長莖葡萄蕨藻中β-1,3-木聚糖的提取工藝優(yōu)化及單糖組成分析

劉 倩，晉文慧 ，矯浩田，謝全靈，張怡評，洪 專，趙元暉

（1.自然資源部第三海洋研究所，海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心，福建廈門 361005；2.中國海洋大學(xué)三亞海洋研究院，海南三亞 572024；3.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建廈門 361000）

自然界植物藻類中半纖維素是第二大豐富的多聚糖，僅次于纖維素，含量約占20%～30%，其主要成分是木聚糖[1-2]。木聚糖可分為β-1,4-木聚糖和β-1,3-木聚糖[3]。β-1,4-木聚糖主要發(fā)現(xiàn)在陸生植物細胞壁的半纖維素中，而β-1,3-木聚糖主要存在于海藻的細胞壁多糖中[4-5]。一些紅藻和綠藻細胞壁中完全不含纖維素，取而代之的是β-1,3-木聚糖[6-8]。功能性海藻如紅藻和綠藻的細胞壁含有較多的β-1,3-木聚糖[9-10]，如紅藻中的紫菜屬（porphyra）[11]、紅皮藻屬紅皮藻屬（Rhodymenia）[12]，綠藻中的石莼屬（Ulva）[13]、蕨藻屬（Caulerpa）[14]、松藻屬（Codium）[15]。其中有兩種蕨藻較為常見，一種是目前已經(jīng)人工養(yǎng)殖的可食用長莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）[16]，另一種是高度入侵物種杉葉蕨藻（Caulerpa taxifolia）[17-18]。長莖葡萄蕨藻又名海葡萄，含有多糖、粗纖維、多種氨基酸與維生素，呈味氨基酸含量較高[19]，總脂肪含量較低，不含膽固醇，還富多種微量元素，與其他海藻相比，是潛在的高營養(yǎng)價值保健食品[20-22]。多糖作為長莖葡萄蕨藻主要的活性成分，近十年來成為學(xué)者們首要研究的重點[23]，目前一些報道揭示了β-1,3-木聚糖具有抗氧化、抗炎、抗病毒和抗癌等活性[24]。

海藻多糖的提取方法主要有醇提法[25-26]、熱水提取法[27]、微波輔助提取法[28-29]、超聲波輔助提取法[30-31]等，β-1,3-木聚糖在長莖葡萄蕨藻中的提取得率明顯高于其他藻類[32]，又因其營養(yǎng)價值較高，被廣泛應(yīng)用于藥品、食品與保健品中，故多糖的成分組成分析對其應(yīng)用有重要意義，因此對其單糖組分進行研究分析可對后續(xù)β-1,3-木聚糖的應(yīng)用提供參考。單糖組成分析的方法有很多，多數(shù)分析方法需要先對多糖進行降解，本研究采用堿提法來提取β-1,3-木聚糖并采用特異性酶解法對其進行鑒定，β-1,3-木聚糖酶Xyl3088 從太平洋火色桿菌Flammeovirga pacifica菌株WPAGA1 的編碼基因中翻譯而來，它是降解β-1,3-木聚糖以得到短鏈β-1,3-低聚木糖和木糖的水解酶，可確定其單糖組成成分[33]。本研究通過對常見經(jīng)濟藻類進行篩選，并利用單因素實驗和正交試驗優(yōu)選β-1,3-木聚糖的最佳提取工藝，以期為β-1,3-木聚糖功效物質(zhì)的制備及后續(xù)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長莖葡萄蕨藻 杭州牧海食品經(jīng)營有限公司；紫菜（Porphyra）、南極冰筍（Durvillaea antarctica）、紅皮藻（Palmaria palmata）、海帶（Laminaria japonica）、石蒓（Ulva lactuca）、滸苔（Enteromorpha proliferaMuller J. Agardh）、羊棲菜（Sargassum fusiforme） 自然資源部第三海洋研究所藻類保藏庫；極品肉湯、氨芐青霉素鈉、甘油、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG） 北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨、酵母粉 OXIOD 公司；瓊脂粉 廣東環(huán)凱微生物科技公司；SDS-PAGE 凝膠試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；4×Laemmli Sample Buffer、10×Tris-Glycine-SDS 電泳緩沖液 BIO-RAD 公司；Fast Blue蛋白快速染色液 Biosharp 公司；磷酸緩沖液 西隴科學(xué)股份有限公司；三氟乙酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、乙酸、氯化鈉、無水乙醇、高氯酸鈉、Tris 分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；β-1,4-D-（+）-木糖 標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；所有菌株和質(zhì)粒均由自然資源部第三海洋研究所構(gòu)建保存；菌株：宿主菌為大腸桿菌Escherichia coliBL21（DE3） 生工生物工程（上海）股份有限公司提供；質(zhì)粒：pET-22b（+） 氨芐抗性，由蘇州金唯智生物科技有限公司提供。

DFT-200A 200g 手提式高速粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；RXH-8 熱風(fēng)循環(huán)烘箱 南京鑾豪機械設(shè)備有限公司；FNLY-2 冷凍干燥機 上海翡諾醫(yī)藥設(shè)備有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；ZD-9950轉(zhuǎn)移搖床 其林貝爾公司；JY92-IIN 超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；ZQTY-90S 振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺 蘇凈基團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Ni NTA Beads 6FF 重力柱 常州天地人和生物科技有限公司；GIS-2008 成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；DB-I 不銹鋼電熱板 上海梅香儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1.2.1.1 苯酚-硫酸法測多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 和1.0 mL 現(xiàn)配的0.1 mg·mL-1的D-木糖溶液，每一管用去離子水補加至1 mL，在冰浴條件下加入0.5 mL 5%的苯酚溶液，混勻后緩慢加入3 mL 濃硫酸，待其處于不放熱狀態(tài)時，冷卻后于490 nm 處測吸光度[33]。以吸光度Y 為縱坐標(biāo)，D-木糖濃度X（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程為y=2.3806x-0.0145，R2=0.9993。

1.2.1.2 DNS 法測還原糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別吸取0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28、0.32 和0.4 mL 現(xiàn)配的1 mg·mL-1的D-木糖溶液，每一管用去離子水補加至為1 mL，再加入0.4 mL DNS 試劑，沸水浴5 min，冷卻后加入2.6 mL 蒸餾水，于540 nm處測吸光度[34]。以吸光度Y 為縱坐標(biāo)，D-木糖濃度X（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程為y=1.1484x-0.0051，R2=0.9992。

1.2.2 不同海藻中粗木聚糖的提取 由于β-1,3-木聚糖沒有商業(yè)銷售，參考Iriki 等[11]的方法通過以下步驟獲得純度較高的粗木聚糖。

如圖1 所示，將長莖葡萄蕨藻、海帶、紫菜、紅皮藻、石蒓、南極冰筍、滸苔和羊棲菜分別進行清洗干凈，于60 ℃烘箱內(nèi)烘干后用研磨機碾成粉末，待用。

圖1 提取工藝流程圖Fig.1 Extraction process flow chart

分別稱取20 g 長莖葡萄蕨藻、紅皮藻、石蒓、滸苔、南極冰筍、羊棲菜粉末，依次加入1000 mL 0.3 mol·L-1的NaOH 溶液，加熱煮沸30 min，待其冷卻至室溫，6 ℃條件下離心（10000 r·min-1）20 min，棄上清液，并用去離子水洗滌沉淀兩遍；將沉淀轉(zhuǎn)入1000 mL 0.25 mol·L-1硫酸溶液中重復(fù)上一步操作；向沉淀中加入1600 mL 2% NaClO4溶液，于25 ℃下攪拌脫色2 h 除去雜質(zhì)，再用去離子水洗滌離心沉淀3 次；向脫色后的沉淀中加入800 mL 2.5 mol·L-1NaOH 溶液，冰浴攪拌1.5 h 后于6 ℃離心（10000 r·min-1）20 min，棄沉淀，收集上清；在燒杯中加入4 倍體積無水乙醇，再沿壁緩緩倒入上清，靜置冷藏庫4 ℃過夜；取醇沉后得到的沉淀，6 ℃離心（10000 r·min-1）20 min 收集沉淀，于1200 mL 的5.7 mol·L-1無水乙酸溶液中和洗滌，再用去離子水洗滌離心三遍去除殘留乙酸；將上述沉淀即粗木聚糖轉(zhuǎn)移至凍干機真空干燥，取出并碾成粉末，待用。

1.2.3 長莖葡萄蕨藻粗木聚糖提取單因素條件優(yōu)化

1.2.3.1 NaOH 濃度對粗木聚糖得率的影響 步驟同1.2.2 除去酸堿雜質(zhì)后，料液比1:40 g·mL-1，選取1.0、2.0、2.5、3.0 和4.0 mol·L-1不同濃度NaOH 作為提取劑，在冰浴條件下提取1.5 h，再經(jīng)NaClO4脫色，醇沉后凍干，計算粗木聚糖得率。

1.2.3.2 提取時間對粗木聚糖得率的影響 步驟同1.2.2 除去酸堿雜質(zhì)后，料液比1:40 g·mL-1，以濃度為2.5 mol·L-1NaOH 水溶液為提取劑，在冰浴條件下分別提取1、1.5、2、3 和5 h，再經(jīng)NaClO4脫色，醇沉后凍干，計算粗木聚糖得率。

1.2.3.3 料液比對粗木聚糖產(chǎn)量的影響 步驟同1.2.2 除去酸堿雜質(zhì)后，以濃度為2.5 mol·L-1NaOH水溶液為提取劑，選取1:20、1:40、1:60、1:80、1:100 和1:120 g·mL-1不同料液比條件，在冰浴條件下提取1.5 h，再經(jīng)NaClO4脫色，醇沉后凍干，計算粗木聚糖得率。

1.2.4 正交試驗 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇合適的NaOH 濃度（A）、提取時間（B）和料液比（C）為參考因素，以粗木聚糖得率為指標(biāo)，選擇單因素試驗影響較大的堿量、提取時間和料液比3 個因素，進行三因素三水平正交試驗，確定粗木聚糖提取工藝條件的最優(yōu)組合。

1.2.5 特異性β-1,3-木聚糖酶（Xyl3088）制備與純化由蘇州金唯智公司合成并驗證了Xyl3088 的基因序列，構(gòu)建了pET-His-Xyl3088-SpyTag 表達載體，并將上述質(zhì)粒成功地導(dǎo)入宿主菌E.coliBL21（DE3）中進行表達[33]。于200 mL LB 培養(yǎng)基內(nèi)依次加入0.2 mL 0.1 g·mL-1氨芐青霉素鈉溶液和250 μL 甘油菌，于搖床37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)12 h 活化；在400 mL TB 培養(yǎng)基內(nèi)依次加入0.2 mL 0.1 g·mL-1氨芐青霉素鈉溶和2 mL 活化后的菌液，于搖床37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)3～4 h，待菌體處于對數(shù)生長期時，加入1 mL 0.1 mol·L-1IPTG 溶液，于搖床20 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)24 h 進行誘導(dǎo)表達；將誘導(dǎo)表達后的菌液于4 ℃，10000 r·min-1條件下離心20 min 后棄掉上清，將菌體細胞與PBS 緩沖液（pH=7.0）混合（1：20，v/v），重復(fù)上述離心操作；菌體細胞于冰浴條件下進行細胞破碎，超聲功率300 W（50%），超聲開時間2 s，超聲關(guān)時間4 s，工作時間20 min；細胞經(jīng)超聲破碎后于4 ℃，11000 r·min-1條件下離心20 min，上清液經(jīng)0.45 μm 的濾膜過濾后即為酶液粗提物。經(jīng)鎳柱進行分離純化，使用濃度從低到高的咪唑緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白以確定最佳的咪唑洗脫濃度，聯(lián)合SDS-PAGE 分析鎳柱吸附目的蛋白質(zhì)的情況，最后收集各流出液通過SDS-PAGE 電泳鑒定目的蛋白。

1.2.6 粗木聚糖單糖組成成分的鑒定

1.2.6.1 不同海藻粗木聚糖的制備、酶解及酶解前后還原糖含量測定 分別將長莖葡萄蕨藻、紅皮藻、石蒓、滸苔、羊棲菜、南極冰筍、海帶和紫菜在提取時間3 h、NaOH 濃度2.5 mol·L-1、料液比1:100 g·mL-1的條件下制得粗木聚糖，精密稱取0.1 g 溶于Tris-HCl 溶液（pH=7.0）配制成1%粗木聚糖溶液。取400 μL 的1%的粗木聚糖溶液于離心管中，加入50 μL Xyl3088（酶活為49 U/mg），37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)24 h，再于100 ℃煮沸5 min 使酶滅活，離心收集上清即為1%β-1,3-木寡糖溶液，為酶解實驗組。將Xyl3088 替換為去離子水，重復(fù)上述操作，為空白對照組。通過DNS 法測定了空白對照組與酶解實驗組的還原糖含量，在540 nm 處測定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算還原糖含量。

1.2.6.2 長莖葡萄蕨藻粗木聚糖的酶解產(chǎn)物的薄層鑒別 稱取粗木聚糖1.0 g，加入20 mL 濃度為1 mol·L-1的三氟乙酸，利用三氟乙酸的強酸性，對β-1,3-木聚糖充分水解，在70 ℃孵育2 h 和12 h 后分別取少量木寡糖溶液離心，上清液用1 mol·L-1的NaOH 進行中和至pH=7.0，便可作為薄層層析色譜標(biāo)準(zhǔn)品使用[35]。將上述溶液分別在薄層板上點樣展開，由于極性的不同，各成分隨著展開劑不斷上升，當(dāng)距離硅膠頂端5 cm 處，取出，均勻噴灑顯色劑，放置250 ℃電爐加熱10 min 顯色拍照。

展開劑：正丁醇:冰醋酸:去離子水=10:5:3。

顯色劑：2.0 g 二苯胺、2 mL 苯胺、10 mL 磷酸、100 mL 丙酮配制而成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)重復(fù)進行3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。實驗數(shù)據(jù)整理采用Excel 2019；數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 24.0 軟件，并進行顯著性分析；繪圖采用Origin Pro 2021 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻中粗木聚糖提取結(jié)果對比

通過堿提法對長莖葡萄蕨藻、紫菜、南極冰筍、紅皮藻、海帶、石蒓、滸苔和羊棲菜進行初步篩選，計算粗木聚糖得率（見圖2），長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率最高，可達到13.67%±0.25%，其他幾種藻類的得率較低，均在5%以下。研究表明，董喆[36]采用水提醇沉法，以超純水為溶劑，在提取時間3 h，提取溫度80 ℃，料液比為1:30 g·mL-1的條件下對長莖葡萄蕨藻多糖進行提取，最終得率約為5.04%。與水提醇沉法和超聲波輔助法的結(jié)果[36-37]相比，堿提法的粗木聚糖得率最高，且長莖葡萄蕨藻的粗木聚糖得率遠高于其它經(jīng)濟藻類，故選取長莖葡萄蕨藻作為對象，進行下一步研究。

圖2 不同海藻中粗木聚糖得率Fig.2 Yield of crude xylan in different algae

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 NaOH 濃度對粗木聚糖得率的影響 在料液比1:40 g·mL-1，提取時間為1.5 h 的條件下，以粗木聚糖得率為考察指標(biāo)，考察NaOH 濃度對粗木聚糖產(chǎn)量的影響。由于木聚糖難溶于水，易溶于堿溶液，所以堿液濃度是提取的重要參數(shù)。木聚糖作為細胞壁中的一類結(jié)構(gòu)性多糖，它與纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和多糖等形成較為復(fù)雜的共價鍵，有非常復(fù)雜的物理交纏關(guān)系，在水提法和稀堿條件下，提取困難[38]。由圖3 可知，當(dāng)NaOH 濃度為1 mol·L-1時，粗木聚糖得率較低，僅為3.6%±0.1%，表明較低NaOH 濃度的處理作用較弱，不能完全透過長莖葡萄蕨藻細胞壁，從而導(dǎo)致提取率低，只能溶解出與木質(zhì)素、纖維素等其他木聚糖成分結(jié)合程度較低的部分，而不足以完全破壞長莖葡萄蕨藻的結(jié)構(gòu)，以溶解出較多的木聚糖[39]。當(dāng)NaOH 濃度到2.5 mol·L-1時，得率趨于平緩，達到21.4%±0.2%；隨著NaOH 溶液濃度增加，NaOH 溶液濃度為4 mol·L-1時，可能導(dǎo)致糖的降解，故引起木聚糖得率略有降低至20.0%±0.2%。因此，在兼顧得率和經(jīng)濟性的同時，選擇濃度為2.5 mol·L-1NaOH 溶液作為最佳提取液條件。

圖3 NaOH 濃度對長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率的影響Fig.3 Effect of NaOH concentration on yield of crude xylan from Caulerpa lentillifera

2.2.2 提取時間對粗木聚糖得率的影響 在料液比1:40 g·mL-1，以濃度為2.5 mol·L-1NaOH 水溶液為提取劑的條件下，以粗木聚糖得率為考察指標(biāo)，考察不同提取時間對粗木聚糖產(chǎn)量的影響。由圖4 可知，當(dāng)提取時間從1 h 增大到3 h 時，粗木聚糖得率隨著水解時間的增大而逐漸升高，由18.6%±0.1%提高至24.1%±0.2%，結(jié)果表明適當(dāng)延長水解時間有助于提高粗木聚糖的得率。在提取時間較短的情況下，提取液和多糖的接觸不完全，混合不徹底，長莖葡萄蕨藻組織原料的多糖組分隨著時間增加逐漸降低，多糖物質(zhì)的濃度梯度繼續(xù)降低，不斷溶解并擴散到提取液中使得溶劑中多糖含量逐漸增加[40]。當(dāng)提取時間為大于3 h 時，粗木聚糖得率增加變得緩慢，趨于穩(wěn)定。由增加提取時間帶來的收益并不顯著，過度增加提取時間并沒有太大的意義，出于節(jié)約時間及能源的考慮，選擇提取時間為3 h 最佳預(yù)處理條件。

圖4 提取時間對長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of crude xylan from Caulerpa lentillifera

2.2.3 料液比對粗木聚糖得率的影響 以濃度為2.5 mol·L-1NaOH 水溶液為提取劑，提取時間為1.5 h條件下，以粗木聚糖得率為考察指標(biāo)，考察不同料液比對粗木聚糖得率的影響。由圖5 可知，當(dāng)料液比為1:20 g·mL-1時，粗木聚糖得率較低，僅為8.2%±0.1%，可能是由于樣品濃度過高，溶劑的量較少，物質(zhì)的溶解擴散緩慢，不利于細胞壁中木聚糖的溶解溶出，從而得率較低。隨著料液比的降低，提取物和提取劑的接觸面積也在不斷增大，傳遞速率也隨之增高，粗木聚糖得率也隨之迅速升高，可達21.1%±0.3%。當(dāng)料液比小于1:100 g·mL-1時，粗木聚糖得率有所減少，降至19.7±0.4%，這是因為在提取物有限的表面積的基礎(chǔ)上，溶劑量增大導(dǎo)致多糖濃度降低，有利于多糖的傳質(zhì)。當(dāng)溶劑量大于一定程度后，在制備及收集過程中，原料的損耗也隨之增加，后續(xù)濃縮過程耗能和時間會隨之增加[27]。于是隨著料液比的減少，長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率會出現(xiàn)小幅降低的趨勢。因此，選擇料液比1:100 g·mL-1為最佳預(yù)處理條件。

圖5 料液比對長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率的影響Fig.5 Effect of feed-liquid ratio on yield of crude xylan from Caulerpa lentillifera

2.3 正交試驗結(jié)果

2.3.1 正交試驗設(shè)計結(jié)果及驗證 在單因素實驗基礎(chǔ)上，選擇NaOH 濃度（A）、提取時間（B）和料液比（C）三個因素，進行三因素三水平正交試驗。各因素水平見表1，提取粗木聚糖的正交試驗結(jié)果見表2。

表1 長莖葡萄蕨藻粗多糖提取正交試驗Table 1 Orthogonal experiment of crude xylan extraction from Caulerpa lentillifera

表2 長莖葡萄蕨藻粗木聚糖提取正交試驗結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal test for crude xylan extraction from Caulerpa lentillifera

由表2 可知，試驗號5 號的粗木聚糖得率最高，為27.2%。不同提取條件對長莖葡萄蕨藻粗木聚糖的影響程度不同，R 值越大，表明該因素對粗木聚糖得率的影響越大[41]，因此影響提取因素順序為提取時間（B）＞料液比（C）＞NaOH 濃度（A），即提取時間對粗木聚糖得率影響最大，其次是料液比和NaOH濃度。通過比較K 值可知，3 個因素的最佳水平為A2B2C3，即提取時間3 h、NaOH 濃度2.5 mol·L-1、料液比1:100 g·mL-1。

2.3.2 方差分析及驗證最優(yōu)工藝試驗 正交試驗方差分析結(jié)果見表3，由表可知，三個因素對長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率的影響順序為提取時間（B）＞料液比（C）＞NaOH 濃度（A），與極差分析結(jié)果一致。由P值可知，三個因素中提取時間對粗木聚糖得率有顯著影響。為進一步驗證最優(yōu)工藝可靠性，在最佳提取條件下，重復(fù)三次，測得長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率為28.1%±0.6%，高于正交試驗結(jié)果，表明該條件穩(wěn)定可行。

表3 長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率回歸模型方差分析Table 3 Regression model ANOVA for crude xylan yield of Caulerpa lentillifera

2.4 β-1,3-木聚糖酶的表達與鑒定結(jié)果

SDS-PAGE 分析如圖6 所示，在第1 泳道可看見在分子量40～55 kDa 中間有明顯的條帶，分子量與由ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）計算出的相應(yīng)理論值48.2 kDa 相吻合，說明含有重組蛋白Xyl3088[33]，用Image J 軟件進行灰度分析得到目標(biāo)蛋白的純度，結(jié)果表明純度可達90%以上，說明已經(jīng)成功地將Xyl3088 的基因在大腸桿菌中表達，可用于后續(xù)木聚糖的酶解。

圖6 Xyl3088 鎳柱純化后電泳圖Fig.6 SDS-PAGE of Xyl3088

2.5 不同海藻中β-1,3-木聚糖的鑒定結(jié)果

到目前為止，根據(jù)碳水化合物活性酶（CAZy）數(shù)據(jù)庫可知，所有發(fā)現(xiàn)的β-1,3-木聚糖酶都屬于糖苷水解酶（GH）家族26。特異性水解酶β-1,3-木聚糖酶（Xyl3088）可以酶解β-1,3-木聚糖中的β-1,3-木糖基，以得到短鏈β-1,3-木寡糖，產(chǎn)物主要以β-1,3-木二糖和β-1,3-木三糖為主[8]。由圖7 說明，長莖葡萄蕨藻中粗木聚糖溶液酶解后產(chǎn)生大量還原糖，說明該粗木聚糖為β-1,3-木聚糖，且其酶解產(chǎn)物中還原糖含量為12.23%±0.41%，而海帶、紫菜、南極冰筍、紅皮藻、羊棲菜、滸苔和石莼等酶解結(jié)果表明，其β-1,3-木聚糖含量相對較低，并沒有明顯的顯色反應(yīng)，說明這幾種經(jīng)濟藻類中并不含β-1,3-木聚糖或含量很低。

圖7 不同海藻粗木聚糖酶解前后還原糖含量Fig.7 Content of reducing sugars before and after enzymatic hydrolysis of crude xylan from different algae

2.6 長莖葡萄蕨藻粗木聚糖單糖組成成分的鑒定

β-1,3-木聚糖酶（EC 3.2.1.32）能特異性水解β-1,3-木聚糖中1,3-糖苷鍵，產(chǎn)物為具還原性的β-1,3-D-木糖，三氟乙酸同樣可以通過其強酸性將β-1,3-木聚糖斷裂成不同程度的寡糖或單糖成分，但β-1,3-木聚糖酶為特異性裂解酶可以更準(zhǔn)確識別酶切位點，以獲得所需的目的產(chǎn)物，從而特異性地鑒定粗木聚糖單糖組成成分。利用自制的Xyl3088 酶解粗木聚糖得到寡糖溶液，對其進行薄層層析分析（見圖8）以確定酶解產(chǎn)物。因市面無β-1,3-木聚糖和β-1,3-木寡糖標(biāo)準(zhǔn)品[42]，故利用三氟乙酸的強酸性，對β-1,3-木聚糖充分水解，將1 mol·L-1的TFA 于70 ℃下降解β-1,3-木聚糖，在2 h 和12 h 分別取少量寡糖溶液離心，上清液用1 mol·L-1的NaOH 進行中和后進行薄層層析。在水解2 h 時，β-1,3-木聚糖并未完全降解，所得產(chǎn)物與Xyl3088 的酶解產(chǎn)物類型一致；在水解12 h 時，β-1,3-木聚糖幾乎完全被酸解，得到單一組分，推測與β-1,4-D-木糖標(biāo)準(zhǔn)品同屬于單糖成分[42]。Xyl3088 顯示出一定的酶解活性，產(chǎn)生一系列包括木糖、木二糖、木三糖和木四糖在內(nèi)的β-1,3-木寡糖，水解產(chǎn)物主要為二糖，初步證明從長莖葡萄蕨藻中提取的粗木聚糖為β-1,3-木聚糖。本研究僅采用薄層色譜法對β-1,3-木聚糖的單糖組成進行了定性分析，而未進行定量分析，后續(xù)可通過進一步的檢測分析確定單糖組分及酶解產(chǎn)物種各寡糖含量。

圖8 水解木聚糖產(chǎn)物的薄層色譜圖Fig.8 TLC of hydrolysis products of xylan

3 結(jié)論

本研究通過對常見經(jīng)濟藻類進行篩選，發(fā)現(xiàn)長莖葡萄蕨藻中β-1,3-木聚糖含量遠遠高于其他經(jīng)濟藻類，故確定了將長莖葡萄蕨藻作為提取β-1,3-木聚糖主要原料。采用堿提方法，在提取時間3 h、NaOH濃度為2.5 mol·L-1、料液比1:100 g·mL-1的條件下，粗木聚糖的得率可達28.1%±0.6%，優(yōu)于其他傳統(tǒng)提取方法。同時，經(jīng)β-1,3-木聚糖酶特異性酶Xyl3088酶解，結(jié)合薄層色譜鑒定酶解產(chǎn)物，表明該堿溶性粗多糖為β-1,3-木聚糖。綜上所述，本研究優(yōu)化了β-1,3-木聚糖的提取工藝并明確了β-1,3-木聚糖的單糖組成，為進一步開展β-1,3-木聚糖的純化、結(jié)構(gòu)解析與寡糖功能研究奠定了基礎(chǔ)，對β-1,3-木聚糖的深入研究具有指導(dǎo)意義。