基于全基因組SNPs分析陸豐黃牛和雷瓊牛的群體結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性特征

童雄，羅威，閔力，張志飛，馬新燕，羅成龍，陳衛(wèi)東，徐斌，李大剛

基于全基因組SNPs分析陸豐黃牛和雷瓊牛的群體結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性特征

童雄，羅威，閔力，張志飛，馬新燕，羅成龍，陳衛(wèi)東，徐斌，李大剛

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所/畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室河源分中心/廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640

【目的】研究陸豐黃牛和雷瓊牛與世界不同地域家牛中的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，解析不同家牛群體的遺傳多樣性，為地方家牛資源的鑒定與保護(hù)奠定理論基礎(chǔ)。【方法】采集12頭陸豐黃牛和17頭雷瓊牛的組織樣品進(jìn)行全基因組重測(cè)序，整合世界范圍內(nèi)分布的24個(gè)品種92個(gè)體的NCBI公共基因組數(shù)據(jù)，共計(jì)25個(gè)品種121個(gè)個(gè)體的信息開(kāi)展群體遺傳學(xué)研究。選用Bos taurus ARS-UCD1.2作為參考基因組，經(jīng)基因組序列比對(duì)與質(zhì)量控制獲取高質(zhì)量Reads，應(yīng)用GATK軟件檢測(cè)基因組SNPs。進(jìn)一步基于群體SNPs，利用系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、PCA聚類和Admixture評(píng)估進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，通過(guò)核苷酸多樣性（）、雜合度（）和連鎖不平衡（LD）水平研究群體的遺傳多樣性?！窘Y(jié)果】29頭廣東地方牛經(jīng)基因組測(cè)序獲取6 905 944 306個(gè)Clean Reads，每個(gè)樣本平均基因組覆蓋率為97.99%，平均測(cè)序深度分別為12.78×。整合NCBI公共基因組數(shù)據(jù)，經(jīng)質(zhì)控后共檢測(cè)出14 664 391個(gè)群體SNPs。整合系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、PCA、Admixture的結(jié)果發(fā)現(xiàn)普通牛與瘤牛分化，瘤牛群體存在中國(guó)瘤牛與印度瘤牛分化，普通牛群體中東北亞普通牛（韓牛、延邊牛）和西藏牛與歐洲普通牛分化，溫嶺高峰牛和舟山牛從中國(guó)瘤牛群體中分化。陸豐黃牛和雷瓊牛均屬于純正的中國(guó)瘤牛，但陸豐黃牛與皖南牛之間、雷瓊牛與吉安牛之間呈現(xiàn)最近的親緣關(guān)系，說(shuō)明陸豐黃牛與地域臨近的雷瓊牛屬于兩個(gè)獨(dú)立的品種。部分陸豐黃牛與雷瓊牛均存在歐洲普通牛和東北亞普通牛的血統(tǒng)混雜，且混雜比例較高，說(shuō)明這兩個(gè)品種牛急需加強(qiáng)群體內(nèi)的提純復(fù)壯。相較于歐洲普通牛和韓牛，中國(guó)家牛群體的LD衰減速率更快，核苷酸多樣性和雜合度更高，說(shuō)明其遺傳多樣性更豐富。相較于其他中國(guó)家牛，陸豐黃牛和雷瓊牛的LD水平更低，雜合度更高，且核苷酸多樣性和雜合度的密度分布更為集中，說(shuō)明兩者受人工選擇強(qiáng)度較低，且維持較高的群體遺傳多樣性?！窘Y(jié)論】通過(guò)全基因組SNPs標(biāo)記，系統(tǒng)解析了陸豐黃牛與雷瓊牛的群體遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性特征，為這兩個(gè)品種獨(dú)立分類及其保護(hù)利用提供數(shù)據(jù)支撐。

陸豐黃牛；雷瓊牛；全基因組SNPs；群體結(jié)構(gòu)；遺傳多樣性

0 引言

【研究意義】家牛是人類馴化最早的家畜動(dòng)物之一，距今約10 000年前由世界不同地域的原牛多次馴化而來(lái)[1-2]。中國(guó)家牛在長(zhǎng)期的馴化和培育過(guò)程中受到人為選擇和自然選擇的作用，形成了表型豐富多樣的地方品種[3]，目前《國(guó)家畜禽遺傳資源品種名錄（2021年版）》收錄的地方品種牛達(dá)55個(gè)，后續(xù)隨著第三次全國(guó)畜禽遺傳資源普查工作的推進(jìn)，會(huì)有更多的地方品種牛被鑒定收錄。陸豐黃牛和雷瓊牛是廣東省特有的地方品種，具有耐熱、耐粗飼、抗病性強(qiáng)等優(yōu)良特性[3-4]，因此，這兩個(gè)品種牛具有重要的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值和科學(xué)研究意義。近年來(lái)外來(lái)商業(yè)肉牛品種的引入導(dǎo)致這兩個(gè)品種牛的種質(zhì)資源流失，保種形勢(shì)日趨嚴(yán)峻[4]；同時(shí)，由于分子鑒定數(shù)據(jù)的缺乏，陸豐黃牛與雷瓊牛在品種分類上是否歸屬于兩個(gè)獨(dú)立品種的問(wèn)題，一直存在爭(zhēng)議?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】《中國(guó)畜禽遺傳資源志-牛志》在總結(jié)前人成果后，以生態(tài)類型、外貌特征、地理分布區(qū)域、分子生物學(xué)、生化遺傳學(xué)等因素作為主要的分類依據(jù)，將中國(guó)黃牛劃分為4種類型：華北型、中原型、南方型和培育品種[3]，陸豐黃牛與雷瓊牛從地域分布和表型特征上，屬于典型的南方型中國(guó)黃牛[4]。前期基于線粒體mt-DNA序列[5]、常染色體基因組[6-7]和Y染色體基因組[7]分子標(biāo)記開(kāi)展的分類學(xué)研究，世界范圍內(nèi)家牛可分為2大類：瘤牛（Indicine, Bos taurues indicus）和普通牛（Taurine, Bos taurus taurus），進(jìn)一步細(xì)分可分為5類型：歐亞普通牛（Eurasian taurine）、東亞普通牛（East Asian taurine）、歐洲普通牛（European taurine）、中國(guó)瘤牛（Chinese indicine）和印度瘤牛（Indian indicine）[7]。中國(guó)家牛主要來(lái)源于3個(gè)祖代類群：歐亞普通牛、東亞普通牛和中國(guó)瘤牛，中國(guó)西北部家牛屬于歐亞普通牛，中國(guó)南方家牛屬于中國(guó)瘤牛，中國(guó)中北部和西南部家牛均屬于普通牛和瘤牛的雜交類群，西藏地區(qū)家牛屬于東亞普通牛[7]。前期常染色體基因組SNPs評(píng)估遺傳多樣性研究中均反映出中國(guó)家牛的遺傳多樣性高于印度瘤牛，而兩者高于歐洲普通牛；中國(guó)家牛中南方瘤牛的遺傳多樣性要高于北方的普通牛[7-8]。與此相反，mt-DNA單倍型多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)北方普通牛的遺傳多樣性較南方瘤牛更為豐富[5]。前期血液同工酶多態(tài)性研究報(bào)道了雷瓊牛與文山牛和溫嶺高峰牛等南方瘤牛親緣關(guān)系相近，且雷瓊牛的群體遺傳多樣性豐富，高于外來(lái)商用品種牛[9]?；趍t-DNA序列的母系遺傳學(xué)研究則報(bào)道雷瓊牛mt-DNA的遺傳多樣性較低[10]，在分類上屬于瘤牛，但其特有的單倍型與印度瘤牛存在顯著差異[11-12]。近年來(lái)，通過(guò)全基因組SNPs進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究中，陸續(xù)報(bào)道雷瓊牛具有純正的中國(guó)瘤牛血統(tǒng)，且中國(guó)家牛中混雜的瘤牛血統(tǒng)均來(lái)自雷瓊牛為代表的中國(guó)瘤牛而不是印度瘤牛[7-8]。有關(guān)陸豐黃牛的群體遺傳學(xué)研究較少，目前LIU等在研究8個(gè)中國(guó)南方家牛品種的群體基因組特征時(shí)，發(fā)現(xiàn)陸豐黃牛與其他7個(gè)南方牛品種的遺傳距離較遠(yuǎn)，且存在一定比例的特異性祖代血統(tǒng)[13]，但該項(xiàng)研究中僅整合南方少數(shù)的幾個(gè)牛品種，缺乏其他地域家牛的信息，因此，無(wú)法判定采集的陸豐黃牛樣本是否存在遺傳混雜，進(jìn)而引發(fā)群體結(jié)構(gòu)解析偏差。此外，LIU等先后利用該樣本數(shù)據(jù)，比較中國(guó)南方牛群體遺傳多樣性時(shí)，發(fā)現(xiàn)陸豐黃牛和海南牛（海南雷瓊牛群體）近交系數(shù)較其他南方牛（文山牛、廣東雷瓊牛群體等）高，且其遺傳多樣性更低[13-14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，世界各地域分布的家牛陸續(xù)開(kāi)展基因組學(xué)研究[6-8, 15-18]，目前通過(guò)整合世界各地域代表性牛品種的基因組信息，將是系統(tǒng)解析陸豐黃牛和雷瓊牛群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的契機(jī)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采集陸豐黃牛和雷瓊牛的群體樣本進(jìn)行全基因組測(cè)序，整合其他地域代表性牛品種的基因組數(shù)據(jù)，解析陸豐黃牛與雷瓊牛之間、兩者與其他地域牛品種之間的親緣關(guān)系，指導(dǎo)品種的分類鑒定。同時(shí)，不同家牛群體的遺傳多樣性分析，為后續(xù)地方品種保種方案制定提供信息支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與數(shù)據(jù)庫(kù)信息收集

研究于2022年6—7月，分別在廣東省陸豐市潭西鎮(zhèn)陸豐黃牛保種場(chǎng)和廣東省湛江市麻章區(qū)雷瓊牛保種場(chǎng)采集12頭陸豐黃牛（圖1）的耳組織樣和17頭雷瓊牛（圖2）的外周血樣，進(jìn)行基因組DNA提取、質(zhì)量檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序。為解析廣東2個(gè)地方品種牛與世界其他地域家牛品種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載24個(gè)品種92個(gè)個(gè)體的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)庫(kù)個(gè)體的下載信息見(jiàn)附表1。本研究25個(gè)品種121個(gè)個(gè)體的樣本信息詳見(jiàn)表1。

圖2 雷瓊牛（公）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取與質(zhì)量檢測(cè) 采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿法進(jìn)行組織樣基因組DNA的抽提。根據(jù)Illumina NovaSeq6000系統(tǒng)（Illumina, Inc., San Diego, CA, USA）對(duì)基因組DNA樣品的文庫(kù)構(gòu)建質(zhì)量要求：OD260/280介于1.8—2.0之間，DNA總量≥10μg。

1.2.2 基因組文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序 29份組織樣品檢測(cè)合格后，每個(gè)樣品取用0.5μg DNA模板，根據(jù)Annoroad? Universal DNA Fragmentase kit V2.0（AN200101-L）及Annoroad? Universal DNA Library Prep Kit V2.0（AN200101-L）的方法及流程進(jìn)行文庫(kù)制備。使用NovaSeq 6000 S4 Reagent kit V1.5試劑在NovaSeq 6000 S4平臺(tái)進(jìn)行成簇和測(cè)序，運(yùn)行雙端測(cè)序程序（PE），得到150 bp的雙端測(cè)序Reads。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 基因組序列比對(duì)與質(zhì)量控制 將原始數(shù)據(jù)（Raw Data）中帶接頭和低質(zhì)量的序列進(jìn)行過(guò)濾，從而得到高質(zhì)量序列（Clean Reads）。過(guò)濾步驟如下：（1）去除接頭污染的Reads（Reads中接頭污染的堿基數(shù)大于5 bp）；（2）去除低質(zhì)量的Reads（超過(guò)50%的堿基質(zhì)量值低于19的Reads）；（3）去除含N比例大于5%的Reads。

選用Bos taurus ARS-UCD1.2[19]作為參考基因組，通過(guò)基因組比對(duì)軟件BWA v.0.7.17[20]將CleanReads比對(duì)到參考基因組上。利用Samtools v.1.9軟件[21]對(duì)比對(duì)后的序列進(jìn)行排序，且通過(guò)-q 4參數(shù)去除低質(zhì)量Reads，應(yīng)用Picard-tools v.2.20.2軟件（http:// broadinstitute.github.io/picard/）去除PCR重復(fù)。

1.3.2 基因組SNPs的檢測(cè) 應(yīng)用GATK v.3.8軟件[22]中檢測(cè)群體位點(diǎn)變異的方法檢測(cè)SNP。通過(guò)質(zhì)量值、深度、重復(fù)性等條件進(jìn)行過(guò)濾篩選，過(guò)濾參數(shù)設(shè)置為：QD<2.0, ReadPosRankSum<-8.0, FS>60.0, QUAL< 30.0, DP<4.0, MQ<40.0, MappingQualityRankSum<-12.5。利用VCFtools v0.1.16軟件[23]提取常染色體SNPs后，以參數(shù)“--min-alleles 2 --max-alleles 2 --maf 0.05 --max- missing 0.9 --minGQ 15.0”進(jìn)行質(zhì)控，獲得群體高質(zhì)量常染色體SNPs。

1.3.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析：利用Plink v1.9軟件[24]計(jì)算群體IBS遺傳距離，通過(guò)MEGA v8.0軟件[25]構(gòu)建Neighbor-joining tree。PCA分析：應(yīng)用Plink v1.9軟件[24]進(jìn)行LD-pruning，剔除高連鎖群體SNPs后，利用Eigenstrat v6.1.4軟件[26]進(jìn)行PCA分析。Admixture分析：基于LD-pruning后的群體SNPs，使用Admixture v1.3.0軟件[27]的 unsupervised mode進(jìn)行Admixture分析，計(jì)算K=2-5的群體遺傳組分。

1.3.4 群體內(nèi)遺傳多樣性分析 雜合度分析：自制perl腳本運(yùn)行分析，bin size設(shè)為40 000，step window size設(shè)為20 000。核苷酸多樣性分析：利用VCFtools v0.1.16軟件[23]進(jìn)行計(jì)算，參數(shù)設(shè)置：“--window-pi 40000，--window-pi-step 20000”。連鎖不平衡LD分析：使用PopLDdecay V3.40軟件[28]，對(duì)各群體的LD decay進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與作圖。

2 結(jié)果

2.1 基因組數(shù)據(jù)比對(duì)質(zhì)量與數(shù)據(jù)合并

本研究采集29頭廣東地方牛樣品進(jìn)行基因組測(cè)序，獲得6 905 944 306個(gè)Clean Reads，每個(gè)樣本平均基因組覆蓋率為97.99%，平均測(cè)序深度分別為12.78×。將本研究采集的29個(gè)樣本的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載的24個(gè)品種92個(gè)個(gè)體的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行合并分析（表1），檢測(cè)出14 664 391個(gè)群體SNPs?；谫|(zhì)控條件設(shè)置SNP缺失率≤0.15，故LF08個(gè)體在后續(xù)研究中被去除。

2.2 不同地域分布家牛的群體遺傳結(jié)構(gòu)

2.2.1 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 基于狀態(tài)一致性（Identity By State, IBS）距離構(gòu)建全群的鄰近進(jìn)化樹(shù)，推斷不同品種牛之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（圖3）。本研究采集的雷瓊牛與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載的3頭雷瓊牛聚為一簇，這說(shuō)明本研究采集樣本具有品種代表性，且鄰近進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建方法科學(xué)合理。進(jìn)化樹(shù)上清晰反映：所有家牛出現(xiàn)普通牛（安格斯牛、海福特牛、利木贊牛、西門(mén)塔爾牛、西藏牛、韓牛、延邊牛、魯西牛、渤海黑牛、南陽(yáng)牛）和瘤牛（錦江牛、皖南牛、廣豐牛、吉安牛、雷瓊牛、陸豐黃牛、文山牛、舟山牛、溫嶺高峰牛、哈里亞娜牛、吉爾牛、沙希華牛、內(nèi)洛爾牛、塔帕卡牛、婆羅門(mén)牛）兩個(gè)大類群；在瘤牛群體中，中國(guó)瘤牛（錦江牛、皖南牛、廣豐牛、吉安牛、雷瓊牛、陸豐黃牛、文山牛、舟山牛、溫嶺高峰牛）與印度瘤牛（哈里亞娜牛、吉爾牛、沙希華牛、內(nèi)洛爾牛、塔帕卡牛、婆羅門(mén)牛）形成了兩個(gè)獨(dú)立的類群。此外，在中國(guó)瘤牛群體中，浙江省的舟山牛和溫嶺高峰牛形成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的類群。陸豐黃牛和雷瓊牛均屬于中國(guó)瘤牛類群，雷瓊牛群體內(nèi)僅1個(gè)個(gè)體（Leiqiong12）偏離，其他個(gè)體均能聚為一簇；而陸豐黃牛群體內(nèi)出現(xiàn)2個(gè)亞群（亞群1：lufeng01、lufeng04、lufeng07、lufeng10和lufeng12；亞群2：lufeng02、lufeng05、lufeng06和lufeng09），且亞群外的2個(gè)個(gè)體（Lufeng03和Lufeng11）遺傳距離與中國(guó)北方牛（南陽(yáng)牛和魯西牛）相近。

2.2.2 主成分分析（PCA） 對(duì)120個(gè)個(gè)體進(jìn)行主成分分析，計(jì)算特征值的TW檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，并對(duì)TW進(jìn)行顯著性判定。前2個(gè)顯著性特征向量PC1和PC2分別解釋16.19%和3.44%的變異。通過(guò)PC1和PC2建立的二維PCA圖（圖4）中：PC1分布可解釋普通牛和瘤牛之間存在顯著的遺傳分化；PC2分布解釋了中國(guó)瘤牛與印度瘤牛之間的遺傳差異，且陸豐黃牛與雷瓊牛均歸屬于中國(guó)瘤牛類群，這與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果相一致。

表1 本研究中25個(gè)品種121個(gè)個(gè)體的樣本信息

Angus：安格斯牛；Hereford：海福特牛；Limousin：利木贊牛；Simmental：西門(mén)塔爾牛；Tibetan：西藏牛；Hanwoo：韓牛；Yanbian：延邊牛；Luxi：魯西牛；Bohai：渤海黑牛；Nanyang：南陽(yáng)牛；Jinjiang：錦江牛；Wannan：皖南牛；Guangfeng：廣豐牛；Jian：吉安牛；Leiqiong：雷瓊牛；Lufeng：陸豐黃牛；Wenshan：文山牛；Zhoushan：舟山牛；Wenling：溫嶺高峰牛；Hariana：哈里亞娜牛；Gir：吉爾牛；Sahiwal：沙希華牛；Nelore：內(nèi)洛爾牛；Tharparkar：塔帕卡牛；Brahman：婆羅門(mén)牛。品種代號(hào)后的數(shù)字代表品種內(nèi)個(gè)體的編號(hào)。下同

圖中虛線方框中僅顯示陸豐黃牛和雷瓊牛的PCA。The dotted box in the figure shows only the PCA of Lufeng cattle and Leqiong cattle.

2.2.3 Admixture祖代分析 Admixture評(píng)估家牛群體的祖代數(shù)量和遺傳混雜比例，隨著祖代群體數(shù)K的逐步遞增（K=2-5），所研究樣本群體呈現(xiàn)不同的群體結(jié)構(gòu)特征（圖5）。當(dāng)K=2-3時(shí)，普通牛和瘤牛分離，瘤牛群體分化為：中國(guó)瘤牛和印度瘤牛，這與PCA和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果一致。K=4時(shí)，西藏牛、韓牛、延邊牛與歐洲普通牛出現(xiàn)明顯的分化。K=5時(shí)，溫嶺高峰牛和舟山牛從中國(guó)瘤牛中分離出來(lái)，這與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果一致。5個(gè)陸豐黃牛和12個(gè)雷瓊牛具有單一的祖代成分，而剩余的6個(gè)陸豐黃牛和8個(gè)雷瓊牛均存在多個(gè)祖代成分，且主要受到歐洲普通牛和東亞普通牛的混雜影響。5個(gè)單一祖代成分的陸豐黃牛與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中亞群1個(gè)體完全一致。

2.3 不同地域分布家牛的核苷酸多樣性和雜合度分析

對(duì)18個(gè)家牛品種（海福特牛、安格斯牛、西門(mén)塔爾牛、韓牛、西藏牛、渤海黑牛、魯西牛、南陽(yáng)牛、舟山牛、婆羅門(mén)牛、溫嶺高峰牛、文山牛、雷瓊牛、陸豐黃牛、廣豐牛、吉安牛、皖南牛、錦江牛）進(jìn)行種群核苷酸多樣性（）和雜合度（）評(píng)估（圖6）。除西藏牛外，中國(guó)家牛的核苷酸多樣性和雜合度的中位數(shù)與婆羅門(mén)牛相近，但均高于歐洲普通牛（海福特牛、安格斯牛、西門(mén)塔爾牛）和韓牛。歐洲普通牛和韓牛核苷酸多樣性的四分位距較中國(guó)家牛小，說(shuō)明核苷酸多樣性較中國(guó)家牛更為集中。歐洲普通牛和韓牛核苷酸多樣性和雜合度分布不均勻，密度分布集中中位數(shù)與下四分位數(shù)之間，說(shuō)明歐洲普通牛和韓牛中低的多樣性和雜合度值較集中分布。陸豐黃牛和雷瓊牛和的四分位距較其他中國(guó)家牛小，說(shuō)明和較其他中國(guó)家牛更為集中。此外，這兩個(gè)品種牛的中位數(shù)高于其他中國(guó)家牛，且密度分布的峰值更高寬度更窄，說(shuō)明其較其他中國(guó)家牛更高，且變異程度小。

品種代號(hào)后的數(shù)字代表品種內(nèi)個(gè)體的編號(hào) The number after breed code represents the number of the individual within the breed.

2.4 不同地域分布家牛的連鎖不平衡分析

為評(píng)估18個(gè)家牛群體的連鎖不平衡水平，應(yīng)用全基因組SNPs繪制不同群體的2衰減圖（圖7）。相比歐洲普通牛（海福特牛、安格斯牛、西門(mén)塔爾牛）和韓牛，除西藏牛外，中國(guó)家牛（渤海黑牛、魯西牛、南陽(yáng)牛、舟山牛、溫嶺高峰牛、文山牛、雷瓊牛、陸豐黃牛、廣豐牛、吉安牛、皖南牛、錦江牛）和婆羅門(mén)牛群體的LD衰減速率更快。陸豐黃牛和雷瓊牛群體的LD水平（2值）較其他中國(guó)家牛群體低。

圖6 不同家牛群體的核苷酸多樣性（a，Pi）和雜合度（b，Hp）

3 討論

3.1 不同地域分布家牛的群體遺傳結(jié)構(gòu)

現(xiàn)代家牛均由共同的祖先-原牛馴化而來(lái)，前期mt-DNA遺傳方面的研究發(fā)現(xiàn)普通牛和瘤牛來(lái)源于兩個(gè)獨(dú)立分化的原牛群體，且兩者在母系遺傳分化的時(shí)間約為20萬(wàn)年前[32]。本研究中系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、PCA和Admixture分析結(jié)果一致顯示：普通牛類群和瘤牛類群存在明顯的遺傳分化，這與之前基因芯片[6, 16, 33]和基因組重測(cè)序研究[7, 17]中得到的結(jié)果一致，從基因組水平上反映出：世界范圍內(nèi)不同地域分布的家牛主要由普通原牛和瘤原牛分別馴化而來(lái)。前期考古學(xué)的研究表明，中國(guó)南方瘤牛是距今約3 500—2 500年前由印度次大陸的瘤牛遷移擴(kuò)散而來(lái)[34]。CHEN等[7]和WANG等[16]從常染色體和Y染色體水平上均發(fā)現(xiàn)瘤牛群體分化為中國(guó)瘤牛和印度瘤牛，且推斷出兩者分歧時(shí)間約為3.66萬(wàn)—4.96萬(wàn)年，早于瘤牛馴化時(shí)間。本研究增補(bǔ)4個(gè)中國(guó)南方瘤牛品種（陸豐黃牛、雷瓊牛、舟山牛、溫嶺高峰牛）的基因組變異信息，同樣證實(shí)了兩個(gè)瘤牛類群之間的分化，綜合前期考古和分子遺傳學(xué)的研究成果，造成遺傳分化的原因可能是兩個(gè)類群具有獨(dú)立的祖先。本研究整合了CHEN等[7]研究中部分樣本，因此同樣發(fā)現(xiàn)西藏牛與東北亞的普通牛（韓牛、延邊牛）遺傳距離相近，而與歐洲普通牛存在明顯的遺傳分化。品種形成歷史上，舟山牛是由上海川沙、南匯等地的牛只引入后形成的品種[3, 35]，而溫嶺高峰牛是在當(dāng)?shù)噩F(xiàn)有牛群的基礎(chǔ)上選育而來(lái)[3]。JIANG等在研究舟山牛與其他品種牛之間的親緣關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)舟山牛與溫嶺高峰牛的親緣關(guān)系相近，且兩個(gè)品種牛與相鄰地域的中國(guó)瘤牛（皖南牛、吉安牛、雷瓊牛）形成明顯的遺傳分化[15]。本研究整合歐洲普通牛、印度瘤牛及更多的中國(guó)瘤牛品種（n=9），同樣發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)品種牛遺傳距離相近，且從中國(guó)瘤牛類群中分離，但部分溫嶺高峰牛個(gè)體存在祖代血統(tǒng)混雜，這說(shuō)明舟山?？赡茉谙鄬?duì)封閉地域環(huán)境下形成了特有的群體，而溫嶺高峰牛在近期可能受到舟山牛和其他中國(guó)瘤?；蚪涣鞯墓餐绊?。

圖7 不同家牛群體的連鎖不平衡LD衰減

3.2 陸豐黃牛和雷瓊牛與其他地域家牛品種間的親緣關(guān)系

通過(guò)采集廣東陸豐黃牛和雷瓊牛的群體樣本，整合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的24個(gè)品種重測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)廣東2個(gè)地方品種牛均屬于中國(guó)瘤牛類群。本研究系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和Admixture分析發(fā)現(xiàn)5個(gè)血統(tǒng)純正的陸豐黃牛個(gè)體與地理分布相對(duì)較遠(yuǎn)的皖南牛呈現(xiàn)最近的親緣關(guān)系，這可能是自古徽商與粵商密集商貿(mào)往來(lái)而引入的基因交流產(chǎn)生的結(jié)果，皖南牛核心產(chǎn)區(qū)所在的歙縣等地正是徽商主要的發(fā)源地，而陸豐黃牛主要分布的粵東地區(qū)是粵商商貿(mào)的代表性區(qū)域[4, 36]。進(jìn)一步從Admixture遺傳混雜比例結(jié)果來(lái)看，未受到遺傳混雜影響的陸豐黃牛與雷瓊牛具有單一純正的祖代，皖南牛則主要來(lái)源于廣東來(lái)源的瘤牛祖代血統(tǒng)，同時(shí)，受到其他中國(guó)瘤牛祖代的遺傳混雜影響，因此，可以推測(cè)陸豐黃牛在商貿(mào)往來(lái)介導(dǎo)之下，單向流入皖南地區(qū)進(jìn)而影響皖南牛的品種形成。CHEN等在研究不同地域家牛祖代特征時(shí)發(fā)現(xiàn)皖南牛與雷瓊牛具有相同的單一祖代[7]，而本研究在整合舟山牛、溫嶺高峰牛和陸豐黃牛后，發(fā)現(xiàn)皖南牛存在多種中國(guó)瘤牛血統(tǒng)混雜的情況，進(jìn)而解析皖南牛的品種形成及其與陸豐黃牛的親緣關(guān)系。本研究系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)反映出雷瓊牛和吉安牛的親緣關(guān)系最近，這與CHEN等[7，15-16]的研究結(jié)果一致，結(jié)合Admixture遺傳混雜結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)吉安牛主要血統(tǒng)來(lái)自雷瓊牛為代表的祖代，且混雜了少量舟山牛和溫嶺高峰牛來(lái)源的祖代及歐亞普通牛祖代，因此，推斷自古廣東與江西的行政管理和貿(mào)易流通[37]介導(dǎo)了雷瓊牛與吉安牛相互影響，而吉安牛廣袤的中心產(chǎn)區(qū)（江西省吉安市、贛州市、撫州市、湖南省茶陵、衡山）[3]易受鄰近地區(qū)和外來(lái)牛種的基因滲入影響。前期血液同工酶多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，相比于其他地域家牛，雷瓊牛與中國(guó)南方瘤牛（文山牛和溫嶺高峰牛）親緣關(guān)系更近[9]；而基于mt-DNA序列開(kāi)展雷瓊牛母系起源研究中報(bào)道了雷瓊牛具有特有的單倍型，與印度瘤牛之間存在遺傳差異[11-12]。CHEN等[7-8]在家牛群體基因組研究中報(bào)道中國(guó)南方瘤?？赡苁仟?dú)立馴化而來(lái)，雷瓊牛具有純正的中國(guó)瘤牛血統(tǒng)，且中國(guó)家牛中瘤牛血統(tǒng)來(lái)自雷瓊牛為代表的中國(guó)瘤牛而不是印度瘤牛，這與本研究系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、PCA和Admixture分析結(jié)果一致。本研究中部分陸豐黃牛與雷瓊牛均存在歐洲普通牛和東亞普通牛的血統(tǒng)混雜，且混雜比例較高，這說(shuō)明廣東地方品種牛在近期可能受到外來(lái)品種牛的基因滲入影響，急需加強(qiáng)品種內(nèi)的提純復(fù)壯。

3.3 不同地域家牛的遺傳多樣性比較

通過(guò)核苷酸多樣性和雜合度的中位數(shù)及數(shù)據(jù)分布結(jié)果均反映出中國(guó)家牛的遺傳多樣性與印度瘤牛相近，而均高于歐洲普通牛（海福特牛、安格斯牛、西門(mén)塔爾牛）和韓牛，這可能與歐洲普通牛和韓牛作為商業(yè)品種牛經(jīng)過(guò)高度選育有關(guān)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)家牛和婆羅門(mén)牛群體的LD衰減速率快于歐洲普通牛和韓牛，這與XIA等[38-39]報(bào)道的LD衰減趨勢(shì)一致，同時(shí)也驗(yàn)證了中國(guó)家牛和婆羅門(mén)牛具有更高的遺傳多樣性。本研究Admixture的結(jié)果反映出中國(guó)北方家牛和部分南方家牛存在廣泛的多祖代遺傳混雜，這可能是維持中國(guó)家牛群體較高的遺傳多樣性的重要來(lái)源。前期中國(guó)黃?；蚪M研究中也陸續(xù)報(bào)道中國(guó)家牛中廣泛的基因交流，進(jìn)而影響了秦川牛[8]、滇中牛[7]、潿洲黃牛[16]、大別山牛[40]等群體的遺傳多樣性。北方家牛中歐洲普通牛的血統(tǒng)比例較中國(guó)南方家牛更高，這與CHEN等[7,16]報(bào)道的一致。廣東2個(gè)地方品種牛較其他中國(guó)家牛具有更為集中的核苷酸多樣性和雜合度，筆者結(jié)合Admixture的結(jié)果推斷這可能是廣東2個(gè)品種受人工選擇作用的影響較低。此外，廣東2個(gè)地方品種牛具有較高的雜合度，高于文山牛等其他中國(guó)家牛品種，這可能是本研究選取的參考基因組與其遺傳距離較遠(yuǎn)所產(chǎn)生或是群體高遺傳多樣性的體現(xiàn)。從中國(guó)家牛群體的LD水平來(lái)看，廣東2個(gè)地方品種牛的LD水平明顯低于其他中國(guó)家牛，這進(jìn)一步說(shuō)明這2個(gè)品種牛具有高的遺傳多樣性，且受人工選擇的強(qiáng)度較低。與本研究中雜合度和LD的趨勢(shì)正好相反，LIU等先后利用芯片技術(shù)研究中國(guó)南方家牛的群體遺傳多樣性時(shí)，發(fā)現(xiàn)相比文山牛、雷瓊牛（廣東雷瓊牛群體）、昭通牛等5個(gè)南方牛品種，陸豐黃牛與海南牛（海南雷瓊牛群體）具有更低的雜合度（和）和更高的近交系數(shù)（）[13-14]，這可能與不同研究中采集樣本的群體結(jié)構(gòu)與多樣性有關(guān)。楊關(guān)福等在研究雷瓊牛血液蛋白的遺傳多樣性時(shí)，發(fā)現(xiàn)雷瓊牛的多態(tài)座位百分比和平均雜合度較高，且均高于荷斯坦牛[41]，這與本研究中雷瓊牛的遺傳多樣性高于歐洲普通牛的趨勢(shì)是一致的。與此相反，前期mt-DNA的遺傳多樣性研究中，雷瓊牛D-loop區(qū)的核苷酸多樣性僅為0.15%，低于秦川牛、蒙古牛、中國(guó)荷斯坦牛等品種[10]。

4 結(jié)論

本研究采集29頭廣東地方牛（12頭陸豐黃牛和17頭雷瓊牛），整合24個(gè)品種92個(gè)體的NCBI公共基因組數(shù)據(jù)，開(kāi)展陸豐黃牛和雷瓊牛的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)特征研究。陸豐黃牛和雷瓊牛均屬于純正的中國(guó)瘤牛，陸豐黃牛與皖南牛之間、雷瓊牛與吉安牛之間呈現(xiàn)最近的親緣關(guān)系。中國(guó)家牛群體相較于歐洲普通牛和韓牛，具有更快的LD衰減速率和更高的核苷酸多樣性和雜合度相比于其他中國(guó)家牛，陸豐黃牛和雷瓊牛LD水平更低，雜合度更高，核苷酸多樣性和雜合度的密度分布更為集中。部分陸豐黃牛與雷瓊牛均存在較高比例的歐洲普通牛和東北亞普通牛的血統(tǒng)混雜，在后續(xù)的品種保護(hù)中急需進(jìn)行群體內(nèi)的提純復(fù)壯。

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TONG Xiong, LUO Wei, MIN Li, ZHANG ZhiFei, MA XinYan, LUO ChengLong, CHEN WeiDong, XU Bin, LI DaGang

Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding/ Heyuan Branch of Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Guangzhou 510640

【Objective】Phylogenetic relationship among Lufeng cattle, Leiqiong cattle and domestic cattle in different regions worldwide, and genetic diversity of different domestic cattle populations were studied, so as to lay a theoretical foundation for the identification and protection of domestic cattle resources. 【Method】Tissue samples of 12 individuals of Lufeng cattle and 17 ones of Leiqiong cattle were collected for whole genome resequencing. Combined with another 92 cattle genomes from 24 breeds worldwide available in the NCBI database, a panel of cattle genomes comprising 121 individuals were generated from 25 breeds to carry out population genetics study. Bos taurus ARS-UCD1.2 assembly was selected as the reference genome. High-quality reads were obtained by genome alignment and quality control. Genomic SNPs were detected by GATK software. Population structure was analyzed by phylogenetic tree construction, PCA clustering, and Admixture evaluation. Genetic diversity of the populations was studied by estimating nucleotide diversity (), heterozygosity (), and linkage disequilibrium (LD). 【Result】A total of 6 905 944 306 clean reads were obtained by genome sequencing from 29 individuals of the two cattle breeds in Guangdong. Average genome coverage and average sequencing depth of each sample were 97.99% and 12.78×, respectively. After integrating the NCBI cattle genome data, 14 664 391 population SNPs were identified. The results of phylogenetic tree, PCA and Admixture showed that a primary division was found betweencattle from taurine and indicine. Moreover, indicine cattle split on Chinese and Indian cattle, and Northeast Asian cattle (Hanwoo and Yanbian) and Tibetan cattle separated from European taurine group, while Wenling cattle and Zhoushan cattle differentiated from Chinese indicine group. Lufeng cattle and Leiqiong cattle belonged to pure Chinese indicine cattle. Lufeng cattle and Wannan cattle, Leiqiong cattle and Ji'an cattle showed the closest relationship, respectively. The relationships indicated that Lufeng cattle and Leiqiong cattle in the adjacent areas belonged to two independent breeds. Some Lufeng and Leiqiong individuals were genetically admixed with European taurine and Northeast Asian taurine cattle, and the admixed proportion was high, indicating that these two breeds needed to strengthen the purification and rejuvenation within the population. Compared with European taurine cattle and Korean cattle, for Chinese domestic cattle, LD decay rate was faster, and nucleotide diversity () and heterozygosity () were higher, indicating that genetic diversity of Chinese domestic cattle was richer. Compared with other Chinese domestic cattle, LD levels of Lufeng cattle and Leiqiong cattle were lower, heterozygosity () was higher, and the density distribution of nucleotide diversity () and heterozygosity () was more concentrated, indicating that the two cattle breeds were less subject to artificial selection and maintain higher genetic diversity. 【Conclusion】Population structure and genetic diversity of Lufeng cattle and Leiqiong cattle were analyzed by genome-wide SNPs, which provided data support for independent classification and conservation of these two cattle breeds.

Lufeng cattle; Leiqiong cattle; whole-genome SNPs; population structure; genetic diversity

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.14.014

2023-01-04；

2023-04-23

廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2022KJ114）、嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室河源分中心自主科研項(xiàng)目（DT20220023）、2022年省級(jí)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略專項(xiàng)資金種業(yè)振興項(xiàng)目（2022-XBH-00-008）

童雄，E-mail：tongxiong@gdaas.cn。羅威，E-mail：luowei@gdaas.cn。童雄和羅威為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者徐斌，E-mail：xubin@gdaas.cn。通信作者李大剛，E-mail：lidagang@gdaas.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）