桑葉蛋白超聲提取聯(lián)合超濾純化工藝優(yōu)化及其營養(yǎng)評價

吳雅茹，陳貴茹，雷建都，王璐瑩

（北京林業(yè)大學材料科學與技術(shù)學院，生物制藥與精細化工實驗室，北京 100083）

我國桑葉資源豐富且種類多樣，但利用率低下，造成大量浪費[1]。據(jù)《本草綱目》中記載：桑葉除了具有明目、增發(fā)的效果，還能治療咳嗽[2]。桑葉作為藥食同源的天然植物[3]，含有多種天然活性成分，如蛋白、黃酮、多糖、生物堿等[4]。桑葉蛋白作為“綠色植物蛋白”濃縮物，與動物肌肉所含蛋白不同，不含膽固醇，是一種綠色可再生蛋白資源之一。不僅如此，桑葉蛋白含有豐富氨基酸，且氨基酸組成比例合理[5]，具有較高的營養(yǎng)價值，可添加到食品工業(yè)中[6]。研究開發(fā)利用桑葉蛋白并研發(fā)出產(chǎn)品有利于提高該資源的附加值。探索桑葉蛋白的高效生產(chǎn)加工方法，可推動提升桑葉蛋白品質(zhì)，進而使桑葉蛋白應用更廣泛。因此，研究制備較高純度且具有較高營養(yǎng)價值的桑葉蛋白具有良好的應用前景。

已報道的植物葉蛋白提取方法有水溶液提取法[7-8]、有機溶劑提取法[9]、超聲提取法[10]和酶法[11]等。其中，超聲提取法是指采用超聲技術(shù)打破植物細胞壁使細胞壁內(nèi)蛋白溶出，該法具有綠色環(huán)保、高效提取和操作簡單等優(yōu)勢。純化植物葉蛋白方法以酸沉、酸熱和鹽析等方法為主[12]。酸沉和酸熱法沉淀蛋白不僅在操作過程中pH 難把控，而且使用大量酸對環(huán)境有害；鹽析法純化蛋白的工藝要脫鹽處理使工藝變得繁瑣[13]。而使用膜分離純化工藝可以避免了引入酸、堿或無機鹽等化學試劑，而且工藝操作簡單不需要高溫[14]。此外，膜分離技術(shù)還具有便于與其他工藝聯(lián)用、易于放大、可實現(xiàn)水循環(huán)利用等優(yōu)點[15-16]。膜分離技術(shù)現(xiàn)已廣泛應用于食品行業(yè)、天然產(chǎn)物分離、藥物純化濃縮等領(lǐng)域[17-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，采用超聲提取聯(lián)合膜分離技術(shù)純化甘草酸[20]和水蘇糖[21]等天然產(chǎn)物，工藝具有高效簡單且成本較低的優(yōu)勢。可見，以超聲提取聯(lián)合膜分離技術(shù)應用于制備桑葉蛋白，有望得到高純度且營養(yǎng)價值較高的產(chǎn)品。

本研究以桑葉為原料，采用超聲提取制備桑葉蛋白粗提液，桑葉蛋白粗提液經(jīng)過超濾膜純化后得到固體粗蛋白。采用響應面優(yōu)化綠色環(huán)保的超聲水提法的工藝條件，進一步采用正交試驗優(yōu)化超濾純化桑葉蛋白工藝，研究液料比、加熱溫度和加熱時間等因素對桑葉蛋白得率的影響，并在保證產(chǎn)品純度基礎(chǔ)上，探究采用不同操作壓力、粗提液稀釋倍數(shù)和濃縮比在超濾過程中最高通量。本研究有助于推動合理高效地利用過剩的桑葉資源，提高桑葉資源產(chǎn)品附加值，以期用綠色環(huán)保的方法為制備優(yōu)質(zhì)植物蛋白提供技術(shù)指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮桑葉 購于2021 年4 月，立即晾干備用，產(chǎn)自北京市；鹽酸、硫酸銨 均為分析純，北京藍弋化工產(chǎn)品有限責任公司；考馬斯亮藍試劑盒 南京建成生物研究所；聚丙烯腈（PAN）超濾膜 杭州九齡科技有限公司；去離子水 實驗室自制。

超濾杯 杭州九齡科技有限公司；TG16 離心機易德誠天地科技有限公司；ATX124 電子天平 日本島津公司；SHJ-1A 水浴恒溫磁力攪拌器 金壇市美特儀器制造有限公司；UV759CRT 紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；KQ-300E 超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；FW-100 破碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；FD-1A-50 冷凍干燥 上海比朗儀器制造有限公司：L8900 氨基酸分析儀 英國百康公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葉蛋白提取方法 新鮮桑葉經(jīng)漂洗，自然晾干，粉碎后過60 目篩備用。稱取1 g 桑葉粉，按液料比15:1～35:1 mL/g 加入去離子水，超聲處理0～30 min后，在30～50 ℃水浴加熱10～60 min。離心分離混合物，收集粗提液。采用考馬斯亮藍法測定溶液中蛋白濃度[22]，并按公式（1）計算桑葉蛋白得率。

式中，C1指粗提液桑葉蛋白濃度，mg/mL；V1指粗提液體積，mL；M桑葉指稱取桑葉粉的質(zhì)量，mg。

1.2.2 桑葉蛋白提取工藝單因素實驗

1.2.2.1 液料比對蛋白得率的影響 液料比分別為15:1、20:1、25:1、30:1 和35:1 mL/g 時，在超聲處理15 min、40 ℃加熱40 min，冷卻至室溫后5000 r/min離心10 min，得到桑葉蛋白粗提液。

1.2.2.2 加熱溫度對蛋白得率的影響 液料比30:1 mL/g，超聲15 min，分別加熱不同溫度30、35、40、45 和50 ℃加熱40 min，冷卻至室溫后5000 r/min離心10 min，得到桑葉蛋白粗提液。

1.2.2.3 加熱時間對蛋白得率的影響 液料比30:1 mL/g，超聲15 min，40 ℃加熱不同時間10、20、30、40、50 和60 min，冷卻至室溫后5000 r/min離心10 min，得到桑葉蛋白粗提液。

1.2.2.4 超聲時間對蛋白得率的影響 液料比30:1 mL/g，不同超聲時間0、10、15、20 和30 min，40 ℃加熱40 min，冷卻至室溫后5000 r/min 離心10 min，得到桑葉蛋白粗提液。

1.2.2.5 響應面設計試驗 基于單因素實驗結(jié)果，優(yōu)選液料比（A）、加熱溫度（B）和加熱時間（C）為自變量，桑葉蛋白得率（Y）作為響應值。響應面試驗因素設計與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計Table 1 Response surface experimental factors and level design

1.2.3 桑葉蛋白純化方法

1.2.3.1 桑葉蛋白純化方法的篩選 超濾法：利用超濾杯在操作壓力：0.55 MPa 的條件下，超濾處理30 mL 粗提液（不稀釋）。濃縮比為5:1，收集透過液和截留液。記錄超濾時間t 和透過液體積V2，根據(jù)公式（2）計算膜通量。截留液為桑葉蛋白濃縮液，截留液冷干處理得到固體粗蛋白，根據(jù)公式（3）計算蛋白純度。

式中，C1指粗提液桑葉蛋白濃度，mg/mL；C2指純化后透過液或上清液中桑葉蛋白濃度，mg/mL；V1指未經(jīng)過處理的粗提液體積，mL；V2指純化后透過液或上清液體積，mL；M冷干指稱取冷干后粗蛋白的質(zhì)量，mg；L 指透過液體積，L；A 指膜的有效面積，m2；t 指超濾時間，h。

酸沉法：量取30 mL 粗提液逐滴加入稀鹽酸調(diào)至pH3.5，離心并收集上清液，離心后的沉淀經(jīng)冷干處理得到固體粗蛋白[23]。

酸熱法：量取30 mL 粗提液在75 ℃下水浴處理15 min，再逐滴加入稀鹽酸至pH3，靜置后離心。離心并收集上清液，離心后的沉淀經(jīng)冷干處理得到固體粗蛋白[23]。

鹽析法：量取30 mL 粗提液調(diào)整溶液飽和度至65%，低溫靜置過夜，離心，收集好上清液，離心后的沉淀透析后的樣品冷干處理得到固體桑葉蛋白[23]。對上述不同純化方法，分別以公式（3）和（4）計算蛋白純度和蛋白保留率，同一純化方法至少重復三次并計算蛋白純度和蛋白保留率平均值，其中蛋白保留率計算公式如下：

式中，C1指粗提液桑葉蛋白濃度，mg/mL；C2指純化后透過液或上清液中桑葉蛋白濃度，mg/mL；V1指未經(jīng)過處理的粗提液體積，mL；V2指純化后透過液或上清液體積，mL。

1.2.3.2 操作壓力對膜通量和蛋白純度的影響 取30 mL 粗提液，設置不同的操作壓力0.40、0.45、0.50、0.55 和0.60 MPa，粗提液稀釋0.5 倍，濃縮比5:1。收集透過液和截留液，截留液冷干處理得到固體桑葉蛋白。

1.2.3.3 粗提液稀釋倍數(shù)對膜通量和蛋白純度的影響 粗提液稀釋倍數(shù)解釋：以100 mL 為例，稀釋倍數(shù)0、0.5、1、1.5、2 倍是指粗提液加水0、50、100、150 和200 mL。取30 mL 粗提液，設置超濾操作壓力0.55 MPa，粗提液稀釋0、0.5、1、1.5 和2 倍，濃縮比5:1。收集透過液和截留液，截留液冷干處理得到固體桑葉蛋白。

1.2.3.4 濃縮比對膜通量和蛋白純度的影響 濃縮比：是指粗提液與截留液的體積比，以粗提液100 mL為例，濃縮比2:1、3:1、4:1、5:1、6:1 是指超濾得到的截留液體積分別為：50、33、25、20 和17 mL。取30 mL 粗提液，設置超濾操作壓力0.55 MPa，粗提液稀釋0.5 倍，濃縮比2:1、3:1、4:1、5:1 和6:1。收集透過液和截留液，截留液冷干處理得到固體桑葉蛋白。

1.2.3.5 正交試驗 在超濾純化桑葉蛋白單因素的基礎(chǔ)上，以保證蛋白純度35%以上為前提，以操作壓力、粗提液稀釋倍數(shù)和濃縮比為因素，膜通量為考察指標，進行L9（34）正交試驗，正交試驗因素水平如表2所示。

表2 正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 氨基酸含量的測定 參考GB 5009.124-2016食品安全國家標準食品中方法測定桑葉粗蛋白中的17 種蛋白氨基酸含量（g/100 g）。氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）、氨基酸比值系數(shù)（ratio coefficient，RC）以及氨基酸比值系數(shù)分（score of ratio coefficient，SRC）計算公式如下：

式中，CV（coefficient of variation），是RC 的變異系數(shù)；RCi 表示所測9 種必需氨基酸中某一必需氨基酸的RC 值；各氨基酸量均以g/100 g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

桑葉蛋白提取和純化實驗均重復3 次，數(shù)據(jù)利用平均值的形式表示，桑葉蛋白提取和純化單因素實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016 和Origin 2021 軟件分析并制圖，單因素差異性分析結(jié)果由IBM SPSS Statistics 25.0 軟件處理。Design-Expert 8.0.6 軟件設計分析提取桑葉蛋白實驗的響應面，進一步采用Origin 2021 制圖，桑葉蛋白純化正交試驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 25.0 軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉蛋白提取單因素實驗結(jié)果

2.1.1 液料比對桑葉蛋白得率的影響 桑葉蛋白得率如圖1 所示，液料比15:1～30:1 mL/g 時，桑葉蛋白得率由2.31%上升到5.31%，液料比為30:1 mL/g時達到最好提取效果?？赡芤毫媳鹊脑黾?，有助于更多蛋白與水充分接觸，利于蛋白溶出，提高桑葉蛋白得率。當液料比為30:1 mL/g 時，為5.31%；當液料比增加到35:1 mL/g 時，桑葉蛋白得率稍有下降。桑葉蛋白得率在液料比30:1 mL/g 時達到最好的提取效果，繼續(xù)增加液料比也沒有對桑葉蛋白得率有顯著提高[24]。對于液料比單因素實驗結(jié)果經(jīng)過SPSS處理可知P＜0.05，發(fā)現(xiàn)液料比的變化對桑葉蛋白得率存在極顯著差異，因此選取液料比25:1、30:1 和35:1 mL/g 作為進一步響應面試驗優(yōu)化的條件。

圖1 液料比對蛋白得率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on protein yield

2.1.2 加熱溫度對桑葉蛋白得率的影響 桑葉蛋白得率見圖2。在30～50 ℃范圍內(nèi)，升高溫度，桑葉蛋白的得率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。當加熱溫度范圍在30～40 ℃時，桑葉蛋白得率不斷升高，且加熱溫度40 ℃時桑葉蛋白得率達到最高，為5.31%，加熱溫度超過40 ℃，桑葉蛋白得率開始下降，50 ℃時桑葉蛋白得率相較于40 ℃時下降了1.66%。結(jié)果表明，適當?shù)纳邷囟扔兄谔岣呱Ｈ~蛋白的溶解度，桑葉蛋白得率升高；但溫度過高會導致部分蛋白失活，繼而降低了桑葉蛋白得率。相關(guān)研究人員在探究提取桑葉蛋白的最優(yōu)加熱溫度時，也得到了類似的結(jié)論[25-26]。對于加熱溫度單因素實驗結(jié)果經(jīng)過SPSS處理可知P＜0.05，發(fā)現(xiàn)加熱溫度的變化對桑葉蛋白得率影響存在極顯著差異，因此選取加熱溫度35、40 和45 ℃作為進一步響應面試驗優(yōu)化的條件。

圖2 加熱溫度對蛋白得率的影響Fig.2 Effect of water bath temperature on protein yield

2.1.3 加熱時間對桑葉蛋白得率的影響 桑葉蛋白得率如圖3 所示，加熱時間在10～60 min 范圍內(nèi)，桑葉蛋白得率呈現(xiàn)出先升高后下降的變化趨勢。加熱時間為10～40 min 時，桑葉蛋白得率隨加熱時間的延長而升高，桑葉蛋白得率由4.22%升到5.31%，水浴40 min 時，桑葉蛋白得率達到最高，為5.31%?？赡苁羌訜釙r間太短，蛋白質(zhì)溶解不充分。繼續(xù)加熱提取，桑葉蛋白得率又出現(xiàn)呈現(xiàn)下降的趨勢，桑葉蛋白得率由5.31%降到4.60%。相關(guān)研究證實，加熱時間由9 min 延長到11 min，柱花草葉蛋白得率降低了2.32%[27]。加熱時間太長可能導致桑葉中其他雜質(zhì)也被提取出來，增加蛋白與非蛋白成分共沉機會。對于加熱時間單因素實驗結(jié)果經(jīng)過SPSS 處理可知P＜0.05，發(fā)現(xiàn)加熱時間的延長對桑葉蛋白得率存在極顯著差異，因此選取加熱時間30、40 和50 min 作為進一步響應面試驗優(yōu)化的條件。

圖3 加熱時間對蛋白得率的影響Fig.3 Effect of heating time on protein yield

2.1.4 超聲時間對桑葉蛋白得率的影響 桑葉蛋白得率如圖4 所示，在超聲時間0～15 min（0 min 表示沒有超聲處理）桑葉蛋白得率均隨超聲時間延長而增大，桑葉蛋白得率由4.59%升到5.31%。繼續(xù)超聲到20～30 min 有發(fā)現(xiàn)略微下降。在一定范圍內(nèi)增加超聲時間，有利于蛋白分子溶脹充分，從而使桑葉蛋白得率增加。有研究發(fā)現(xiàn)，桑葉蛋白得率在超聲處理22 min 時比超聲處理18 min 時降低了約0.4%，這可能是由于超聲輔助法提取桑葉蛋白時，超聲時間過長對蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用[28]。對于超聲時間0～30 min 單因素實驗，SPSS 處理得到P＜0.05，即超聲時間的變化對于桑葉蛋白得率存在極顯著差異，進一步分析圖4 中超聲時間10、15 和20 min 這三個數(shù)據(jù)點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P＞0.05，說明超聲時間在10～20 min 內(nèi)的變化對于桑葉蛋白得率影響不顯著。對比液料比、加熱溫度和加熱時間單因素實驗結(jié)果，超聲時間對于桑葉蛋白得率的影響不大。因此選取液料比、加熱溫度和加熱時間這三個因素通過響應面試驗進一步優(yōu)化。

圖4 超聲時間對蛋白得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on protein yield

2.2 響應面優(yōu)化提取桑葉蛋白試驗

2.2.1 響應面設計試驗 響應面優(yōu)化提取桑葉蛋白實驗結(jié)果如表3 所示，得出液料比（A）、加熱溫度（B）和加熱時間（C）對桑葉蛋白得率（Y）的影響經(jīng)過擬合建立二次響應面回歸模型為：Y=+5.44-0.23A+0.11B-0.36C+0.093AB+0.42AC-0.52BC-0.90A2-0.50B2-0.57C2。該模型R2為97.27%，R2Adj為93.76%，說明該方程模型擬合性良好，該模型的P值＜0.0001且F值=27.73，該模型擬合達到極顯著差異水平。R2Pred=0.8700，說明可以采用這個模型預測和分析桑葉蛋白得率實驗結(jié)果。根據(jù)表4 方差分析可知，液料比、加熱溫度和加熱時間的F值分別為10.95、2.48 和26.34，影響桑葉蛋白得率的顯著性大?。杭訜釙r間（C）＞液料比（A）＞加熱溫度（B）。各因素中A、C 和交互項中AC、BC、以及二次項A2、B2、C2均對桑葉蛋白得率影響達到顯著或以上水平，僅有B 項和交互項AB 不顯著。

表3 響應面試驗結(jié)果Table 3 Response surface experimental results

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

2.2.2 各因素交互作用分析 如圖5 所示，可以看到液料比（A）、加熱溫度（B）和加熱時間（C）各因素對桑葉蛋白得率影響的響應面曲線圖。根據(jù)曲線坡度的陡峭程度分析兩個因素間交互影響大小。由圖5c可以看出，響應面中加熱溫度和加熱時間（BC）曲線坡度最陡；由圖5a 可以看出，響應面中液料比和加熱溫度（AB）曲線坡度較平緩。綜上所述，加熱溫度和加熱時間（BC）之間對桑葉蛋白得率的交互影響最大，液料比和加熱時間（AC）交互作用次之，液料比和加熱溫度（AB）之間交互作用最小。

圖5 兩因素交互作用對響應值的影響Fig.5 Effect of the interaction between two factors on the response value

2.2.3 驗證性實驗 桑葉蛋白得率最優(yōu)工藝條件通過Design Expert 8.0.6 預測可得：液料比28.78:1 mL/g、加熱溫度41.99 ℃和加熱時間34.12 min，在此條件下，桑葉蛋白得率為5.60%。為了實驗方便，將實際實驗條件調(diào)整為液料比29:1 mL/g、加熱溫度42 ℃和加熱時間34 min。對最佳實驗工藝條件進行驗證，重復三次實驗，得到桑葉蛋白得率平均值為5.56%±0.06%，與預測值誤差0.714%，說明該模型可以較準確的預測桑葉蛋白實際得率。

2.3 桑葉蛋白純化單因素實驗

根據(jù)曲面響應法優(yōu)化后的最優(yōu)蛋白提取條件制備桑葉粗提液，以蛋白粗提液為原料對桑葉蛋白純化工藝進行優(yōu)化。

2.3.1 不同純化方法的對桑葉蛋白純化效果 對桑葉粗提液采用酸沉法、酸熱法、鹽析法和超濾法純化除雜。根據(jù)公式（3）和（4）分別計算不同純化方法制備的桑葉蛋白純度和蛋白保留率。如表5 所示，酸沉法、酸熱法和鹽析法、超濾法四個蛋白樣品的純度分別為24.53%、30.32%、33.94%和35.35%，且超濾法與酸沉法和酸熱法制備得到蛋白純度具有顯著差異（P＜0.05），超濾法可以不引入其他酸、堿以及無機鹽的試劑，不會有試劑殘留的風險，所以超濾法制備的桑葉蛋白純度高于酸沉法和鹽析法等其他方法制備的桑葉蛋白。蛋白保留率分別為83.60%、54.03%、54.85%和95.42%。與酸熱和鹽析法相比，超濾法制備桑葉的蛋白保留率最高，蛋白保留率具有顯著性差異（P＜0.05）。說明粗提液中絕大部分的桑葉蛋白濃縮在超濾膜的一側(cè)，工藝中蛋白流失很少。而酸熱和鹽析法有接近一半的蛋白還在溶液中沒有被沉淀出來，蛋白流失嚴重。此外，酸沉和酸熱法沉淀蛋白在操作過程中pH 難把控，而且使用大量酸對環(huán)境有害，鹽析法純化蛋白的工藝要脫鹽處理使工藝變得繁瑣。而超濾法純化蛋白一方面避免了引入酸、堿或無機鹽等化學試劑，另一方面工藝操作簡單不需要高溫。綜上所述，選擇超濾法制備的桑葉蛋白進行后續(xù)優(yōu)化研究。

表5 不同純化方法純化桑葉蛋白結(jié)果Table 5 Results of different protein purification method

2.3.2 操作壓力對膜通量和蛋白純度的影響 如圖6所示，操作壓力在0.4～0.6 MPa 范圍內(nèi)，膜通量不斷增大，操作壓力0.4 MPa 時，膜通量最低，為13.76 L/m2·h；操作壓力0.6 MPa 時，膜通量最高，為14.72 L/m2·h。這可能是因為超濾過程中操作壓力的增加，促進推動膜分離過程，從而膜通量不斷增大。隨著增加操作壓力，桑葉蛋白純度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當操作壓力為0.4～0.55 MPa 時，蛋白純度隨著操作壓力的提高而增大，蛋白純度由34.82%上升到37.06%，且0.55 MPa 時達到最大值37.06%，這可能是因為適當?shù)脑黾硬僮鲏毫τ欣谛》肿与s質(zhì)[29]如生物堿和低聚糖等透過膜，使蛋白純度提高；但當壓力為0.6 MPa時，蛋白純度開始下降，這可能由于操作壓力過大，對膜孔徑內(nèi)部結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用，大于膜孔徑的溶質(zhì)可以透過膜，造成蛋白純度下降[30]。對于操作壓力的單因素實驗結(jié)果經(jīng)過SPSS 處理發(fā)現(xiàn)P值均小于0.01，操作壓力對于膜通量和蛋白純度的影響存在極顯著差異。綜合考慮產(chǎn)品純度和超濾過程膜通量，所以選擇操作壓力0.55 MPa 左右進行進一步正交優(yōu)化膜通量。

圖6 操作壓力對超濾效果的影響Fig.6 Influence of operating pressure on ultrafiltration effect

2.3.3 粗提液稀釋倍數(shù)對膜通量和蛋白純度的影響如圖7 所示，隨著粗提液稀釋倍數(shù)增加，膜通量呈現(xiàn)出先上升較快后趨于平緩的趨勢，這可能是因為蛋白濃度不斷稀釋，引起的濃差極化減少，膜通量上升[31]。粗提液稀釋倍數(shù)0 倍（粗提液不稀釋）時，膜通量最低，僅5.04 L/m2·h；粗提液稀釋倍數(shù)2 倍時，膜通量最高，達24.48 L/m2·h。而蛋白純度隨著粗提液稀釋倍數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低，粗提液稀釋倍數(shù)0.5 倍時，蛋白純度處于最大，達37.06%，粗提液稀釋倍數(shù)0 倍時的蛋白純度低于粗提液稀釋倍數(shù)0.5 時的蛋白純度，可能是未稀釋的粗提液中蛋白濃度高，溶液粘度大，不能進行有效的分離，蛋白純度降低；繼續(xù)增加稀釋倍數(shù)蛋白純度降低，可能是因為蛋白濃度越來越低，雖然小分子雜質(zhì)更容易透過膜，小分子蛋白也容易透過膜，導致蛋白純度變低[32]。對于粗提液稀釋倍數(shù)的單因素實驗結(jié)果數(shù)據(jù)經(jīng)過SPSS 處理發(fā)現(xiàn)P值均小于0.01，粗提液稀釋不同倍數(shù)對于膜通量和蛋白純度的影響存在極顯著差異。僅有粗提液稀釋倍數(shù)0、0.5 和1 倍，蛋白純度達到35%以上，在確保產(chǎn)品質(zhì)量基礎(chǔ)上，考慮優(yōu)化超濾膜通量。所以選擇粗提液稀釋倍數(shù)0、0.5 和1 對超濾膜通量進行正交優(yōu)化。

圖7 粗提液稀釋倍數(shù)對超濾效果的影響Fig.7 Influence of water injection ratio of crude extract on ultrafiltration effect

2.3.4 濃縮比對膜通量和蛋白純度的影響 如圖8所示，隨著濃縮比的加大，膜通量先降低較快后下降平緩，濃縮比2:1 時，膜通量最高，為23.89 L/m2·h；濃縮比6:1 時，膜通量最低14.05 L/m2·h。隨著超濾的進行，蛋白大分子被截留，濃度越來越大，溶液粘度增加，膜阻力增加導致通量隨之降低[33]。而蛋白純度隨濃縮比的增加而增加，濃縮比2:1 時蛋白純度最低，僅24.86%，濃縮比6:1 時蛋白純度最高，為38.33%。對于濃縮比的單因素實驗結(jié)果經(jīng)過SPSS 處理發(fā)現(xiàn)P值均小于0.05，濃縮比對于膜通量和蛋白純度的影響存在極顯著差異。且僅有濃縮比4:1、5:1 和6:1時蛋白純度達到35%及以上。為確保超濾過程即滿足產(chǎn)品純度35%以上，又能實現(xiàn)較高的通量。所以采用濃縮比4:1、5:1 和6:1 進一步優(yōu)化膜通量。

圖8 濃縮比對超濾效果的影響Fig.8 Influence of concentration ratio on ultrafiltration effect

2.4 桑葉蛋白純化正交試驗

在超濾純化桑葉蛋白單因素的基礎(chǔ)上，以保證蛋白純度35%以上為前提，以操作壓力、粗提液稀釋倍數(shù)和濃縮比為因素，膜通量為考察指標，進行L9（34）正交試驗。由表6 可知，根據(jù)極差R值大小，影響對膜通量的各因素主次順序：粗提液稀釋倍數(shù)（B）＞濃縮比（C）＞液料比（A），最優(yōu)組合為A3B3C1，即操作壓力0.6 MPa，粗提液稀釋倍數(shù)1 倍，濃縮比4:1。在最佳條件下，進行3 次平行實驗，膜通量平均值為21.40 L/m2·h，蛋白純度平均值為35.64%，蛋白保留率平均值為95.72%。

表6 正交試驗結(jié)果Table 6 Orthogonal results

2.5 超濾法制備桑葉蛋白的氨基酸組成以及平衡性分析

2.5.1 氨基酸組成分析 對上述純化后純度為35.64%的樣品，進一步進行氨基酸組成分析。測得桑葉蛋白中總氨基酸（TAA）含量22.22 g/100 g，從表7 可以看到，桑葉蛋白均含有被檢測的17 種氨基酸，其中包括7 種必需氨基酸和10 種非必需氨基酸。桑蛋白氨基酸組成分布均勻，每種氨基酸含量之間差異性較小，但與FAO/WHO 成人模式各氨基酸含量較接近。其中蘇氨酸、纈氨酸和苯丙+鉻氨酸含量均達到甚至高于FAO/WHO 成人模式中要求的蘇氨酸、纈氨酸和苯丙+鉻氨酸含量。其中EAA/TAA 為0.41，高于FAO/WHO 成人模式EAA/TAA（0.40）；EAA/NEAA 為0.70，高于FAO/WHO 成人模式EAA/NEAA（0.60）。非必需氨基酸中脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸含量較高，分別達到了3.06、2.90 和2.50 g/100 g。天冬氨酸和谷氨酸等屬于風味蛋白，可應用于食品工業(yè)。超濾法制備桑葉蛋白尚不能達到FAO/WHO 兒童模式的氨基酸含量標準，還需進一步改善純化工藝提升桑葉蛋白中的必需氨基酸含量。

表7 超濾法制備桑葉蛋白的氨基酸組成（g/100 g）Table 7 Amino acid composition of mulberry leaf protein prepared by ultrafiltration (g/100 g)

2.5.2 氨基酸含量的平衡性分析 基于氨基酸組成分析結(jié)果，將該樣品進行氨基酸平衡性分析，并計算桑葉蛋白的SRC 值。桑葉蛋白氨基酸含量越接近FAO/WHO 氨基酸模式要求，說明該蛋白氨基酸配越平衡，越能夠滿足人體營養(yǎng)需求[34]。經(jīng)計算可得，超濾法制備的桑葉蛋白RAA、RC、CV 以及SRC（表8）。蘇氨酸、纈氨酸、苯丙+酪氨酸的RC 值＞1，說明蘇氨酸、纈氨酸、苯丙+酪氨酸含量相對過剩；亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和蛋+胱氨酸的RC 值＜1，則說明亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和蛋+胱氨酸含量相對缺乏[35]，蛋+胱氨酸的RC 值最小為0.64，說明蛋+胱氨酸是桑葉蛋白粉的第一限制性氨基酸。SRC 常常被用來作為評價氨基酸的營養(yǎng)價值的高低，其值越接近100，說明制備出的蛋白營養(yǎng)價值越高[36]。如表8 所示，經(jīng)計算，超濾法制備桑葉蛋白的SRC 值為69.68，具有較高的營養(yǎng)價值。

表8 超濾法制備桑葉蛋白的氨基酸比值系數(shù)Table 8 Amino acid ratio coefficient of mulberry leaf protein prepared by ultrafiltration

綜上所述，超濾法制備桑葉蛋白無論是從氨基酸組成還是氨基酸平衡性分析都表現(xiàn)出較好的優(yōu)勢。

3 結(jié)論

采用超聲提取聯(lián)合超濾純化桑葉蛋白，首先通過單因素實驗初步得出液料比、超聲時間、加熱溫度和加熱時間的最適條件。在此基礎(chǔ)上，優(yōu)選液料比、加熱溫度和加熱時間進行響應面試驗優(yōu)化，桑葉蛋白的最佳提取工藝條件是液料比29:1 mL/g，超聲時間15 min，42 ℃水浴34 min，在此條件下，桑葉蛋白得率5.56%。進一步采用正交試驗優(yōu)化超濾純化桑葉蛋白粗提液，得到純化蛋白的最優(yōu)工藝為：操作壓力0.6 MPa，粗提液稀釋倍數(shù)1 倍，濃縮比4:1，制備的桑葉蛋白固體純度為35.64%，蛋白保留率可達95.72%，膜通量可達21.40 L/m2·h。采用環(huán)保無毒害的超聲聯(lián)合超濾工藝對桑葉蛋白進行提取分離純化，超聲提取聯(lián)合超濾技術(shù)制備的桑葉蛋白固體中總氨基酸含量為22.22 g/100 g，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的0.41，EAA/NAA 值為0.70，超過FAO/WHO標準規(guī)定的必需氨基酸含量（0.40）和EAA/NAA 值（0.60），該制備的桑葉蛋白第一限制氨基酸為蛋氨酸+胱氨酸，SRC 為69.68，營養(yǎng)價值較高。該工藝從桑葉中提取分離桑葉蛋白，不需要引入大量酸、堿和鹽等化學試劑，實現(xiàn)綠色生產(chǎn)，可為桑葉蛋白提取和分離純化工藝提供新思路。