PMA-qPCR 聯(lián)用快速檢測蘋果中擴(kuò)展青霉活菌

陽 瑾，丁 宇，于呂健，范盈盈，劉峰娟，趙雪祺，焦子偉 ，王 成,

（1.伊犁師范大學(xué)生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆伊犁 835000；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部荒漠綠洲生態(tài)區(qū)特色農(nóng)產(chǎn)品功能營養(yǎng)與健康重點實驗室（部省共建），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（烏魯木齊），新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實驗室，新疆烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

以擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）為主的植物病原菌感染導(dǎo)致每年都會有大量的水果被侵蝕腐爛，造成大量的經(jīng)濟(jì)損失，大概有25%的農(nóng)產(chǎn)品會受到真菌毒素的污染，部分國家受污染比例可達(dá)到農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量的一半及以上[1]。擴(kuò)展青霉產(chǎn)生的展青霉素具有腸、肝、腎、免疫、基因毒性等[2]，對多種人體器官造成傷害，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）認(rèn)定為“第三類可疑致癌物”[3]。早年就有研究者發(fā)現(xiàn)切除腐爛部位并不能完全去除展青霉素，擴(kuò)展青霉和毒素會向未腐爛的組織遷移，并且未腐爛組織中的毒素含量可能會超過最低限量[4]，展青霉素遷移遠(yuǎn)慢于擴(kuò)展青霉菌落的遷移[5]。根據(jù)毒素含量與菌落濃度之間的對應(yīng)關(guān)系可以通過菌落濃度來反映毒素含量[6]。近年來越來越多研究者開始利用qPCR 技術(shù)對擴(kuò)展青霉進(jìn)行檢測從而研究毒素含量。Tannous 等[7]創(chuàng)建了利用qPCR 檢測蘋果中擴(kuò)展青霉菌DNA 從而估計展青霉素含量的方法。Rodríguez 等[8]也利用SYBR Green和TaqMan 兩種方法進(jìn)行qPCR 技術(shù)檢測展青霉素含量。從控制展青霉素污染角度來說對擴(kuò)展青霉菌活菌檢測具有重要意義。但普通的qPCR 技術(shù)并不能分辨出活菌和死菌的區(qū)別，極易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

反壟斷法中縱向壟斷協(xié)議的解釋學(xué)澄清——兼評全國首例縱向壟斷協(xié)議行政訴訟案...........................................................................................吳佩乘 11.44

PMA 和疊氮溴化乙錠（Ethidium Monoazide Bromide，EMA）都屬于對DNA 有著高親和力的光敏DNA 染料[9]。PMA 可以選擇性穿過死菌破損細(xì)胞膜，在鎢燈強(qiáng)光照射下，PMA 的疊氮基團(tuán)生成的nitrene 基，在結(jié)合部位與DNA 中的碳?xì)溲蹑I結(jié)合生成穩(wěn)共價氮碳鍵，從而抑制了死菌DNA 擴(kuò)增，qPCR檢測中假陽性信號的產(chǎn)生[10]。PMA 比EMA 多一個正點荷，更加溫和、更難進(jìn)入活菌細(xì)胞膜[11]，近年來研究者更傾向用PMA 結(jié)合qPCR 技術(shù)研究活菌檢測。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于藥物活性檢測[12]、醫(yī)源及食源性病原菌檢測[13-14]、污水處理檢測[15]、植物病原菌檢測[16]等。對于利用PMA-qPCR 這一技術(shù)對植物病原菌進(jìn)行研究，已應(yīng)用于青枯菌（Pseudomonas solanacearum）[11]、十字花科黑斑病菌（Pseudomonas syringaepv.maculicola）[17]、梨火疫病菌（Erwinia amylovory）[9]、丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）[18]的活菌檢測等，但該技術(shù)對擴(kuò)展青霉菌活菌檢測及相關(guān)的研究較少。

因此，為了深入研究擴(kuò)展青霉菌活菌在蘋果上的遷移規(guī)律，本文將以產(chǎn)自新疆阿克蘇的紅富士蘋果為材料，人工接種擴(kuò)展青霉進(jìn)行常溫培養(yǎng)，改進(jìn)Crespo-Sempere 等[19]的PMA 處理方法，利用PMAqPCR 技術(shù)快速、準(zhǔn)確地對擴(kuò)展青霉活菌數(shù)進(jìn)行計數(shù)，為蘋果中擴(kuò)展青霉的防控提供了理論依據(jù)，為食品中擴(kuò)展青霉活菌檢測提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

擴(kuò)展青霉菌ACCC 31688 中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；紅富士蘋果（Malus domesticaBorkh.CV.Red Fuji） 同一批次的成熟的大小相近、無創(chuàng)傷，新疆烏魯木齊市；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；PMA 染料 北京百瑞極生物科技有限公司；真菌DNA 提取試劑盒、CTAB 緩沖液、蛋白酶K 溶液、RNase A 溶液、DNA 提取液、核酸提取液 北京索萊寶公司；2×Taq PCR MasterMixⅡ、2×SuperReal PreMix Plus 天根生化科技（北京）有限公司；異丙醇 分析醇，天津永晟精細(xì)化工有限公司。

取10 mL 稀釋好的孢子懸浮液放入水浴鍋，99.9 ℃水浴30 min 進(jìn)行熱滅活處理。取1 mL 經(jīng)熱滅活處理的孢子懸浮液涂布于PDA 培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)72 h，驗證滅活效果。PDA 培養(yǎng)基上無菌生長則認(rèn)為已完全滅活，可用于后續(xù)實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 霉菌孢子懸浮液配制 無菌條件下，向已培養(yǎng)7 d 的擴(kuò)展青霉菌的PDA 培養(yǎng)基中加入10 mL無菌水，利用無菌涂布器刮下真菌孢子，四層紗布過濾，將濾液轉(zhuǎn)至50 mL 錐形瓶中，旋渦30 s，使孢子分布均勻后加入無菌水進(jìn)行梯度稀釋。采用血球計數(shù)板法計算孢子濃度，最終將孢子懸浮液稀釋至4.0×107CFU/mL。

生物安全柜ESCO 生命科學(xué)集團(tuán)；霉菌培養(yǎng)箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Thermo Fisher Scientific 離心機(jī) 德國賀利氏公司；PCR 儀（SureCycle 8800） 安捷倫科技有限公司；實時熒光定量PCR儀（LightCycler? 96） 德國羅氏診斷有限公司。

2.2.2.1 藥劑拌種該病除選用上述技術(shù)原則外，還可用種子100kg，營養(yǎng)液5kg，溶入58%甲霜靈可濕性粉劑300g，（營養(yǎng)液可以用含微量元素葉面肥尿素、磷酸二氫鉀各100g代替）對種子均勻噴灑翻拌，悶種3h～4h，即可播種。有預(yù)防霜霉病和壯苗的雙重作用。

1.2.2 霉菌及蘋果樣品DNA 提取

1.2.2.1 霉菌DNA 提取 取500 μL 孢子懸浮液，12000 r/min 條件下離心2 min，棄上清，沉淀按照真菌DNA 提取試劑盒說明書提取DNA。檢測前放入-20 ℃保存。

1.2.2.2 蘋果樣品DNA 提取 參考Crespo-Sempere 等[19]的方法，根據(jù)樣品略有改動。取5 g 樣品（受擴(kuò)展青霉侵染的蘋果病斑）裝入50 mL 試管，加入5 mL 的磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）。勻質(zhì)3 min，4 層紗布過濾。將濾液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000 r/min 離心10 min，棄去上清。沉淀重懸于1 mL PBS 緩沖液后進(jìn)行PMA 處理。PMA 處理后，12000 r/min 離心2 min，棄去上清。

在開展施工安裝及施工后的模板拆除工作前，要讓工作人員參與安全技術(shù)交底中，申明施工操作中的各種規(guī)范，如要求工人持證件上崗，高空作業(yè)時做好安全措施，在危險區(qū)域設(shè)置安全標(biāo)示等。

1.2.3.3 曝光時間優(yōu)化 分別添加PMA 溶液于500 μL 濃度為4.0×107CFU/mL 的熱滅活孢子懸浮液，充分混勻，獲得PMA 最終濃度為10 μg/mL，隨后置于黑暗處孵育5 min，設(shè)置曝光時間分別為0、5、10、15 和20 min。之后步驟按1.2.3.1 進(jìn)行。

目前高師院校創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)的教師多由本校教師擔(dān)任，絕大多數(shù)教師不具備創(chuàng)業(yè)能力，創(chuàng)新意識也不夠強(qiáng)，對創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)的理解有待進(jìn)一步深化，他們在創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)課程教學(xué)中，主要偏重于創(chuàng)業(yè)理論的闡述、創(chuàng)業(yè)案例的分析，而未將注意力集中在師范生創(chuàng)新意識的培育上。此外，絕大多數(shù)高師院校教師認(rèn)為，師范生的創(chuàng)新意識的培育是創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)課程教師的任務(wù)。殊不知每門課程的教學(xué)都有責(zé)任去培育師范生的創(chuàng)新意識。全體高師院校的教師要轉(zhuǎn)變觀念，適應(yīng)新時代創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)發(fā)展的需求，除了要傳授師范生的知識、訓(xùn)練師范生的技能、培育師范生的職業(yè)情懷外，還要在課程教學(xué)中注重滲透培育師范生的創(chuàng)新意識。

1.2.3 PMA 處理條件優(yōu)化

1.2.3.1 PMA 濃度優(yōu)化 稱取1 mg PMA 加入1 mL的無菌水，制備濃度為2 mmol/L 的PMA 溶液，4 ℃儲存。取500 μL 濃度為4.0×107CFU/mL 的熱滅活孢子懸浮液，加入不同體積的PMA 溶液，使最終每管的PMA 濃度分別為0、5、10、15、20 和 25 μg/mL。充分混勻后黑暗孵育20 min，然后將試管放置冰上在鎢燈強(qiáng)光下照射10 min。12000 r/min 離心 2 min，棄上清，取沉淀提取孢子DNA，具體步驟同1.2.2.1。所提DNA 按照1.2.5 中的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行qPCR 檢測，獲得循環(huán)閾值（Cycle Threshold，Ct 值），根據(jù)Ct 值變化來研究能夠抑制死菌DNA 擴(kuò)增的PMA 最小濃度。同樣方法處理活孢子懸浮液，研究不影響活菌DNA 擴(kuò)增的PMA 最大濃度。

(2)第二個階段：從“校內(nèi)實踐環(huán)境”到“企業(yè)財務(wù)工作環(huán)境”。新經(jīng)濟(jì)環(huán)境對會計業(yè)務(wù)影響較大，如營改增等政策變化、新會計政策制訂和執(zhí)行都會影響到《中級財務(wù)會計》課程內(nèi)容。所以要了解企業(yè)最新的經(jīng)濟(jì)業(yè)務(wù)，使校內(nèi)實踐環(huán)境與企業(yè)財務(wù)工作環(huán)境結(jié)合更為密切。通過“引進(jìn)來”和“走出去”的方式，使企業(yè)專家、學(xué)校任課老師在實踐環(huán)節(jié)得到有效融合，也寒暑假社會實踐、頂崗實習(xí)等途徑來檢驗校內(nèi)實踐部分有效性，對實際崗位操作中出現(xiàn)的新趨勢、新內(nèi)容保持同步更新，防止校內(nèi)實踐教學(xué)內(nèi)容過于陳舊。

1.2.3.2 黑暗孵育時間優(yōu)化 分別添加PMA 溶液于500 μL 濃度為4.0×107CFU/mL 的熱滅活孢子懸浮液，充分混勻，使PMA 最終濃度為10 μg/mL，隨后置于黑暗處孵育。設(shè)置孵育時間分別為5、10、15、20 和25 min，黑暗孵育后放置冰上在鎢燈下照射10 min，之后步驟按1.2.3.1 進(jìn)行。

參考Tannous 等[7]的方法，根據(jù)實驗條件略做修改，提取沉淀DNA。將沉淀重懸于經(jīng)95 ℃預(yù)熱100 μL 無菌水中并在冰上放置10 min。加入500 μL CTAB 緩沖液，10 μL 蛋白酶K 溶液，65 ℃水浴1 h，4 ℃條件下13000 r/min 離心10 min。吸取上清，加等體積的DNA 提取液（酚/氯仿/異戊醇25:24:1）靜置5 min，4 ℃條件下1000 r/min 離心20 min。吸取上清，加入10 μL RNase A 溶液（10 mg/mL），37 ℃恒溫水浴1 h。水浴后，加等體積的核酸提取液（氯仿/異戊醇24:1），4 ℃條件下13000 r/min 離心5 min。取上清液用等體積的異丙醇-20 ℃沉淀過夜。4 ℃條件下13000 r/min 離心20 min，棄去上清，沉淀中加入500 μL 的75%乙醇進(jìn)行洗脫，12000 r/min 離心5 min，重復(fù)洗脫2 次。棄上清，加入室溫干燥5～10 min，加入30 μL 的dd H2O，-20 ℃保存。

1.2.4 引物選擇及驗證 實驗所用的4 種引物均參考已發(fā)表文獻(xiàn)，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳情見表1。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 參考Crespo-Sempere 等[19]的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，略有改動。挑選無病害的蘋果，用清水清洗，75%酒精消毒，晾干后打漿。取5 g樣品裝入50 mL 試管，加入5 mL 的PBS 緩沖液。配制106CFU/mL 的擴(kuò)展青霉孢子懸浮液，加入無菌水梯度稀釋至濃度為105、104、103CFU/mL。加入孢子懸浮液，使樣品中孢子最終濃度達(dá)到105、104、103、102CFU/mL。按照1.2.2.2 提取DNA，通過qPCR測定對應(yīng)的Ct 值，反應(yīng)體系參照1.2.5，重復(fù)3 次。建立菌落濃度（log10CFU/mL）與Ct 值之間的線性關(guān)系，并通過公式E=10-1/s-1 計算擴(kuò)增效率，其中s 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.2.7 人工染菌樣品活菌檢測 用清水清洗蘋果晾干后，用75%酒精擦拭表面。用滅菌過的移液槍頭在每個蘋果赤道部位對稱刺2 個直徑2～3 mm、深度5～7 mm 的傷口，每個傷口接種10 μL 孢子懸浮液（1.0×105CFU/mL），待孢子懸浮液晾干后，放入經(jīng)紫外滅菌的紙箱中。在室溫條件下培養(yǎng)3 d 后，以病斑為中心，分別取外擴(kuò)0.5、1、2 cm 處蘋果組織為樣品（如圖1 所示）。取1 g 樣品參照尉冬梅等[23]的方法進(jìn)行平板菌落計數(shù)。

以所提的擴(kuò)展青霉菌DNA 作為模板，各引物經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳法驗證擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及引物的特異性，PCR 反應(yīng)體系詳情見表2。PCR 總共35 個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃預(yù)熱 4 min，94 ℃變性30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃最后延伸10 min。

預(yù)制裝配式混凝土結(jié)構(gòu)有多種形式，如剪力墻結(jié)構(gòu)，框架結(jié)構(gòu)，框架剪力墻結(jié)構(gòu)和部分框架剪力墻結(jié)構(gòu)。由于預(yù)制裝配式結(jié)構(gòu)的預(yù)制構(gòu)件全部通過連接節(jié)點連接，所以混凝土結(jié)構(gòu)在大范圍內(nèi)尚未廣泛使用。與傳統(tǒng)建筑方法相比，預(yù)制建筑物具有更多的連接界面和接縫，而裝配式混凝土結(jié)構(gòu)中的節(jié)點是裝配式建筑的薄弱環(huán)節(jié)，在連接節(jié)點的處理問題上，國內(nèi)的技術(shù)手段目前并不是很成熟。但裝配式建筑結(jié)構(gòu)在環(huán)保、節(jié)能和施工上與現(xiàn)澆相比優(yōu)點比較突出。

普通工頻電機(jī)在正常運行時產(chǎn)生的軸電流大多是由于磁路不對稱，主要表現(xiàn)為低頻循環(huán)電流。變頻電機(jī)會額外增加軸電流的來源，主要是受變頻器共模電壓的影響，表現(xiàn)為高頻循環(huán)電流、容性共模電流及放電電流、軸與機(jī)座電位差產(chǎn)生的脈沖式容性電流。在大型電機(jī)設(shè)計時，需盡量減少磁路的不對稱，從源頭上遏制軸電流的產(chǎn)生。同時，當(dāng)機(jī)組中含有電機(jī)尤其是變頻電機(jī)時，需要特別注意整個機(jī)組對軸電流的預(yù)防措施，這樣才能保證機(jī)組平穩(wěn)、可靠、安全運行。

1.2.5 擴(kuò)展青霉菌熒光定量PCR 實驗 選取實驗1.2.4 選擇出特異性最好的引物按照表3 中的體系用實時熒光定量PCR 儀進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。熱循環(huán)條件為：95 ℃作用3 min，40 個循環(huán)95 ℃作用20 s，65 ℃作用20 s（在此期間測量熒光），57～95 ℃繪制熔解曲線，升溫速率為1 ℃/min。

所有實驗均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用OriginPro 2019 作圖，Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，IBM SPSS Statistics 23 軟件進(jìn)行單因素ANOVA 檢驗及獨立樣本t檢驗分析差異顯著性。

圖1 蘋果取樣示意圖Fig.1 Sampling diagram of apple

冰浴研磨后，稱取5g 樣品裝入50 mL 試管，加入5 mL PBS 緩沖液。勻質(zhì)3 min，4 層紗布過濾。將濾液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000 r/min 離心10 min，棄去上清。沉淀中加入1 mL PBS 緩沖液，按照優(yōu)化后的PMA 處理條件進(jìn)行處理。按照1.2.2.2 的方法提取樣品DNA 后，進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件及體系同1.2.5。所有DNA 樣品在qPCR 檢測之前都經(jīng)過常規(guī)PCR 和凝膠電泳檢測，以防后期因蘋果DNA樣品問題出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基于以上分析，廣西大學(xué)行健文理學(xué)院專創(chuàng)融合的市場營銷專業(yè)師資隊伍的建設(shè)已有較好的基礎(chǔ)，未來應(yīng)有效利用面臨的機(jī)遇充分發(fā)揮挖掘現(xiàn)有優(yōu)勢、彌補不足，同時盡力以優(yōu)勢去迎接挑戰(zhàn)。以科學(xué)發(fā)展觀主動適應(yīng)經(jīng)濟(jì)新常態(tài)發(fā)展、區(qū)域經(jīng)濟(jì)、產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型升級的需求，堅持復(fù)合應(yīng)用型市場營銷人才培養(yǎng)的辦學(xué)理念，深化有地域特色的專創(chuàng)融合的師資隊伍的打造。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMA 條件優(yōu)化

2.1.1 PMA 濃度優(yōu)化 添加不同濃度的PMA 對擴(kuò)展青霉熱滅活孢子懸浮液和活孢子懸浮液進(jìn)行處理，研究不同濃度PMA 對擴(kuò)展青霉熱滅活孢子和活孢子qPCR 擴(kuò)增的影響。圖2 結(jié)果顯示使用PMA 溶液能夠明顯抑制熱滅活擴(kuò)展青霉的DNA 擴(kuò)增，當(dāng)PMA 濃度=0 時，Ct 值與PMA 處理組Ct 值具有顯著差異（P＜0.05）；當(dāng)PMA 濃度＜10 μg/mL 時，Ct 值隨著PMA 濃度增加而增大，這說明低濃度的PMA不能完全抑制熱滅活孢子DNA 擴(kuò)增；當(dāng)PMA 濃度＞10 μg/mL 時，Ct 值不存在顯著差異（P＞0.05），說明10 μg/mL 的PMA 能完全與熱滅活孢子DNA 結(jié)合，并完全抑制熱滅活孢子DNA 擴(kuò)增。不同濃度的PMA 對活孢子進(jìn)行處理，對活孢子qPCR 擴(kuò)增無顯著抑制作用（P＞0.05）。故選10 μg/mL 為最佳PMA處理濃度。

圖2 不同濃度PMA 處理對擴(kuò)展青霉熱滅活及活孢子qPCR 擴(kuò)增的影響Fig.2 Effects of different concentrations of PMA treatment on the qPCR amplification of Penicillium expansum dead spores and live spores

2.1.2 黑暗孵育時間優(yōu)化 如圖3 所示，黑暗孵育處理5、10、15、20 和25 min 的Ct 值無顯著差異（P＞0.05），說明黑暗孵育5 min 時PMA 就能夠完全與熱滅活孢子DNA 結(jié)合，抑制熱滅活孢子DNA 的擴(kuò)增；同時不同黑暗孵育處理，對活孢子DNA 擴(kuò)增并無顯著抑制作用（P＞0.05），說明黑暗處理5～25 min均不會對活孢子產(chǎn)生毒性，且不會影響活孢子DNA的擴(kuò)增，黑暗孵育5 min 處理能夠抑制熱滅活孢子DNA 的擴(kuò)增，但不影響活孢子DNA 的擴(kuò)增，故選5 min 為最佳黑暗孵育時間。

3)γCa/γCl系數(shù)。由表3的γCa/γCl系數(shù)結(jié)果可知，所有的水樣的γCa/γCl都較大。充分說明了榆林市礦區(qū)第四系潛水含水層水動力條件較好，更新循環(huán)較好，導(dǎo)致Cl-含量相對較低。

圖3 不同黑暗孵育時間處理對擴(kuò)展青霉熱滅活及活孢子qPCR 擴(kuò)增的影響Fig.3 Effects of different dark incubation time treatments on the qPCR amplification of Penicillium expansum dead and live spores

2.1.3 曝光時間優(yōu)化 如圖4 所示，使用PMA 對擴(kuò)展青霉熱滅活孢子進(jìn)行處理，曝光時間＜10 min 時，Ct 值會隨著曝光時間的增加而增大，說明不足的曝光時間，不能使殘留的PMA 充分光解，從而不能完全抑制熱滅活孢子DNA 擴(kuò)增；當(dāng)曝光時間＞10 min時，Ct 值無顯著差異（P＞0.05），說明曝光10 min 就能夠使殘留的PMA 充分光解。使用PMA 處理擴(kuò)展青霉活菌處理，不同的曝光時間組的Ct 值無顯著差異（P＞0.05），說明不同的曝光時間并不影響活孢子DNA 擴(kuò)增。故選10 min 為最佳曝光時間。

圖4 不同曝光時間處理對擴(kuò)展青霉熱滅活及活孢子qPCR 擴(kuò)增的影響Fig.4 Effects of different exposure time treatments on qPCR amplification of Penicillium expansum dead and live spores

本研究最終發(fā)現(xiàn)10 μg/mL 為PMA 最佳濃度，5 min 為最佳黑暗孵育時間，10 min 為最佳曝光時間，與于璇等[17]設(shè)計檢測十字花科黑斑病原菌的最佳處理條件一致，與王帥等[11]建立的青枯菌PMAqPCR 檢測的最佳處理條件（PMA 濃度為15 ng/μL、黑暗孵育處理10 min、曝光處理5 min）不同。兩種方法的處理條件不同可能是菌種品類不同、PMA 產(chǎn)品不同、鎢燈型號不同所致[9]。

2.2 引物特異性

通過對各引物PCR 擴(kuò)增、凝膠電泳驗證，結(jié)果（圖5）顯示Pexp-patF引物擴(kuò)增出的片段大小與Tannous 等[7]方法中擴(kuò)增片段大小一致，為92 bp，且其只產(chǎn)生一條帶，并無引物二聚體的存在，與本實驗所用菌株基因特異性結(jié)合，特異性最強(qiáng)，而PG、POL、HHJ等3 個引物擴(kuò)增產(chǎn)物為多個條帶，另外，對Pexp-patF進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，觀察反應(yīng)熔解曲線在熔解溫度（Melting Temperature，Tm）為87.4 ℃時有單一的熔解峰，無引物二聚體和非特異性出現(xiàn)（圖6），因此，Pexp-patF可以用于后期PMA-qPCR實驗。Pexp-patF是Tannous 等[7]通過展青霉素合成調(diào)控基因PatF所設(shè)計，PatF基因是調(diào)控新棒曲霉素合成酶的基因，展青霉素合成的中間物質(zhì)葉點霉素在新棒曲霉素合成酶作用下會生成新棒曲霉素，新棒曲霉素在乙醇脫氫酶、葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶的作用下最終轉(zhuǎn)化為展青霉素[24]，這可能是PexppatF能夠與擴(kuò)展青霉基因結(jié)合、且特異性良好的原因。PG引物實驗所用菌株是從腐爛柑橘中分離，POL菌株來源于加拿大國家食品安全研究所，HHJ菌株來源于中國微生物中國普通微生物菌種保藏管理中心中分離均與該實驗所用菌株不同。PG、POL、HHJ引物沒有跟本實驗所用擴(kuò)展青霉基因特異性結(jié)合可能與引物設(shè)計所用擴(kuò)展青霉的菌株與本實驗不同所致。以后的引物設(shè)計中，可選擇菌種的合成代謝物基因來設(shè)計引物，從而設(shè)計出具有更高的特異性的引物用于qPCR 檢測中，能夠減少假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，并提高檢測的準(zhǔn)確性。

圖5 4 對引物qPCR 擴(kuò)增擴(kuò)展青霉DNA 結(jié)果Fig.5 qPCR amplification electrophoresis results by 4 pairs of primers with P. expansum DNA

圖6 擴(kuò)展青霉DNA 與Pexp-patF qPCR 反應(yīng)熔解曲線Fig.6 Melting curve of P. expansum DNA reaction with Pexp-patF qPCR

2.3 PMA-qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限的評價

利用擴(kuò)展青霉孢子懸浮液梯度稀釋進(jìn)行PMAqPCR 擴(kuò)增，菌落濃度與Ct 值的相關(guān)性如圖7 所示。兩者之間具有良好的線性相關(guān)關(guān)系，y=-2.023x+35.925，R2=0.9948，標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。經(jīng)計算PMA-qPCR 擴(kuò)增效率（E）為90%。檢測限（Limit of Detection，LOD）通過公式Ct（LOD）=Ct（空白）–3 計算[25]，為102.6CFU/mL。該檢測限比王銀環(huán)等[26]利用PMA-qPCR 對地衣芽孢桿菌活菌制品中金黃色葡萄球菌最低檢測限（104CFU/mL）低，與Crespo-Sempere 等[19]建立的PMA-qPCR 檢測人工接種番茄樣品中鏈格孢菌檢出限（102CFU/g）類似。與Frisch 等[27]優(yōu)化的一種環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增檢測擴(kuò)展青霉的方法的檢測下限（103CFU/mL）相比較，本研究采用的PMA-qPCR 檢測擴(kuò)展青霉檢出限更低，具有更高的靈敏度。

圖7 PMA-qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 PMA-qPCR standard curve

2.4 人工染菌蘋果樣品活菌檢測

對人工接種擴(kuò)展青霉蘋果樣品進(jìn)行PMA-qPCR檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算人工染菌蘋果樣品中擴(kuò)展青霉活菌數(shù)。結(jié)果如表4 和圖8 所示，PMA-qPCR 檢測出人工污染3 d 后病斑處擴(kuò)展青霉活菌數(shù)已達(dá)到1.61×106CFU/g，平板菌落計數(shù)按照國標(biāo)進(jìn)行計數(shù)[28]結(jié)果為1.4×106CFU/g。距離病斑0.5、1 cm 處，PMA-qPCR 檢測出結(jié)果及平板菌落計數(shù)法檢測出活菌。這與Wei 等[5]利用平板菌落計數(shù)方法發(fā)現(xiàn)當(dāng)病斑直徑為1 cm 時仍可在距病斑2 cm 處檢測出擴(kuò)展青霉活菌類似，這結(jié)果再次驗證了擴(kuò)展青霉菌會向未腐爛組織遷移。距離病斑2 cm 處提取的DNA 未檢測出熒光信號，含量低于最低檢測線，同時平板菌落計數(shù)法結(jié)果小于10。兩者方法結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗，無顯著差異，這一發(fā)現(xiàn)與Dias 等[29]的結(jié)果一致，這證明該本實驗方法結(jié)果可靠，可利用PMA-qPCR來檢測定量擴(kuò)展青霉活菌。在實際操作過程中，PMA-qPCR 具有顯著的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的平板菌落計數(shù)需將樣品稀釋液與未凝固培養(yǎng)基混合均勻后，凝固倒置培養(yǎng)。若培養(yǎng)基溫度過高會燙死原本活的孢子，從而影響結(jié)果。除此之外，樣品的破碎不均勻、環(huán)境污染都會影響平板菌落計數(shù)的結(jié)果，然而利用PMAqPCR 技術(shù)檢測則會很好地避免這些影響因素。傳統(tǒng)的平板菌落計數(shù)法需花費3～4 d 進(jìn)行菌落培養(yǎng)，而PMA-qPCR 僅需花1 d 時間便可得到準(zhǔn)確結(jié)果。與平板菌落計數(shù)這一傳統(tǒng)活菌檢測手段相比PMAqPCR 檢測更便捷，且具有高度敏感性和特異性[30]。

圖8 人工染菌蘋果樣品PMA-qPCR 檢測結(jié)果Fig.8 PMA-qPCR detection results of artificially infected apple samples

表4 人工染菌樣品 PMA-qPCR 結(jié)果與平板法計數(shù)比較Table 4 Comparison of PMA-qPCR results and plate counts results of artificially infected samples

3 結(jié)論

PMA-qPCR 能夠彌補PCR、qPCR 不能檢測活菌的缺陷，同時比傳統(tǒng)平板菌落計數(shù)方法更快捷，且具有特異性。本實驗根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)篩選特異引物并優(yōu)化PMA 的處理條件，最終建立了以10 μg/mL PMA、黑暗孵育5 min、曝光處理10 min 為最優(yōu)處理條件的PMA-qPCR 檢測擴(kuò)展青霉活菌方法，該方法具有較高的靈敏性和可靠性，能夠快速檢測出樣品中的擴(kuò)展青霉活菌數(shù)，最低檢測限為102.6CFU/mL。將其應(yīng)用到人工染菌樣品活菌檢測，其結(jié)果與傳統(tǒng)的平板菌落計數(shù)結(jié)果無明顯差異，并且在未腐爛的蘋果組織中發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展青霉活菌。未來將該方法應(yīng)用于食品加工檢測中，可進(jìn)一步降低人們暴露在展青霉素的潛在危險，為擴(kuò)展青霉防控提供一種新的技術(shù)支持。但本研究中樣品DNA 提取步驟較為繁瑣，花費時間較長，后期可優(yōu)化樣品DNA 提取方法，從而提高PMA-qPCR 檢測擴(kuò)展青霉活菌的便捷性。