三種獼猴桃莖中總生物堿提取工藝優(yōu)化及抑菌活性分析

劉德江，郭樂樂，田立娟，李 黎，楊天竹，張慧明，李麗麗，夏 俊,

（1.佳木斯大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.中-烏農(nóng)林技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯 154007；3.中國科學(xué)武漢植物園，湖北武漢 430074；4.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）、葛棗獼猴桃（Actinidia polygama）及狗棗獼猴桃（Actinidia kolomikta）作為獼猴桃科獼猴桃屬三種多年生落葉攀緣藤本植物，分布于北方高寒地區(qū)，果實(shí)小，表面無毛，自然成熟口感好，含有多種氨基酸、脂肪、蛋白質(zhì)及大量的三萜、生物堿、甾體及揮發(fā)油等各類化學(xué)成分，具有豐富的營養(yǎng)價值[1-3]和藥用價值[4-6]，三種獼猴桃均可作為藥食同源的植物。近年來，軟棗獼猴桃在東北三省種植面積不斷擴(kuò)大，葛棗獼猴桃和狗棗獼猴桃也有栽培，獼猴桃每年需要進(jìn)行修剪，會產(chǎn)生大量廢棄枝條被丟棄，造成了資源浪費(fèi)。

研究發(fā)現(xiàn)，軟棗獼猴桃、葛棗獼猴桃和狗棗獼猴桃中均含有生物堿類物質(zhì)[7-9]，生物堿是傳統(tǒng)中藥材中的重要活性成分之一，在植物中分布廣泛，具有抗病、抗癌和抗腫瘤等作用[10-12]。大多數(shù)的生物堿可以抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、抑制細(xì)菌代謝、抑制核酸和蛋白質(zhì)合成等方法抑制細(xì)菌，具有廣泛的抑菌性[13-15]。但是，目前對三種獼猴桃中總生物堿的提取工藝及抑菌活性研究鮮有報(bào)道。獼猴桃潰瘍病是嚴(yán)重威脅獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病害，其是由幾種病原菌引起的，包括丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種，此種病菌傳播速度快，且一旦感染將很有可能造成大面積植株死亡，造成經(jīng)濟(jì)損失。目前沒有有效的方法防治獼猴桃潰瘍病，使用的藥劑大多為化學(xué)制劑，對環(huán)境、土壤有一定影響[16-18]。

為了解決上述問題，利用獼猴桃廢棄枝條提取總生物堿，建立高效的提取方法，并將其應(yīng)用于軟棗獼猴桃潰瘍病的防治上，本試驗(yàn)對軟棗獼猴桃、葛棗獼猴桃和狗棗獼猴桃莖中總生物堿含量及提取工藝進(jìn)行系統(tǒng)研究，考察液料比、超聲功率、超聲時間及乙醇濃度對總生物堿得率的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)化其最佳提取工藝，并探究總生物堿對引起獼猴桃病害的幾種病原菌的抑菌活性。本研究內(nèi)容不僅可以建立一種高效的從獼猴桃莖中提取總生物堿的工藝，達(dá)到獼猴桃廢物利用增加其附加值的目的，并且可以將總生物堿應(yīng)用于獼猴桃潰瘍病的防治，解決傳統(tǒng)藥劑污染環(huán)境及土壤的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

軟棗獼猴桃、葛棗獼猴桃及狗棗獼猴桃的根、枝條、葉 均采摘于佳木斯大學(xué)農(nóng)林試驗(yàn)示范基地，經(jīng)佳木斯大學(xué)程海濤副教授鑒定為獼猴桃科獼猴桃屬軟棗獼猴桃（Actinidia arguta） 、葛棗獼猴桃（Actinidia polygama）及狗棗獼猴桃（Actinidia kolomikta）。將獼猴桃材料陰干，粉碎，過80 目篩，得供試樣品，陰涼干燥處保存；無水乙醇、二氯甲烷、冰醋酸、氨水、磷鉬酸等試劑 均為分析純，購自遼寧泉瑞試劑有限公司；鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海麥克林生化科技有限公司；灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea，BC）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides，CG）、鏈格孢（Alternaria alternata，AA）、多主棒孢霉（Corynespora cassiicola，CC）和丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringaepv.Actinidiae，Psa） 由中國科學(xué)院武漢植物園提供。

UV-8000 型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；KQ-500DE 型數(shù)控超聲清理器 昆山布超聲儀器有限公司；YRE-2011 型轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總生物堿定性檢測 采用碘-碘化鉀法、碘化鉍鉀法、和磷鉬酸法[19]對軟棗獼猴桃、葛棗獼猴桃及狗棗獼猴桃的根、莖、葉中的總生物堿進(jìn)行初步檢測。將采集的軟棗獼猴桃、葛棗獼猴桃及狗棗獼猴桃的根、莖、葉洗凈烘干、粉碎至粉末狀，過60 目篩，分別稱取各部分粉末5.0 g 置于燒杯中，加入100 mL 95%乙醇浸泡24 h，超聲功率400 W 超聲30 min，過濾，濾液減壓濃縮得浸膏，向浸膏中加入2%鹽酸20 mL 酸化，靜置，過濾，20 mL 的鹽酸清洗殘?jiān)?，過濾，合并濾液，用30 mL 二氯甲烷萃取，留二氯甲烷層重復(fù)萃取兩次。在上層酸水層中加入濃氨水調(diào)節(jié)pH 至10，再用等體積二氯甲烷萃取3 次，合并所有氯仿層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得浸膏，即為總生物堿樣品。

將各部分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后所得浸膏溶于5 mL 二氯甲烷，制成總生物堿樣品溶液。取各部分總生物堿樣品溶液2 mL 置于試管中，分別加入1～2 滴新配制的碘-碘化鉀溶液、改良碘化鉍鉀溶液、磷鉬酸溶液，靜置1 h，觀察各試管現(xiàn)象。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品溶液的制備 按照劉旸旸[7]的方法制備標(biāo)準(zhǔn)品、樣品溶液及生物堿得率測定，精密稱取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品1.20 mg，置于10 mL容量瓶中，無水乙醇定容，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確稱取三種獼猴桃不同部位樣品粉末各3.0 g，按照1.2.1 的方法得到總生物堿浸膏，用二氯甲烷復(fù)溶，并定容在25 mL 容量瓶中，得總生物堿樣品溶液。

1.2.3 檢測波長的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液及總生物堿樣品溶液各1 mL，置于分液漏斗，加入6 mL 溴麝香草酚藍(lán)緩沖液及6 mL二氯甲烷，振搖后靜置30 min，取二氯甲烷層。另外取二氯甲烷1 mL，同樣方法操作，得空白溶液。上述3 種溶液在190～800 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，最大重疊吸收波長為382.5 nm，即為總生物堿檢測波長。

精密量取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品母液0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，定溶，混勻，吸取不同濃度鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL，按上述方法顯色后在382.5 nm 處進(jìn)行測定，橫坐標(biāo)為小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度X （mg/mL）、縱坐標(biāo)為吸光度Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.0664X-0.0964，R2=0.9981。

1.2.4 總生物堿得率測定 分別精密量取1 mL 三種獼猴桃總生物堿樣品溶液，加入6 mL 溴麝香草酚藍(lán)及6 mL 二氯甲烷振蕩后靜置30 min，以鹽酸小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)品，二氯甲烷為空白對照在382.5 nm 處測吸光度，依照劉旸旸[7]方法，通過下式計(jì)算三種獼猴桃總生物堿得率。

其中：C 為總生物堿提取液的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V 為提取液定容的體積（mL）；M 為獼猴桃樣品粉末的質(zhì)量（g）。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)三種獼猴桃莖部總生物堿得率較高，且莖部的資源豐富，后續(xù)實(shí)驗(yàn)利用三種獼猴桃莖部進(jìn)行總生物堿提取優(yōu)化試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取三種獼猴桃莖部粉末各3.0 g，按液料比20 mL/g、浸泡時間24 h、超聲功率400 W、超聲時間30 min，考察不同乙醇濃度（40%、60%、80%、90%和100%）對總生物堿得率的影響；以乙醇濃度為100%、浸泡時間24 h、超聲功率400 W、超聲時間30 min，考察液料比（10、20、30、40 和50 mL/g）對總生物堿得率的影響；以乙醇濃度為100%、液料比20 mL/g、浸泡時間24 h、超聲時間30 min，考察超聲功率（100、200、300、400 和500 W）對總生物堿得率的影響；以乙醇濃度為100%、液料比20 mL/g、浸泡時間24 h、超聲功率400 W，考察超聲時間（0、10、20、30 和40 min）對總生物堿得率的影響；在乙醇濃度為100%、液料比20 mL/g、超聲功率400 W、超聲時間30 min 的條件下，考察不同浸泡時間（0、1、2、4、8、12 和24 h）對總生物堿得率的影響，靜置，精密吸取上層樣品溶液4 mL，高速（12000 r/min）離心10min，取上清，測定總生物堿得率。每個樣品重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 使用軟件Design-Expert 8.0.6.1 采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化最佳提取條件，各因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design factors and levels of response surface methodology

1.2.7 抑菌活性測定 采用陳靜等[20]的方法制作菌懸液，稍加改動。將Psa 菌株劃線培養(yǎng)于LB（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液濃度OD600為0.5，將其放置于4 ℃環(huán)境保存，備用。將4 種真菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后，用載玻片將菌絲輕輕刮下，用無菌水制備孢子濃度為1×106個mL-1的菌懸液。將其放置于4 ℃環(huán)境保存，備用[21]。

采用濾紙片法，吸取5 種菌懸液0.2 mL 滴加于已制備好的培養(yǎng)基上（真菌采用PDA 培養(yǎng)基，細(xì)菌采用LB 固體培養(yǎng)基），涂布棒涂布均勻。用滅菌的濾紙片Φ=6 mm，參考張永欣等[22]及肖倩等[23]方法，分別浸入3 種獼猴桃莖部總生物堿提取液中（80mg/L），總生物堿提取液按照劉旸旸[7]的方法純化后平均純度達(dá)56.7%，取出后在無菌條件下晾干。將浸過總生物堿的濾紙片均勻放在含菌平板上（3 片一皿），浸過二氯甲烷的濾紙片為對照。真菌于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，細(xì)菌于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀察各種菌的生長情況。

針對有抑制效果的菌懸液，配制3 個不同濃度的總生物堿提取液，滅菌后的濾紙片浸沒濃度為50、100 和150 mg/L 的總生物堿提取液后均勻放在含菌的平板上，浸過二氯甲烷的濾紙片為對照，分別按照真菌及細(xì)菌的培養(yǎng)條件于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，使用游標(biāo)卡尺十字交叉測定抑菌圈直徑，取平均值，每組平行3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2018 錄入和整理數(shù)據(jù)，試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；GraphPad Prism 6.0.1 繪圖；SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析；Design-Expert 8.0.6.1 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種獼猴桃不同部位總生物堿得率比較

由顯色反應(yīng)結(jié)果圖1 發(fā)現(xiàn)，三種試劑中均有沉淀生成，說明三種獼猴桃不同部位均含有生物堿類物質(zhì)，結(jié)合表2 可知，三種獼猴桃的根與莖中總生物堿含量均高于葉中，且不同部位的差異性顯著。除葉部以外，葛棗獼猴桃根與莖中所含的總生物堿得率均高于其他兩種獼猴桃相同部位所含總生物堿得率，而狗棗獼猴桃葉中的總生物得率高于其他兩種獼猴桃葉片中總生物堿得率。這可能是由于根莖部位為次生代謝產(chǎn)物富集的位置，而生物堿為植物次生代謝產(chǎn)物之一。

圖1 三種獼猴桃根、莖、葉生物堿定性檢測Fig.1 Qualitative determination of alkaloids in roots, stems and leaves of three species of Actinidia

表2 軟棗獼猴桃、葛棗獼猴桃、狗棗獼猴桃不同部位總生物堿得率Table 2 Yield of total alkaloids in different parts of Actinidia arguta, Actinidia polygama and Actinidia kolomikta

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對總生物堿提取效果的影響 如圖2所示，當(dāng)乙醇濃度從40%增加到80%，三種獼猴桃莖中總生物堿得率迅速增大，狗棗獼猴桃總生物堿得率變化最大，繼續(xù)增加乙醇濃度，三種獼猴桃莖中總生物堿得率顯著上升（P＜0.05），這與劉旸旸[7]發(fā)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，在乙醇濃度較高時總生物堿得率達(dá)到最高。這是由于植物組織中含有的脂溶性生物堿的含量較水溶性生物堿的含量高，因此增加乙醇濃度能夠使脂溶性生物堿溶解率增加，從而使得總生物堿得率明顯提高。基于此，選擇乙醇濃度80%～100%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 乙醇濃度對總生物堿得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on yield of total alkaloids

2.2.2 液料比對總生物堿提取效果的影響 如圖3所示，當(dāng)液料比從10 mL/g 增加到50 mL/g 時，軟棗獼猴桃莖部總生物堿得率呈顯著性上升，其余兩種獼猴桃總生物堿得率雖有所上升，但未出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。這是由于溶劑量增大可以增加溶質(zhì)的溶解度，與杜彥影等[24]所得結(jié)果相似，料液比的增加會使得率增加，但總體影響較小，且在液料比為20 mL/g時總生物堿得率基本呈現(xiàn)最大值，選用液料比為20 mL/g 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 液料比對總生物堿得率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of total alkaloids

2.2.3 超聲功率對總生物堿提取效果的影響 如圖4所示，三種獼猴桃總生物堿得率隨著超聲功率的增加而逐漸增大，當(dāng)超聲功率為400 W 時，總生物堿得率達(dá)到最大，繼續(xù)加大超聲功率至500 W，總生物堿得率并沒有顯著性變化（P＞0.05），為節(jié)約成本，選擇200～400 W 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖4 超聲功率對總生物堿得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of total alkaloids

2.2.4 超聲時間對總生物堿提取效果的影響 如圖5所示，隨著超聲時間的增加三種獼猴桃總生物堿得率均顯著性增加（P＜0.05），且在20 min 時總生物堿得率達(dá)到最大。而20 min 以后總生物堿得率雖隨著時間的延長增加，但未出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。這是由于超聲波可以使植物細(xì)胞破碎，從而使細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)更容易溶解在溶劑中[25]。因此，選擇超聲時間10～30 min 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖5 超聲時間對總生物堿得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the yield of total alkaloids

2.2.5 浸泡時間對總生物堿提取效果的影響 如圖6所示，浸泡時間對三種獼猴桃莖中總生物堿得率皆有影響。當(dāng)浸泡時間達(dá)到1 h 時總生物堿得率較高，繼續(xù)延長提取時間，總生物堿得率雖有所增加并沒有顯著性變化（P＞0.05），這是由于充足的浸泡時間可以使植物細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜容易脹破，增加內(nèi)容物的溶出[26]。因此，為了提高總生物堿得率以及節(jié)省提取時間，后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中浸泡時間為1 h。

圖6 浸泡時間對總生物堿得率的影響Fig.6 Effect of soaking time on yield of total alkaloids

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)法對影響三種獼猴桃莖部總生物堿得率的3 個主要因素，即乙醇濃度（A）、超聲功率（B）和超聲時間（C）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

由表3 可知，在軟棗獼猴桃、葛棗獼猴桃及狗棗獼猴桃莖中總生物堿響應(yīng)面試驗(yàn)中，軟棗獼猴桃、葛棗獼猴桃及狗棗獼猴桃莖部總生物堿響應(yīng)面試驗(yàn)中，3 個因子經(jīng)過擬合得到的三組多元回歸方程為：Y1=0.37+0.011A+0.014B+0.033C-2.500×10-3AB+2.500×10-4AC+8.750×10-3BC-0.011A2-0.028B2-1.200×10-3C2，Y1表示軟棗獼猴桃莖總生物堿得率的預(yù)測值，決定系數(shù)R12=0.9829；Y2=0.420+0.012A+4.500×10-3B+0.039C-3.000×10-3AB-1.250×10-3AC+0.000BC-0.014A2-6.875×10-3B2-0.023C2，Y2表示葛棗獼猴桃莖總生物堿得率的預(yù)測值，決定系數(shù)R22=0.9796；Y3=0.38+7.50010-4A+4.500×10-3+0.023C-3.250×10-3AB-4.250×10-3AC+1.250×10-3BC-2.725×10-3A2-0.018B2-0.028C2，Y3表示葛棗獼猴桃莖總生物堿得率的預(yù)測值，決定系數(shù)R32=0.9530。三組因變量和所選自變量之間均擬合度良好，準(zhǔn)確性高，能反映響應(yīng)值的變化。ANOVA 分析見表4～表6，三組響應(yīng)面模型F值分別為44.84、37.29 和15.78，P值均＜0.001，表明其具有高度的顯著性，失擬項(xiàng)P值均＞0.05，失擬項(xiàng)對于純誤差不顯著，回歸方程不存在失擬性因素，隨機(jī)誤差導(dǎo)致殘差對試驗(yàn)干擾較小。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of response surface test

表4 軟棗獼猴桃莖總生物堿得率ANOVA 分析結(jié)果Table 4 ANOVA analysis results of total alkaloids yield from Actinidia arguta stems

表5 葛棗獼猴桃莖總生物堿得率ANOVA 分析結(jié)果Table 5 ANOVA analysis results of total alkaloids yield from Actinidia polygama stems

如圖7～圖9 可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率及超聲時間的改變均會影響三種獼猴桃莖中總生物堿的得率，乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和超聲時間三者之間均存在交互作用，有一定的促進(jìn)作用，結(jié)果與回歸方程中方差分析結(jié)果相符。三個因素中，超聲時間對響應(yīng)值的影響比乙醇濃度及超聲功率大。

圖7 不同因素對軟棗獼猴桃莖總生物堿得率交互作用3D 圖Fig.7 Response surface 3D map of Actinidia arguta stems

圖8 不同因素對葛棗獼猴桃莖總生物堿得率交互作用3D 圖Fig.8 Response surface 3D map of Actinidia polygama stems

圖9 不同因素對狗棗獼猴桃莖總生物堿得率交互作用3D 圖Fig.9 Response surface 3D map of Actinidia kolomikta stems

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

試驗(yàn)得出軟棗獼猴桃莖部總生物堿理論提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為89.50%，超聲功率340.74 W，超聲時間29.90 min，總生物堿平均得率為0.40 mg/g；葛棗獼猴桃莖部總生物堿理論提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為91.53%，超聲功率298.96 W，超聲時間28.64 min，總生物堿平均得率為0.44 mg/g；狗棗獼猴桃莖部總生物堿理論提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為88.28%，超聲功率321.92 W，超聲24.10 min，總生物堿平均得率為0.39 mg/g。為進(jìn)一步考察同時滿足提取獼猴桃屬總生物堿的條件，將計(jì)算公式目標(biāo)設(shè)定為三種獼猴桃得率最大值，得出理論提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為92.56%，超聲功率324 W，超聲27.55 min，軟棗獼猴桃、葛棗獼猴桃及狗棗獼猴桃莖中總生物堿平均得率分別為0.40、0.44 和0.39 mg/g。考慮到實(shí)際操作條件，三種獼猴桃莖中總生物堿提取最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)為93%，液料比20 mL/g，超聲功率300 W，超聲30 min，三種獼猴桃莖中總生物堿平均得率分別為0.41、0.43 和0.39 mg/g，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與理論值相對誤差分別為2.5%、2.3%和2.3%，說明該三種模型均可較好的預(yù)測三種獼猴桃莖中總生物堿得率。

2.5 抑菌活性實(shí)驗(yàn)

如圖10 和圖11 所示，使用濾紙片法測定三種獼猴桃莖中總生物堿抑菌活性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度總生物堿提取液對BC、CG、AA 及CC 等真菌的抑制效果并不明顯，三種獼猴桃總生物堿的濃度為80 mg/L 時，對Psa 菌株均有抑制效果，軟棗獼猴桃莖中生物堿的抑制效果更明顯，另外兩種獼猴桃總生物堿對其抑制效果不明顯。這可能是由于三種獼猴桃總生物堿中的單體組成不同，從而導(dǎo)致抑制效果的差異性。相關(guān)研究證明，軟棗獼猴桃中含有小檗堿，其對金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌等都具有非常強(qiáng)的抑制作用，對肺炎桿菌等多種桿菌亦有效[27]，而軟棗獼猴桃莖部總生物堿中很有可能也含有小檗堿。如表7 所示，得到軟棗獼猴桃莖中總生物堿對Psa 的MIC（最小抑菌濃度）為50 mg/L，總生物堿濃度達(dá)MIC 值時，隨著三種獼猴桃莖總生物堿濃度的增加，其抑菌能力也隨之增強(qiáng)，且不同濃度的抑菌效果差異顯著。這可能是由于生物堿類物質(zhì)抑制了Psa 菌體的活性，或者限制了菌體的運(yùn)動，還有可能破壞了菌體的結(jié)構(gòu)[28]。

圖10 軟棗獼猴（a, e, i, m）、葛棗獼猴桃（b, f, j, n）、狗棗獼猴桃（c, g, k, o）莖總生物堿及空白（d, h, l, p）對BC （a, b, c 和d）, CG （e, f, g, h）, AA （i, j, k, l） 以及CC （m, n, o, p）四種真菌的抑制效果Fig.10 Inhibitory effect of total alkaloids from the Actinidia arguta (a, e, i, m), Actinidia polygama (b, f, j, n), Actinidia kolomikta (c, g, k, o) and the control (d, h, l, p) on BC (a, b, c, d),CG (e, f, g, h), AA (i, j, k, l) and CC (m, n, o, p)

圖11 軟棗獼猴桃（a）、葛棗獼猴桃（b）和狗棗獼猴桃（c）莖總生物堿對Psa 抑菌效果Fig.11 Inhibitory effect of total alkaloids from Actinidia arguta (a), Actinidia polygama (b) and Actinidia kolomikta (c) on Psa

表7 不同濃度總生物堿對Psa 的抑菌效果Table 7 Inhibitory effect of different concentration total alkaloid on Psa

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對三種獼猴桃不同部位的生物堿的含量進(jìn)行對比研究，發(fā)現(xiàn)三種獼猴桃根莖中均有生物堿類物質(zhì)，且以莖中含量最高。本研究利用超聲波輔助法提取三種獼猴桃莖部總生物堿，通過單因素實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)液料比、乙醇濃度以及超聲時間改變均顯著影響總生物堿的得率。通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了三種獼猴桃莖部總生物堿最佳提取條件，在此條件下三種獼猴桃莖部總生物堿的實(shí)際值分別為0.41、0.43和0.39 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果略低于杜彥影測定的軟棗獼猴桃莖部總生物堿的實(shí)際值，原因可能與獼猴桃不同種植環(huán)境有關(guān)[24]。黑龍江地域氣候更為寒冷，植物此生代謝產(chǎn)物會受到氣候、土壤及水源等因素的影響，不同地區(qū)的獼猴桃不同部位含有的總生物堿得率及種類是否具有差異仍需進(jìn)一步對比研究[29]。抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針對BC、CG、AA 及CC 四種真菌，三種獼猴桃莖部總生物堿對其均沒有明顯抑制效果，后續(xù)進(jìn)一步增加總生物堿的濃度，依舊沒有明顯的抑制效果，推測三種獼猴桃莖部總生物堿不含對這四種真菌抑制作用的成分。軟棗獼猴挑莖中總生物堿對細(xì)菌Psa 有明顯抑制效果，而其他兩種獼猴桃總生物堿對Psa 抑制效果不明顯。本研究初步證實(shí)軟棗獼猴桃莖中總生物堿具有良好的抑制Psa 的活性，但主要抑菌成分以及抑菌機(jī)制有待進(jìn)一步研究。