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    花生根白藜蘆醇的超聲輔助提取工藝優(yōu)化及分離提純

    2023-08-13 06:06:48宋青云李玟君龐子皓肖一郎汪海燕李玉蝶
    食品工業(yè)科技 2023年16期
    關(guān)鍵詞:白藜蘆醇大孔花生

    宋青云,李玟君,龐子皓,肖一郎,汪海燕,李玉蝶,劉 運(yùn),汪 超,李 瑋,

    (1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北武漢 430068;2.湖北妍琪生物科技有限公司,湖北襄陽(yáng) 441000)

    白藜蘆醇,3,4',5-三羥基-1,2-二苯基乙烯,又名芪三酚,是某些植物在受外界刺激時(shí)產(chǎn)生的一種抗毒素,在消炎、抗氧化、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、降血脂和預(yù)防心血管疾病等方面有比較顯著的作用[1-2]。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)白藜蘆醇的研究多集中以中藥虎杖為提取原料,但虎杖為中藥寶貴資源,提取成本較高。有研究表明花生根內(nèi)含有豐富的白藜蘆醇[3-5],但是作為花生采收后的副產(chǎn)物之一,花生根除少量作為燃料使用外,其余大部分被隨意丟棄,造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[6-7]。

    目前從花生根中提取白藜蘆醇的方法主要有有機(jī)溶劑提取法、酶法和超臨界CO2萃取等[8-10]。對(duì)白藜蘆醇粗提物的純化主要采用大孔樹脂法、高速逆流色譜法和雙水相萃取純化等[11-13]。上述提取純化的方法適于開展大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的很少[14-17],對(duì)花生根白藜蘆醇提取工業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化方面的參考價(jià)值較低。對(duì)花生根的綜合利用研究應(yīng)當(dāng)以利于工業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化為目標(biāo)。因此,有必要建立一套完整且適于工業(yè)化生產(chǎn)花生根白藜蘆醇的方法。而超聲輔助溶劑提取則具有耗時(shí)短、效率高及適應(yīng)性廣等方面的優(yōu)勢(shì)[18-19]。大孔樹脂純化具有吸附、解吸較快、選擇性高、吸附容量大和便于工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)[20-21]。本研究擬采用超聲波輔助提取聯(lián)合大孔樹脂初步純化花生根白藜蘆醇,以期為花生根的合理開發(fā)、綜合利用和天然白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)化及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    花生根粉 中花16,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所;白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品 純度98%,上海源葉生物科技有限公司;乙腈 色譜級(jí),Thermo Fisher;乙醇分析純,國(guó)藥集團(tuán);大孔樹脂H103 安徽三星樹脂科技有限公司;層析柱 1.5×40 cm,上海滬西分析儀器廠有限公司。

    Agilent 1260 Ⅱ高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司;ZLGZ-12 冷凍干燥機(jī) 鄭州科旺達(dá)生物儀器有限公司;JY92-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司;N-1300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司;SPH-200B 恒溫?fù)u床 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HL-1 恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 白藜蘆醇的提取方法 參考安寶樹[22]的方法,花生根打粉后過40 目篩,用乙醇提取,提取方式為超聲波輔助提取。參考黃紀(jì)念等[23]的方法,固定提取溫度為50 ℃,選取花生根粉與乙醇的不同配比即料液比(g:mL)、乙醇濃度(%)、超聲波功率(W)及超聲時(shí)間(min)四個(gè)實(shí)驗(yàn)因素,以白藜蘆醇的含量為試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 乙醇濃度:保持料液比、超聲時(shí)間以及超聲功率分別為1:30 g:mL、9 min 和300 W,乙醇濃度分別為60%、70%、80%、90%和100%??疾觳煌掖紳舛葘?duì)花生根內(nèi)白藜蘆醇含量的作用。

    超聲時(shí)間:保持乙醇濃度、料液比以及超聲功率分別為90%、1:30 g:mL 和300 W,超聲作用時(shí)間分別設(shè)置為3、6、9、12 和15 min??疾觳煌晻r(shí)間對(duì)花生根內(nèi)白藜蘆醇含量的影響。

    超聲功率:保持乙醇濃度、料液比以及超聲時(shí)間分別為90%、1:30 g:mL 和9 min,超聲功率分別設(shè)置為150、200、250、300 和350 W??疾觳煌暪β蕦?duì)花生根內(nèi)白藜蘆醇含量的影響。

    料液比:保持乙醇濃度、超聲時(shí)間以及超聲功率分別為90%、9 min 和300 W,料液比分別為1:10、1:20、1:30、1:40 和1:50 g:mL??疾觳煌弦罕葘?duì)花生根內(nèi)白藜蘆醇含量的影響。

    依據(jù)式(1)計(jì)算白藜蘆醇含量(μg/g)。

    式中:c 為白藜蘆醇質(zhì)量濃度,μg/mL;v 為待測(cè)溶液總體積,mL;m 為花生根粉質(zhì)量,g。

    1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為參考,選取乙醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲功率(C)以及料液比(D)作為影響因素,設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案。以白藜蘆醇含量為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),確定白藜蘆醇的最佳提取工藝,同時(shí)對(duì)模型建議的最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[24]。以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為參考選取合適的因素以及水平并進(jìn)行編碼,使用響應(yīng)面模型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析。因素水平表見表1。

    表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface methodology

    1.2.4 大孔樹脂對(duì)白藜蘆醇的分離純化 參考吳佳等[25]和駱航等[26]的方法采用H103 大孔樹脂對(duì)花生根白藜蘆醇進(jìn)行初步純化。

    1.2.4.1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué) 稱取0.5 g 樹脂,加入提取濃縮后質(zhì)量濃度為247.49 μg/mL 的粗提液原液25 mL,通過恒溫?fù)u床在25 ℃、150 r/min 環(huán)境下振蕩,每隔20 min 測(cè)定白藜蘆醇的含量。

    1.2.4.2 靜態(tài)吸附等溫曲線 稱取五份樹脂,每份0.5 g,分別加入25 mL 含有60%、70%、80%、90%和100%提取原液的白藜蘆醇粗提液,通過恒溫?fù)u床在25 ℃、150 r/min 環(huán)境下振蕩,60 min 后分別測(cè)定白藜蘆醇的含量。

    1.2.4.3 上樣流速與上樣體積 稱取10 g 樹脂,濕法裝柱[18,27],將質(zhì)量濃度為70%提取原液的白藜蘆醇粗提液400 mL,分別在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min 的流速下收集流出液(10 mL/管),當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為流出液質(zhì)量濃度的10 倍時(shí)確定上樣體積。

    1.2.4.4 洗脫流速與洗脫體積 稱取10 g 樹脂,濕法裝柱,使其吸附飽和,以純化水清洗樹脂至流出液中檢測(cè)不到白藜蘆醇,分別在0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min 的流速下洗脫,以90%乙醇為洗脫劑,收集各流速條件下的洗脫液(10 mL/管),測(cè)定白藜蘆醇的含量。

    1.2.5 白藜蘆醇含量的測(cè)定 色譜條件:高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)測(cè)定提取液中白藜蘆醇含量[28]。色譜條件參考程杏安等[6]和葉夢(mèng)娜等[29]的方法并略作修改:Symmetry C18色譜柱(150×3.9 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈/水(24.5/75.5,v/v);等度洗脫;DAD,檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm;流速0.45 mL/min;柱溫箱26 ℃;自動(dòng)進(jìn)樣,進(jìn)樣量為10 μL。

    標(biāo)曲的制作:以吸收峰面積為縱坐標(biāo)(y),白藜蘆醇含量為橫坐標(biāo)(x),建立回歸方程。對(duì)待測(cè)樣品過0.22 μm 有機(jī)濾膜后按色譜條件進(jìn)樣,平行測(cè)定三次,峰面積取平均值,并通過線性回歸方程計(jì)算待測(cè)樣品中白藜蘆醇含量。通過計(jì)算得線性回歸方程為y=43.06x+2.0378,R2=0.9997,表明白藜蘆醇在3.92~39.2 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    1.2.6 樣品純度的測(cè)定 依照1.2.4 實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件,進(jìn)行三次平行試驗(yàn)。收集洗脫液,經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空冷凍干燥得純化產(chǎn)物,準(zhǔn)確稱重后用甲醇溶解,測(cè)定白藜蘆醇的含量,依據(jù)式(2)計(jì)算純度P。

    式中:c 為白藜蘆醇質(zhì)量濃度,mg/mL;V 為待測(cè)溶液總體積,mL;W 為白藜蘆醇干粉質(zhì)量,mg。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    采用Excel 2019 軟件對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用SPSS 25 軟件對(duì)單因素進(jìn)行P<0.05 水平顯著性分析,結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。運(yùn)用Design-Expert 13 軟件中的Box-Behnken 中心試驗(yàn)設(shè)計(jì),并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,采用Origin 2021 軟件繪圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 乙醇濃度對(duì)白藜蘆醇含量的影響 如圖1a 所示,乙醇濃度的增加的同時(shí),白藜蘆醇的含量先增加后減少,90%乙醇時(shí),含量達(dá)到最高170.35±1.72 μg/g,與其他水平具有顯著性差異(P<0.05),而后開始下降。這可能是由于乙醇濃度的增加,醇溶性雜質(zhì)及親脂性物質(zhì)溶出,與白藜蘆醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合溶劑,導(dǎo)致白藜蘆醇含量下降[30-31]。

    2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)白藜蘆醇含量的影響 由圖1b 所示,隨著超聲時(shí)間的增加,白藜蘆醇含量迅速增加,12 min 后達(dá)到頂峰168.86±0.74 μg/g,與其他水平具有顯著性差異(P<0.05),而后開始下降,這可能是由于超聲波的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞的破碎,促進(jìn)白藜蘆醇的溶出,繼續(xù)增加超聲時(shí)間,體系溫度升高,而白藜蘆醇在光、熱條件下穩(wěn)定性較弱,且時(shí)間越長(zhǎng),白藜蘆醇部分被氧化,從而導(dǎo)致含量下降。

    2.1.3 超聲功率對(duì)白藜蘆醇含量的影響 如圖1c 所示,超聲功率的增加的同時(shí),白藜蘆醇含量上升,功率為300 W 時(shí),含量達(dá)到最高163.64±0.49 μg/g,與其他水平具有顯著性差異(P<0.05),之后開始下降,這可能是由于隨著功率的增加,超聲波的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)加強(qiáng),促進(jìn)白藜蘆醇的溶出,繼續(xù)增加超聲功率,白藜蘆醇受到破壞而含量下降。

    2.1.4 料液比對(duì)白藜蘆醇含量的影響 如圖1d 所示,料液比中提取溶劑增加的同時(shí),白藜蘆醇含量先增加后趨于穩(wěn)定,到1:40 g:mL 時(shí)達(dá)到最高,達(dá)到159.98±0.63 μg/g,除與1:50 g:mL 水平無(wú)顯著差異外(P>0.05)和其他水平均具有顯著性差異(P<0.05),這可能是由于料液比在1:40 g:mL 之前,溶劑的增加促進(jìn)白藜蘆醇的擴(kuò)散溶出,料液比到達(dá)1:40 g:mL 后,這種溶劑促溶達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,使得白藜蘆醇的提取量趨于穩(wěn)定結(jié)果

    2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

    2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

    表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Response surface experiment scheme and results

    利用軟件Design Expert 13 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,建立白藜蘆醇含量(R)與乙醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲功率(C)、液料比(D)之間的二次回歸模型。得到回歸方程如下:

    2.2.2 模型方差分析 由表3 方差分析可得,模型失擬項(xiàng)不顯著(P=0.3005>0.05),而模型P<0.01,表明模型方程高度顯著,由此得模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值比較相符,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠,同時(shí),本實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)1.82%,說明模型的置信度高,決定系數(shù)R2=0.8843,表明模型方程能夠較好的反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)情況。該模型方程可以用來(lái)預(yù)測(cè)不同提取工藝下花生根白藜蘆醇的含量。通過分析表3 的P值可得乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度和超聲時(shí)間、乙醇濃度和超聲功率、乙醇濃度二次項(xiàng)、超聲功率二次項(xiàng)、超聲時(shí)間二次項(xiàng)和料液比二次項(xiàng)對(duì)含量的影響顯著,即實(shí)驗(yàn)的影響因素對(duì)響應(yīng)值并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,而交互項(xiàng)以及二次項(xiàng)也存在顯著影響。超聲時(shí)間、超聲功率和乙醇濃度對(duì)白藜蘆醇提取含量的影響達(dá)到顯著性水平,影響次序?yàn)槌暪β剩–)>乙醇濃度(A)>超聲時(shí)間(B)。

    表3 模型的ANOVA 分析結(jié)果Table 3 ANOVA analysis results of the model

    2.2.3 響應(yīng)面分析 因素與因素間交互作用的曲面圖和等高線圖如圖2a~圖2f 所示。曲面面的傾斜程度反映出實(shí)驗(yàn)值隨實(shí)驗(yàn)條件變化而變化,曲面斜率越大, 實(shí)驗(yàn)條件的變化對(duì)白藜蘆醇提取量影響程度越大,反之,越平緩影響則越小。等高線圖呈圓形說明因素與因素的相互作用影響非顯著,呈橢圓說明因素與因素的相互作用影響顯著,且中心位置向邊緣延伸,白藜蘆醇含量逐漸減少[32-34]。分析圖2 并結(jié)合ANOVA表可知,各因素兩兩之間均存在交互作用,其中乙醇濃度和超聲時(shí)間、乙醇濃度和超聲功率之間的交互作用顯著(P<0.05)。

    圖2 各因素之間的交互作用對(duì)白藜蘆醇含量的響應(yīng)曲面及等高線Fig.2 Response surface and contour line of interaction among various factors to resveratrol content

    2.2.4 最佳工藝驗(yàn)證 通過軟件優(yōu)化分析得出最佳提取工藝條件為超聲功率288.078 W,超聲時(shí)間11.472 min,料液比1:38.183 g:mL,乙醇濃度為91.695%,含量為177.574 μg/g??紤]到實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)際操作,簡(jiǎn)化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)條件為超聲功率290 W、超聲時(shí)間12 min、料液比1:38 g:mL 和乙醇濃度90%含量為175.53±1.57 μg/g,與預(yù)測(cè)值相近,模型可靠。提取結(jié)果高于陳瓊玲[35]的溶劑提取和王巖等[36]的蒸汽爆破提取。

    通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的最優(yōu)提取條件為超聲功率290 W,超聲時(shí)間12 min,料液比1:38 g:mL,乙醇濃度為90%,工藝穩(wěn)定可靠。

    2.3 大孔樹脂對(duì)白藜蘆醇的分離純化

    2.3.1 大孔樹脂吸附與解吸實(shí)驗(yàn)

    2.3.1.1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué) 從圖3a 得,在前20 min內(nèi),曲線斜率較大,說明H103 樹脂對(duì)白藜蘆醇的吸收較快,之后吸收速率變緩,到60 min 以后,吸收量趨于穩(wěn)定,說明樹脂已基本吸附飽和。所以選擇60 min 為上樣液的靜態(tài)吸附時(shí)間。

    圖3 大孔樹脂對(duì)白藜蘆醇的吸附與解析效果Fig.3 Adsorption and resolution of resveratrol by macroporous resin

    2.3.1.2 靜態(tài)吸附等溫曲線 從圖3b 得,隨著洗脫液乙醇濃度的增加,白藜蘆醇解吸率先增加后逐漸降低,乙醇濃度為70%時(shí),解吸率最高。原因可能是當(dāng)乙醇濃度較低時(shí)不能破壞白藜蘆醇與樹脂之間的氫鍵,從而白藜蘆醇較難被洗脫;而當(dāng)乙醇濃度大于70%時(shí),高濃度乙醇和白藜蘆醇極性相差較大,故解吸率下降。所以選擇70%乙醇作為解吸液。

    2.3.1.3 上樣流速與上樣體積 從圖3c 得,上樣流速為0.5 和1.0 mL/min 時(shí),兩者吸附率高且相近,綜合吸附率和吸附時(shí)間,選擇1.0 mL/min 的流速上樣。從圖3d 得,當(dāng)流出液體積達(dá)到120 mL 時(shí),流出液中白藜蘆醇濃度達(dá)到19.26 μg/mL,此時(shí)已接近上樣濃度的1/10 即達(dá)到泄漏點(diǎn)[25,37]。

    2.3.1.4 洗脫流速與洗脫體積 從圖3e 得,在0.25和0.5 mL/min 流速洗脫下,兩者解吸率高且相近,綜合解吸率和解吸時(shí)間,洗脫流速選擇0.5 mL/min。從圖3f 得,160 mL 時(shí),洗脫液中白藜蘆醇的量只有21.34 μg/mL,隨著洗脫液體積的增加含量無(wú)明顯變化,選擇上樣量為160 mL。

    綜上白藜蘆醇的純化工藝為:樹脂H103,上樣的質(zhì)量濃度為70%原液質(zhì)量濃度即201.13 μg/mL,上樣速率為1.0 mL/min,上樣量為120 mL,洗脫溶劑為90%乙醇,洗脫流速為1.0 mL/min,洗脫量為160 mL。

    2.4 大孔樹脂初純物純度的測(cè)定

    由表4 得,純化后白藜蘆醇初純物純度達(dá)到49.19%±0.81%,與駱航等[26]的純化結(jié)果34.77%和武鵬程[38]的純化結(jié)果39.61%相比均有所提高,且RSD 值1.65%,表明工藝的純化效果和重現(xiàn)性良好。

    表4 樣品純度的測(cè)定Table 4 Determination of sample purity

    3 結(jié)論

    通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化確定最佳提取條件:乙醇濃度90%、超聲功率290W、超聲時(shí)間12 min、料液比1:38 g:mL,白藜蘆醇的含量為175.53±1.57μg/g。優(yōu)化后,經(jīng)H103 樹脂一次處理,粗產(chǎn)品中白藜蘆醇的純度為49.19%±0.81%,RSD為1.65%。超聲輔助提取白藜蘆醇和大孔樹脂初步純化白藜蘆醇是可行的,可為花生根的合理開發(fā)和綜合利用以及天然白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

    從實(shí)驗(yàn)室走向工廠,需要經(jīng)歷小試、中試等諸多環(huán)節(jié)。這對(duì)于工藝條件的穩(wěn)定性要求更加嚴(yán)格,諸如提取時(shí)的溶劑揮發(fā)引起的料液比變化、純化用的柱材料和上樣的溫度等因素可能因?yàn)橐?guī)模的放大而成為重要影響因素,這在后續(xù)的研究中有必要進(jìn)行考查。日常生活中,不同的應(yīng)用場(chǎng)景對(duì)于白藜蘆醇純度的要求不同,后續(xù)可考慮對(duì)粗產(chǎn)品進(jìn)行分級(jí)純化,以得到滿足不同需求的白藜蘆醇產(chǎn)品。

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