sequence repeats，ISSR)、限制性內(nèi)切酶切片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、擴(kuò)增限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(Amplified restriction endonuclease fragment length polymorphism，AFLP)、單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)和DNA條形碼(DNA-barcode)序列分析[14]等。其中，DNA條形碼在物種鑒定中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，即可以根據(jù)整條魚、魚片、魚鰭、魚卵或組織碎片的樣本識別魚類物種，僅需要少量樣本即可進(jìn)行DNA條形碼檢測。此外，即使是加工處理的樣品，也可以應(yīng)用DNA條形碼對其進(jìn)行物種鑒別[15]。目前，DNA-barcode和Mini-barcode技術(shù)已被廣泛用于魚種鑒定，其通過擴(kuò)增部分COⅠ序列作為條形碼，以此對物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，但該技術(shù)應(yīng)用于近緣物種、雜交種和變種之間的鑒定尚未被明確。本研究以三倍體虹鱒、二倍體虹鱒及其變種金鱒、大西洋鮭、大麻哈魚(Oncorhynchusketa)和高白鮭(Coregonuspeled)為研究對象，利用COⅠ基因?qū)琪V進(jìn)行DNA條形碼研究和系統(tǒng)進(jìn)化分析，探討COⅠ基因在分子鑒定中的適用性，為虹鱒的物種鑒定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

三倍體虹鱒、金鱒、二倍體虹鱒和大西洋鮭樣品各3條，分別采自青海省海東市、循化縣、化隆縣和門源縣；冰鮮大麻哈魚和高白鮭樣品各3條，分別購自庫爾勒愛果電子商務(wù)有限公司和哈爾濱龍德食品有限公司。取以上魚類的背部肌肉組織，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取及引物設(shè)計(jì)

使用DNA提取試劑盒(TIANGEN，Code No.DP304)提取上述鮭科魚類肌肉組織基因組DNA，通過紫外分光光度計(jì)(Implen，NanoPhotometer N60)測定各樣本的濃度和純度。以質(zhì)量合格的DNA為模板，分別擴(kuò)增6種樣本魚的DNA barcode和Mini barcode，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。通過NCBI數(shù)據(jù)庫下載10種鮭科魚類CO Ⅰ基因序列(表1)，經(jīng)Clustal X[16]對比后，選取保守區(qū)序列，利用Primer Premier 5軟件分別設(shè)計(jì)兩對DNA barcode、Mini barcode引物用于虹鱒鑒定(表2)，所有引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 鮭科魚類COⅠ基因信息

表2 PCR引物信息

1.3 PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及產(chǎn)物分析

PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：Premix Taq 10 μL(Takara，Code No.RR902A)，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL(濃度為10 μmol/L)，ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20 μL。CO Ⅰ-1 PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束。CO Ⅰ-2 PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DNA 2000 Marker(Takara，Code No.3427A)判定PCR產(chǎn)物片段大小與引物產(chǎn)物片段大小的一致性。

1.4 測序及數(shù)據(jù)分析

將符合要求的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，數(shù)據(jù)使用DNAStar軟件中的SeqMan程序[17]進(jìn)行序列拼接，再利用Clustal X[16]對比查找上下游引物位置。將處理好的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并基于相似性、覆蓋度和綜合評分來確定樣品的種屬信息。為分析虹鱒的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，從NCBI查找COⅠ基因序列長度為600 bp左右的17個(gè)鮭科物種(表3)，應(yīng)用MEGA 7.0[18]中的鄰接法(Neighbor-joining method，NJ)[19]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表3 17個(gè)鮭科物種的COⅠ基因信息

續(xù)表3

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增及序列分析

各樣本基因組DNA濃度在100～200 ng/μL之間,A260/280比值在1.9～2.1之間(表4),均滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增的要求(圖1)。對于擴(kuò)增長度為681、678 bp的DNA barcode而言,所有樣品均得到單一明亮的條帶,因此選擇引物CO Ⅰ-F24和CO Ⅰ-R24進(jìn)行基因測序分析。對于擴(kuò)增長度為153、230 bp的Mini barcode而言,引物TEYL-1擴(kuò)增后大西洋鮭與高白鮭條帶較暗(圖2),故使用TEYI-0F和TEYI-0R引物擴(kuò)增出的片段進(jìn)行測序分析。

表4 各樣本DNA質(zhì)量檢測結(jié)果

注：M為DL 2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～6使用COⅠ-F24、COⅠ-R24引物；7～12使用COⅠ-F25、COⅠ-R25引物；1、7為三倍體虹鱒；2、8為金鱒；3、9為二倍體虹鱒；4、10為大西洋鮭；5、11為大麻哈魚；6、12為高白鮭。

2.2 測序結(jié)果分析

將測序得到的DNA barcode和Mini barcode序列拼接處理后，基于NCBI數(shù)據(jù)庫檢索比對，結(jié)果表明本研究擴(kuò)增得到的6種魚的CO Ⅰ基因信息同NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知物種信息匹配度與覆蓋度均在97%以上。相比于DNA barcode序列，Mini barcode序列的最高匹配度較低，由表5可知，DNA barcode比對結(jié)果均為100%，而Mini barcode中只有大西洋鮭比對結(jié)果為100%，這可能是因?yàn)镸ini barcode序列長度較短(153 bp)，而長片段(DNA barcode)中個(gè)別堿基的缺失、插入及突變會(huì)對結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。通過BLAST發(fā)現(xiàn)待測樣本高白鮭應(yīng)為歐白鮭(Coregonusalbula)，可能存在標(biāo)簽誤貼的情況。本研究以CO Ⅰ作為單一靶基因，可對虹鱒和其他魚種進(jìn)行區(qū)分，但對于近緣物種和變種不能區(qū)分，需要尋找新的鑒別手段。

表5 6種鮭科魚基于DNA條形碼技術(shù)物種鑒定結(jié)果

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

三倍體虹鱒屬于鮭科，鮭科有3個(gè)亞科11個(gè)屬，分別基于DNA barcode和Mini barcode構(gòu)建鮭科魚類系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3、圖4)。兩個(gè)聚類結(jié)果基本一致。鮭科17個(gè)物種聚為2大支，其中白鮭亞科和茴魚亞科聚集在一起，鮭亞科聚集在一起，表明白鮭亞科和茴魚亞科的親緣關(guān)系較近。每個(gè)魚種獨(dú)立分支，由于三倍體虹鱒是由二倍體虹鱒和四倍體虹鱒雜交出的全雌性虹鱒，金鱒為二倍體虹鱒的變種，因此三倍體虹鱒、金鱒、二倍體虹鱒和虹鱒聚為一支；測序后大西洋鮭和大麻哈魚的序列也與在NCBI上下載的序列(MN850430.1、MN880432.1)聚集在一起，表明其親緣關(guān)系最近；測序后高白鮭的序列與NCBI下載的歐白鮭、高白鮭聚集在一起；白鮭屬(Coregonus)、茴魚屬(Thymallus)聚在一起，麻哈魚屬(Oncorhynchus)、副哲羅魚屬(Parahucho)、哲羅魚屬(Hucho)、紅點(diǎn)鮭屬(Salvelinus)、鱒屬(Salmo)聚在一起，表明此系統(tǒng)發(fā)育樹可信。

3 討論

遺傳學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)之一是從任何年齡動(dòng)物的活體或死體身上收集的一個(gè)小組織樣本就包含了完整的核和線粒體基因組信息。通過比較基因組選定區(qū)域內(nèi)的中性或保守變異，可以在個(gè)體水平上進(jìn)行鑒定[20]。本研究利用此原理進(jìn)行采樣后虹鱒與其他魚種的區(qū)分。相比較蛋白質(zhì)檢測方法，利用DNA鑒別更為簡便，它比蛋白質(zhì)更耐高溫，在不利的環(huán)境條件下仍然有可能通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增小的DNA片段用于鑒定，DNA還存在于生物體的幾乎所有細(xì)胞中，可以從任何基質(zhì)中被提取[21]。DNA分子標(biāo)記能夠直接反映特種DNA分子水平上的差異[22]。DNA條形碼技術(shù)是利用線粒體基因的短序列來識別物種，應(yīng)用于特定生物分類群的DNA條形碼標(biāo)記，對物種邊界、群落生態(tài)學(xué)、功能性狀進(jìn)化、營養(yǎng)相互作用和生物多樣性保護(hù)等研究具有重要意義[23]。DNA條形碼技術(shù)因準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、高效的特性而備受關(guān)注，比較適合鑒別較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的魚種[24]。

隨著全球貿(mào)易魚類產(chǎn)品的種類和類型的增加，產(chǎn)品標(biāo)簽錯(cuò)誤的案例也在增加，而其發(fā)生有不同的原因。在某些情況下，當(dāng)魚肉具有類似的物理性質(zhì)(顏色、質(zhì)地)，并且通過加工去除魚鰭和頭部等形態(tài)特征時(shí)，魚會(huì)被錯(cuò)誤地識別為其他種類。Nedunoori A等[25]利用DNA條形碼技術(shù)結(jié)合BOLD識別引擎和本地組裝的條形碼庫，對來自食品店的22個(gè)冷凍魚和魚片樣本進(jìn)行了誤標(biāo)調(diào)查，研究發(fā)現(xiàn)白眼鱈魚被錯(cuò)標(biāo)為鱈魚片，羅非魚無法被準(zhǔn)確識別。利用DNA條形碼技術(shù)，Cline E等[26]對來自美國華盛頓西部商店和餐館的鮭魚樣本進(jìn)行了檢測，以確定大西洋鮭魚取代了太平洋鮭魚，在99個(gè)鮭魚樣本中，有11個(gè)(11%)是貨真價(jià)實(shí)的；超過38%的餐廳樣本被錯(cuò)誤標(biāo)記物種，而有7%的商店樣本被錯(cuò)誤標(biāo)記。Clark L F等[27]討論了魚類價(jià)值鏈中標(biāo)簽錯(cuò)誤和替代問題的范圍、公共和私營部門目前使用的條形碼以及進(jìn)一步實(shí)施的一些建議。本研究中發(fā)現(xiàn)高白鮭存在標(biāo)簽誤貼現(xiàn)象，實(shí)際應(yīng)該為歐白鮭，結(jié)果同時(shí)證明利用DNA條形碼技術(shù)可以對物種進(jìn)行鑒定。

在魚類條形碼研究中，通常用于物種鑒定的DNA標(biāo)記是線粒體DNA(mtDNA)中一個(gè)648 bp的區(qū)域，被稱為COⅠ基因?，F(xiàn)有的分子鑒定研究通常使用DNA barcode、Mini barcode或二者與其他基因相結(jié)合的方法進(jìn)行物種鑒定，例如Chang C等[28]、Zahn R J等[29]和Sultana S等[30]分別利用650、130、259 bp的COⅠ基因與141 bp的18S rRNA基因?qū)ε_灣魚、鯊魚和20種商品魚進(jìn)行鑒定，結(jié)果均顯示該方法可行。盡管DNA條形碼技術(shù)在魚類物種鑒定方面已逐漸成熟，但其鑒別能力受到許多因素的影響。其中，數(shù)據(jù)庫脆弱性和標(biāo)本誤認(rèn)是主要因素[31]。本研究中使用681 bp的DNA barcode和153 bp的Mini barcode相結(jié)合的方法，對虹鱒及其他鮭科魚進(jìn)行鑒定，可以有效地減少在測序過程中因堿基缺失或者錯(cuò)配而產(chǎn)生的誤差，可在結(jié)果上相互驗(yàn)證，使結(jié)果更有說服力；系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果表明，此方法可用于虹鱒的鑒定，為其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供理論依據(jù)。

關(guān)于鮭科魚類的系統(tǒng)發(fā)育分析，目前常用的方法有NJ法和最大似然法(Maximum likelihood estimate，MLE)[32-33]。本研究使用NJ法對三倍體虹鱒、金鱒、二倍體虹鱒、大麻哈魚、大西洋鮭、高白鮭和其他17種鮭科魚類的線粒體基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，白鮭屬、茴魚屬聚在一起，麻哈魚、副哲羅魚屬、哲羅魚屬、紅點(diǎn)鮭屬、鱒屬聚在一起。本研究所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與李瑤瑤等[34]根據(jù)鮭科魚cytb基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹和孫毅[35]依據(jù)鮭科魚COX1基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致，佐證了本研究結(jié)果的可靠性?；谛蛄蠦LAST和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，檢測的6種魚類樣本中高白鮭存在標(biāo)簽誤貼的情況，這在魚類消費(fèi)市場中常有發(fā)生[36-37]，故各種魚類鑒定方法的建立對規(guī)范市場具有重要意義。

金鱒為虹鱒的變種[38]，二者拉丁名一致，基于線粒體基因組無法被區(qū)分，因此需探索其他可對二者進(jìn)行鑒定的方法。Stephens M R等[39]利用SNP技術(shù)對摻入金鱒中的虹鱒進(jìn)行了區(qū)分，本課題組后續(xù)將對該方法的適用性做進(jìn)一步驗(yàn)證。在魚類中，三倍體是由一個(gè)四倍體產(chǎn)生的配子與一個(gè)二倍體產(chǎn)生的配子通過受精方式結(jié)合的，三倍體化被普遍認(rèn)為是不育魚大規(guī)模生產(chǎn)最實(shí)用、經(jīng)濟(jì)和有效的方法[40]。本研究結(jié)果顯示，三倍體虹鱒、金鱒和二倍體虹鱒的COⅠ基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致，且測序發(fā)現(xiàn)三倍體虹鱒和二倍體虹鱒線粒體基因組完全一致，故基于mtDNA無法對三者進(jìn)行區(qū)分和鑒定。已有研究發(fā)現(xiàn)，依據(jù)核基因可鑒定三倍體虹鱒、金鱒和二倍體虹鱒[41-42]，但該方法對樣本來源要求較高，無法被廣泛應(yīng)用于加工樣本的鑒定。綜上所述，本研究開發(fā)的DNA條形碼可將虹鱒與其他鮭科魚類進(jìn)行區(qū)分，這將為虹鱒物種鑒定及產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究開發(fā)的DNA條形碼技術(shù)可區(qū)分虹鱒與其他鮭科物種，但對于三倍體虹鱒、二倍體虹鱒和金鱒之間不能區(qū)分，需要尋找新的鑒定方法對變種進(jìn)行區(qū)分。