酸棗仁不同極性部位成分含量與抗氧化活性及其相關(guān)性分析

周文文，劉 暉，徐志佳，肖鳳琴，李 波，楊亦柳，李光哲, ，嚴(yán)銘銘,2,

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130117；2.吉林省中藥保健食品科技創(chuàng)新中心，吉林長(zhǎng)春 130117）

氧化應(yīng)激（Oxidative stress，OS）是指各種因素造成的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）生成過(guò)量或降解減少，導(dǎo)致體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，具體表現(xiàn)為當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激態(tài)時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，如超氧化物自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）、一氧化氮自由基（·NO）、單線態(tài)氧（1O2）和過(guò)氧化氫（H2O2）等，攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 等生物大分子[1]。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間處于氧化應(yīng)激會(huì)造成機(jī)體氧化損傷[2]，最終誘導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生，導(dǎo)致各類(lèi)慢性疾病及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和惡化[3]。

酸棗仁是鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，味酸、甘，平，微溫，具有養(yǎng)肝寧心，鎮(zhèn)定安神，斂汗生津等作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁在改善睡眠、抗抑郁、增強(qiáng)免疫力、改善記憶、抗氧化方面具有良好的藥理活性[5]，臨床上常被用于治療失眠等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。現(xiàn)代研究表明酸棗仁中富含有多種有效活性成分，包括黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、脂肪酸、生物堿以及其他生物物質(zhì)等120 多種成分[6]，其中黃酮類(lèi)[7]、皂苷類(lèi)[8]、酚酸類(lèi)[9]是酸棗仁發(fā)揮抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，可通過(guò)清除自由基、提高抗氧化酶活性等途徑發(fā)揮一定的抗氧化作用，進(jìn)而發(fā)揮疾病預(yù)防以及治療作用[10]。同時(shí)，酸棗中礦物質(zhì)、多糖、膳食纖維的含量也非常豐富，有很高的食用價(jià)值。酸棗仁因其具有良好的食品功能特性被廣泛應(yīng)用于功能性食品的研究與開(kāi)發(fā)中[11]，如酸棗仁果汁飲品等[12]，屬于藥食同源資源。

目前，臨床對(duì)于酸棗仁抗氧化活性的研究多基于酸棗仁單體，有關(guān)酸棗仁不同極性部位抗氧化活性的研究?jī)?nèi)容較少，且對(duì)于酸棗仁不同極性部位成分含量對(duì)其抗氧化活性的影響尚未見(jiàn)研究報(bào)道。因此本研究通過(guò)運(yùn)用偏最小二乘回歸分析法（PLS）對(duì)酸棗仁不同極性部位的成分含量及抗氧化活性進(jìn)行研究，解釋其內(nèi)在的相關(guān)性，旨在篩選出最佳活性部位，明確酸棗仁發(fā)揮抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。為酸棗仁抗氧化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁藥材飲片（產(chǎn)地：山西、批號(hào)：50918006、執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：《中國(guó)藥典》2020 年版一部、生產(chǎn)企業(yè)：河北仁心藥業(yè)有限公司） 吉林省仙草醫(yī)藥藥材有限公司；石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、H2O2、過(guò)硫酸鉀 分析純，北京化工廠；沒(méi)食子酸（批號(hào)：110831-200302）、蘆?。ㄅ?hào)：100080-200707）、酸棗仁皂苷A（批號(hào)：110734-201713）、斯皮諾素（批號(hào)：111869-201704）標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；DPPH、ABTS 上海麥克林生化科技有限公司；DME/F-12 1:1（1X）培養(yǎng)基、FBS（胎牛血清）、P/S（青鏈霉素雙抗溶液）、0.25%胰蛋白酶溶液、二甲基亞砜、1×PBS（磷酸鹽緩沖液） 美國(guó)Gibco 公司；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y） 武漢普諾賽生命科技有限公司；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

AB265-S 型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DT2000 電子天平 美國(guó)奧豪斯儀器有限公司；KQ-250B 型超聲波清洗器 江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市佳美儀器有限公司；DZF-6053 真空干燥箱上海市一恒科學(xué)儀器有限公司；DZTW 型電子調(diào)溫電熱套 北京市光明醫(yī)療儀器有限公司；UV-1700型紫外分光光度計(jì) 日本島津有限公司；Infinite M200PRO 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀 瑞士Tecan 有限公司；CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo 有限公司；SHIMADZU 2010A 型高效液相色譜儀 日本島津有限公司；Alltech ELSD 6000 型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 美國(guó)奧泰有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸棗仁不同溶劑部位獲取 采用傳統(tǒng)的水煎煮法，取酸棗仁飲片，置于圓底燒瓶中，加入10 倍量蒸餾水，加熱煮沸、回流提取2 次，每次2 h。過(guò)濾，合并濾液，將提取液濃縮至50 mL。依次使用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取體積比為1:1，振搖1 min，靜置20 min 后將有機(jī)層收集至蒸發(fā)皿，每種溶劑萃取三次，合并萃取液，揮干溶劑后分別得水提取物S1（出膏率23.4%）、石油醚萃取物S2（出膏率1.2%）、氯仿萃取物S3（出膏率0.9%）、乙酸乙酯萃取物S4（出膏率2.6%）、正丁醇萃取物S5（出膏率3.3%）。

1.2.2 酸棗仁不同極性部位主要成分含量測(cè)定方法1.2.2.1 總多糖測(cè)定 參照萬(wàn)曉瑩等[13]的方法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，取樣品0.2 mL 于10 mL 比色管中，加蒸餾水補(bǔ)至2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混勻，加入濃硫酸5 mL，混勻；37 ℃加熱30 min，立即轉(zhuǎn)入冷水浴中冷卻至室溫，在488 nm 測(cè)定吸光度值A(chǔ)。制備得回歸方程為y=5.7093x-0.0426（R2=0.9994），以此計(jì)算樣品中總多糖含量。

1.2.2.2 總皂苷測(cè)定 參考崔小芳[14]的方法，以酸棗仁皂苷A 為標(biāo)準(zhǔn)品，取各樣品50 μL 于10 mL 比色管中，60 °C 水浴揮干，加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，混勻，于60 °C 恒溫水浴加熱15 min，取出。迅速冷卻，加冰醋酸5 mL，搖勻。在472 nm 下測(cè)定吸光度值A(chǔ)。制備得回歸方程為y=3.8374x-0.0022（R2=0.9994），以此計(jì)算樣品中總皂苷含量。

1.2.2.3 總黃酮測(cè)定 參考Kurkina 等[15]的方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，取各樣品1 mL 于10 mL 比色管中，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，混勻，靜置6 min，再加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，混勻，靜置6 min，再加入4% NaOH 溶液4.0 mL 混勻后靜置15 min，最后用80%乙醇定容至10 mL。在510 nm 下測(cè)定吸光度值A(chǔ)。制備得回歸方程為y=1.2446x-0.0079（R2=0.9992），以此計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.2.2.4 總酚酸測(cè)定 參考楊勇等[16]的方法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，取各樣品0.5 mL 于10 mL 比色管中，加入福林酚試劑0.5 mL，混勻，6 min 后再加入20% Na2CO3溶液1.5 mL，混勻，用蒸餾水稀釋至10 mL，室溫下反應(yīng)2 h（避光）。在743 nm 下測(cè)定吸光度值A(chǔ)。制備得回歸方程為y=10.412x+0.059（R2=0.9979），以此計(jì)算樣品中總酚酸含量。

1.2.2.5 酸棗仁皂苷A 含量測(cè)定 參考2020 版《中國(guó)藥典》一部酸棗仁項(xiàng)下的含量測(cè)定方法[17]，以酸棗仁皂苷A 為標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC 法測(cè)定樣品中酸棗仁皂苷A 含量，色譜柱為Apollo-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。取酸棗仁皂苷A 對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液，即得酸棗仁皂苷A 標(biāo)準(zhǔn)品溶液；精密稱(chēng)量5 種提取物各1 g，放入具塞錐形瓶中，精密量取50 mL 色譜甲醇加入錐形瓶中，超聲處理30 min 后，用甲醇補(bǔ)重。吸取1 mL，用0.22 μm 微孔膜過(guò)濾，即所得供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液5、20 μL，供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，測(cè)定各樣品中酸棗仁皂苷A 含量。

1.2.2.6 斯皮諾素含量測(cè)定 參考2020 版《中國(guó)藥典》一部酸棗仁項(xiàng)下斯皮諾素含量測(cè)定的方法[17]，以斯皮諾素為標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC 法測(cè)定樣品中斯皮諾素含量，色譜柱為Apollo-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。取斯皮諾素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液，即得斯皮諾素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密稱(chēng)量5 種提取物各1 g，放入具塞錐形瓶中，精密量取50 mL 色譜甲醇加入錐形瓶中，超聲處理30 min 后，用甲醇補(bǔ)重。吸取1 mL，用0.22 μm 微孔膜過(guò)濾，即得供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定各樣品中斯皮諾素含量。

1.2.3 抗氧化能力測(cè)定 樣品預(yù)處理：分別取各樣品稱(chēng)量0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg，溶于1 mL 蒸餾水中，超聲30 min，12000 r/min 離心10 min，取上清液作為待測(cè)溶液。

1.2.3.1 超氧陰離子清除率測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法[18]。Tris-HCl（50 mmol/L，pH8.2）和鄰苯三酚溶液（濃度為6 mmol/L）于25 ℃預(yù)熱20 min。在96 孔板中加入150 μL Tris-HCl、30 μL 樣品溶液、30 μL 預(yù)熱過(guò)的鄰苯三酚，25 ℃保溫4 min，加20 μL濃鹽酸，于420 nm 處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1。以蒸餾水替代樣品溶液作為A0。以蒸餾水代替鄰苯三酚作為樣品對(duì)照A2。按下式計(jì)算超氧陰離子的清除率：

1.2.3.2 羥基自由基清除率測(cè)定 采用水楊酸法[19]測(cè)定對(duì)羥基自由基的作用，取96 孔板，每孔分別加入50 μL 樣品、50 μL 硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L）、50 μL 過(guò)氧化氫（6 mmol/L），于37 ℃恒溫加熱10 min 后加入50 μL 水楊酸（6 mmol/L），于37 ℃恒溫加熱30 min 后在510 nm 處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1。以蒸餾水代替樣品液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)0；以1 mL 蒸餾水代替過(guò)氧化氫溶液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2。羥基自由基清除率計(jì)算公式同1.2.3.1。

1.2.3.3 DPPH 自由基清除率測(cè)定 參照陳冰丹等[20]的實(shí)驗(yàn)方法，在96 孔板中，每孔加入100 μL 樣品水溶液，100 μL DPPH 溶液，于暗室反應(yīng)30 min，在517 nm 處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1；以甲醇代替DPPH 溶液作為樣品對(duì)照組，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2；以蒸餾水代替樣品液作為空白對(duì)照組，測(cè)定吸光度值A(chǔ)0。DPPH 自由基清除率計(jì)算公式同1.2.3.1。

1.2.3.4 ABTS+自由基清除率測(cè)定 參照羌宇等[21]的實(shí)驗(yàn)方法，將2 mL 7.4 mmol/L ABTS 儲(chǔ)備液與35.2 μL 2.6 mmol/L K2S2O8混勻，靜置12～16 h，配成ABTS 工作液。取1 mL ABTS 工作液，用pH 為7.4 的PBS 溶液稀釋?zhuān)笤诔叵?34 nm 處吸光值為0.7±0.2。將0.2 mL ABTS 工作液與10 μL 不同濃度樣品混合，常溫避光反應(yīng)6 min，在734 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，平行3 次。ABTS+自由基清除能力由下式計(jì)算：

式中，A1為樣品+ABTS 溶液吸光度值，A0為PBS 溶液+ABTS 溶液的吸光度。

1.2.3.5 對(duì)H2O2所致SH-SY5Y 細(xì)胞氧化損傷保護(hù)能力測(cè)定 參考張妹等[22]方法，采用DME/F-12 1:1 培養(yǎng)基（10% FBS，1% P/S）培養(yǎng)SH-SY5Y 細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y 細(xì)胞以5×103個(gè)/孔均勻接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，分別稱(chēng)取S1、S2、S3、S4、S5，溶于培養(yǎng)基中，按生藥量記母液濃度為1.2 g/L，用培養(yǎng)基稀釋至5、10、20、40、60 mg/L，每孔給藥10 μL。用酸棗仁不同提取部位對(duì)細(xì)胞預(yù)保護(hù)6 h，再與250 μL H2O2共同作用于SH-SY5Y 細(xì)胞株24 h 后，采用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用方差分析進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用皮爾遜法進(jìn)行相關(guān)性分析；運(yùn)用SPSS 26.0 進(jìn)行偏最小二乘回歸分析[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗仁不同極性部位成分含量分析結(jié)果

酸棗仁皂苷A、斯皮諾素含量測(cè)定HPLC 色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。由表1 可知，在五種不同極性萃取部位中，總黃酮、總皂苷、酸棗仁皂苷A、斯皮諾素在S5 萃取部位中成分含量最高，分別為（23.18±0.20）、（21.62±0.23）、（0.3119±0.017）、（0.70±0.024）mg/g，根據(jù)相似相溶原理，說(shuō)明酸棗仁中所含有的總黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、酸棗仁皂苷A、斯皮諾素被中強(qiáng)極性（正丁醇）溶劑富集,可能是因?yàn)檫@些物質(zhì)屬于中強(qiáng)極性物質(zhì)；總酚酸、總多糖在S1 萃取部位成分含量最高，分別為（7.52±0.09）、（17.40±0.47）mg/g，說(shuō)明酸棗仁中所含有的酚酸、多糖類(lèi)化學(xué)物質(zhì)可被強(qiáng)極性（水）溶劑富集，推測(cè)這些物質(zhì)屬于強(qiáng)極性物質(zhì)。

表1 酸棗仁不同極性部位成分含量Table 1 Contents of components in different polar parts of Semen Ziziphi Spinosae

圖1 酸棗仁皂苷A 高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of jujuboside A

圖2 斯皮諾素高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of spinozol

2.2 酸棗仁不同極性部位的抗氧化活性

2.2.1 酸棗仁不同極性部位對(duì)DPPH 自由基的清除作用 由表2 可知，酸棗仁不同極性部位提取物對(duì)DPPH 自由基均有一定的清除能力。隨著濃度的增加，不同提取物對(duì)DPPH 自由基清除率與其濃度呈良好的線性正相關(guān)關(guān)系。在相同濃度下不同極性部位對(duì)DPPH 自由基清除能力大小順序?yàn)椋篤C＞S5＞S1＞S2＞S3＞S4，其中在濃度為1.2 mg/mL 時(shí)，S5 萃取部位對(duì)DPPH 自由基清除能力最強(qiáng)，為87.94%，接近于陽(yáng)性對(duì)照組VC的清除能力。這可能是由于在酸棗仁S5 萃取部位中總黃酮類(lèi)、總皂苷類(lèi)化學(xué)物質(zhì)成分含量較高，DPPH 自由基可與其很好地結(jié)合，因此對(duì)DPPH 自由基的清除能力較強(qiáng)。該結(jié)果與謝紅[24]酸棗仁皂苷體外抗氧化活性研究結(jié)果一致，具有一定科學(xué)性。表明酸棗仁S5 萃取部位對(duì)DPPH 自由基有較強(qiáng)的清除能力。

表2 酸棗仁不同極性部位對(duì)DPPH 自由基清除能力Table 2 Ability of different polar parts of Semen Ziziphi Spinosae to remove DPPH free radicals

2.2.2 酸棗仁不同極性部位對(duì)ABTS+自由基的清除作用 提取物溶液加入ABTS+自由基溶液后，ABTS+自由基溶液會(huì)與提取物抗氧化成分發(fā)生反應(yīng)，生成穩(wěn)定化合物，溶液褪色，因此說(shuō)明清除能力越好抗氧化活性越高[25]。由表3 可知，酸棗仁不同極性部位提取物對(duì)ABTS+自由基均有較強(qiáng)的清除作用，且在0.2～1.2 mg/mL 范圍內(nèi)時(shí)，酸棗仁不同極性部位提取物對(duì)ABTS+自由基清除活性隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。在相同濃度下不同極性部位對(duì)ABTS+自由基清除能力大小順序?yàn)椋篤C＞S5＞S1＞S4＞S3＞S2，其中濃度為1.2 mg/mL 時(shí)，S5 萃取部位對(duì)ABTS+自由基清除率最高，為93.25%±0.74%，接近于VC標(biāo)準(zhǔn)品。表明S5 萃取部位具有較強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力，可以進(jìn)一步地研究開(kāi)發(fā)。

表3 酸棗仁不同極性部位對(duì)ABTS+自由基的清除能力Table 3 Ability of different polar parts of Semen Ziziphi Spinosae to remove ABTS+ free radicals

2.2.3 酸棗仁不同極性部位對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用 由表4 可知，在0.2～1.2 mg/mL 范圍內(nèi)，酸棗仁不同極性部位提取物對(duì)超氧陰離子自由基清除率與其濃度呈較好的正相關(guān)關(guān)系。其中，S5 萃取物清除能力最強(qiáng)，相同濃度下優(yōu)于及其他萃取物，當(dāng)濃度達(dá)到1.2 mg/mL 時(shí)具有最高清除活性，清除率為64.27%±0.31%；對(duì)超氧陰離子自由基清除能力較差的為S2 與S1，在濃度1.2 mg/mL 時(shí)清除率僅為36.43%±0.20%、55.33%±0.52%。該結(jié)果可能與正丁醇萃取物中的黃酮類(lèi)成分具有活潑的酚羥基，在遇到活性氧自由基時(shí)，易失去酚羥基上的氫，具有直接清除或淬滅超氧陰離子、羥基自由基、H2O2等活性氧、自由基的作用有關(guān)[26]。

表4 酸棗仁不同極性部位對(duì)超氧陰離子自由基清除能力Table 4 Removal ability of superoxide anion free radicals in different polar parts of Semen Ziziphi Spinosae

2.2.4 酸棗仁不同極性部位羥基自由基分析結(jié)果由表5 可知，酸棗仁不同極性部位提取物對(duì)羥基自由基有良好清除能力，且在0.2～1.2 mg/mL 范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加清除能力逐漸增強(qiáng)。在相同濃度下不同極性部位對(duì)羥基自由基清除能力大小順序?yàn)椋篤C＞S5＞S1＞S4＞S3＞S2，其中，在1.2 mg/mL 時(shí)，S5 的清除能力最強(qiáng)，為78.86%±0.45%，接近于VC標(biāo)準(zhǔn)品。以上研究結(jié)果表明，酸棗仁不同極性部位均具有一定的羥基自由基清除能力，其中S5 萃取部位效果最好。

表5 酸棗仁不同極性部位的羥基自由基清除能力Table 5 Removal ability of hydroxyl radicals in different polar parts of Semen Ziziphi Spinosae

2.2.5 酸棗仁不同極性部位清除自由基IC50值分析結(jié)果 如表6 所示酸棗仁不同極性部位清除自由基的IC50值可知，S5（正丁醇部位）對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS+自由基和超氧陰離子自由基的清除率IC50值均低于其他部位的IC50值，該研究表明酸棗仁正丁醇部位具有更強(qiáng)的抗氧化活性。

表6 酸棗仁不同極性部位抗氧化活性IC50 值Table 6 IC50 value of antioxidant activity of different polar parts of Semen Ziziphi Spinosae

2.2.6 酸棗仁不同極性部位細(xì)胞氧化損傷保護(hù)能力分析結(jié)果 除上述對(duì)酸棗仁不同極性部位抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定外，本研究通過(guò)測(cè)定不同給藥組的細(xì)胞相對(duì)活力，來(lái)比較酸棗仁不同極性部位對(duì)H2O2所致SH-SY5Y 細(xì)胞氧化損傷保護(hù)能力的大小，旨在選出酸棗仁對(duì)氧化損傷細(xì)胞保護(hù)的最佳活性部位。如圖3 所示，相比于模型組，SH-SY5Y 細(xì)胞在空白組正常貼壁狀態(tài)下呈上皮樣，有短觸角延伸，成簇生長(zhǎng)。在應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞形態(tài)變大變圓，輪廓不清晰。給藥處理后，鏡下見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)接近于正常狀態(tài)。如表7 所示，酸棗仁不同萃取部位對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞氧化損傷有保護(hù)能力。與模型組相比，各組樣品均提高了細(xì)胞存活率。表明，酸棗仁不同極性萃取部位可以改善H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷，其中S5 萃取部位對(duì)細(xì)胞氧化損傷保護(hù)能力相對(duì)最強(qiáng)，而S2 萃取部位最弱。

表7 酸棗仁不同極性部位的細(xì)胞相對(duì)活力Table 7 Relative cell viability of different polar parts of Semen Ziziphi Spinosae

圖3 酸棗仁不同極性部位對(duì)H2O2 所致SH-SY5Y 細(xì)胞氧化損傷保護(hù)能力對(duì)比圖Fig.3 Comparison of the protection ability of SH-SY5Y cells caused by H2O2 in different polar parts of Semen Ziziphi Spinosae

2.3 酸棗仁不同極性部位抗氧化活性及成分含量相關(guān)性分析結(jié)果

2.3.1 酸棗仁不同極性部位各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果 皮爾遜相關(guān)系數(shù)[27]是描述2 個(gè)定距變量間聯(lián)系緊密程度，衡量變量X 和Y 之間的線性相關(guān)關(guān)系的參數(shù)，其值介于-1 與1 之間，一般用r表示，該算法運(yùn)算效率高且實(shí)用性強(qiáng)。由表8 可知，酸棗仁6 個(gè)化學(xué)組分含量和4 個(gè)抗氧化活性指標(biāo)以及保護(hù)氧化損傷細(xì)胞能力之間存在良好的線性相關(guān)性，其中ABTS+自由基IC50值與總酚酸、總黃酮呈高度線性負(fù)相關(guān)且顯著（P＜0.05），與斯皮諾素含量呈高度線性負(fù)相關(guān)且極顯著（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.938、0.950、0.982；超氧陰離子自由基IC50值與總酚酸呈高度線性負(fù)相關(guān)且顯著（P＜0.05），與總黃酮、斯皮諾素含量呈高度線性負(fù)相關(guān)且極顯著（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.884、0.983、0.982；保護(hù)氧化損傷細(xì)胞能力與總黃酮、斯皮諾素含量呈高度線性正相關(guān)且極顯著（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.995、0.961。上述研究結(jié)果表明，酸棗仁中6 個(gè)化學(xué)組分含量與4 個(gè)抗氧化指標(biāo)均為線性相關(guān)關(guān)系，推測(cè)上述組分均具有良好的抗氧化活性，其中總黃酮、斯皮諾素與抗氧化活性指標(biāo)和保護(hù)氧化損傷細(xì)胞能力之間線性關(guān)系顯著，這可能是因?yàn)樗釛椚手锌傸S酮、斯皮諾素為主要抗氧化活性部位。

表8 酸棗仁不同極性部位各項(xiàng)指標(biāo)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)及其相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果Table 8 Pearson correlation coefficients and correlation test results of different polar parts of Semen Ziziphi Spinosae

2.3.2 酸棗仁不同極性部位抗氧化活性與功能成分偏最小二乘回歸分析結(jié)果 PLS 方法中，通常通過(guò)變量投影重要性指標(biāo)（VIP）[28]來(lái)表征各成分含量對(duì)抗氧化活性指標(biāo)的解釋能力大小，其值越大說(shuō)明該自變量對(duì)因變量的解釋能力越強(qiáng)，基于VIP 對(duì)各成分含量進(jìn)行篩選后再采用PLS 建模。由表9 可知總黃酮、總酚酸、斯皮諾素變量重要性值較大，在解釋變量Y 時(shí)具有顯著重要性；總皂苷、總多糖變量重要性值較小。

表9 自變量VIP（累積投影重要性）匯總Table 9 Summary of independent variable VIP (emportance of cumulative projection)

采用偏最小二乘回歸分析法，對(duì)酸棗仁不同極性部位抗氧化活性進(jìn)行分析，選擇酸棗仁不同極性部位成分含量作為自變量X，其中X1為總酚酸含量、X2為總皂苷含量、X3為總多糖含量、X4為總黃酮含量、X5為斯皮諾素含量、X6為酸棗仁皂苷A，其抗氧化指標(biāo)作為因變量，其中YⅠ為DPPH 自由基清除率、YⅡ?yàn)锳BTS+自由基清除率、YⅢ為羥基自由基清除率、YⅣ為超氧陰離子清除率、YⅤ為保護(hù)氧化損傷細(xì)胞能力。得到回歸表10 所示方程，由表10可知，回歸系數(shù)的正、負(fù)代表各成分對(duì)抗氧化能力的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，回歸系數(shù)絕對(duì)值越大，表明該自變量對(duì)抗氧化能力影響越大。按照回歸系數(shù)絕對(duì)值大小排序，可知各成分含量對(duì)DPPH 自由基、ATBS+自由基、羥基自由基清除能力以及保護(hù)氧化損傷細(xì)胞能力的影響由大到小均為：X2＞X3＞X5＞X4＞X6＞X1，該結(jié)果與表9 結(jié)果一致，因此推測(cè)出總酚酸、總黃酮、斯皮諾素含量對(duì)酸棗仁發(fā)揮抗氧化能力及氧化損傷細(xì)胞保護(hù)能力影響較大。

表10 酸棗仁不同極性部位抗氧化活性與成分含量最小二乘回歸分析結(jié)果Table 10 Results of the partial least squares regression analysis of antioxidant activity and ingredient content in different polar parts of Semen Ziziphi Spinosae

3 討論與結(jié)論

本文以體外抗氧化活性及對(duì)H2O2所致SHSY5Y 細(xì)胞損傷保護(hù)能力結(jié)合酸棗仁各部位成分含量變化來(lái)挖掘酸棗仁抗氧化能力與酸棗仁不同成分的關(guān)系，明確酸棗仁發(fā)揮抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)果表明酸棗仁不同極性部位均具有良好的抗氧化活性，但抗氧化能力強(qiáng)弱并不一致，其中S5 萃取部位抗氧化活性優(yōu)于其他部位，因此推斷正丁醇萃取部位可能是酸棗仁抗氧化的主要活性部位。采用紫外分光光度法，HPLC 法測(cè)定了酸棗仁不同萃取部位成分含量，發(fā)現(xiàn)S5 部位總黃酮、總皂苷含量較高，說(shuō)明黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)成分在正丁醇部位進(jìn)行了富集。植物黃酮類(lèi)成分由于其含多個(gè)酚羥基的結(jié)構(gòu)特性，被稱(chēng)為天然的抗氧化活性物質(zhì)[29]，酸棗仁皂苷因其具有多個(gè)氧化和還原官能團(tuán)，且具有烯丙型穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的多位點(diǎn)活性中心，具較強(qiáng)的抗氧化活性[30]，因此，推斷酸棗仁提取物抗氧化活性跟黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)成分含量相關(guān)。其不同極性部位抗氧化活性的變化趨勢(shì)與其總黃酮、總皂苷含量具有一致性，因此推斷其黃酮類(lèi)、皂苷成分可能為酸棗仁發(fā)揮抗氧化作用的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。

采用PLS 相關(guān)分析探究各活性部位成分含量與抗氧化指標(biāo)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，將各指標(biāo)與各組分進(jìn)行相關(guān)性分析，各活性部位成分含量對(duì)DPPH 自由基、ABTS+自由基、羥基自由基清除能力以及保護(hù)氧化損傷細(xì)胞能力的影響由大到小均為：X2＞X3＞X5＞X4＞X6＞X1。由此可說(shuō)明總皂苷、總黃酮、斯皮諾素含量對(duì)酸棗仁發(fā)揮抗氧化能力及氧化損傷細(xì)胞保護(hù)能力影響較大。相關(guān)性分析結(jié)果表明，不同成分含量之間存在著互相影響、互相牽制的關(guān)系，總皂苷、總黃酮等成分含量的變化可能會(huì)導(dǎo)致其他成分含量與抗氧化能力的改變；偏最小二乘回歸分析研究再次表明酸棗仁中總皂苷、總黃酮、斯皮諾素含量對(duì)其抗氧化能力影響最大。因此，本研究不僅測(cè)定了酸棗仁中主要成分的含量，而且明確了主要化學(xué)成分對(duì)抗氧化的影響，可為酸棗仁在保健食品等方面的開(kāi)發(fā)利用提供參考。