乳酸菌與酵母菌的復(fù)配篩選及在傳統(tǒng)泡菜中應(yīng)用

陳 偲，張 明，付竹賢，王淑敏，羅 璠1,,

（1.西南民族大學(xué)青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省教育部重點實驗室，四川成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都 610041；3.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041）

乳酸菌和酵母菌是發(fā)酵產(chǎn)品中發(fā)揮重要作用的微生物類群，它們通過相互作用，共同發(fā)酵促成發(fā)酵食品成熟，提高揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，改善感官評價[1]，增加發(fā)酵食物不飽和脂肪酸、促進(jìn)消化、增加食欲等[2]。這種天然混合發(fā)酵體系在傳統(tǒng)食品發(fā)酵中廣泛存在，例如酸面團(tuán)[1]、泡菜[2]、傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬[3]、傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶[4]、葡萄酒[5]等。在食品工業(yè)生產(chǎn)中也多有應(yīng)用，利用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵飼料[6]、蘋果汁[7]、雜糧面包[8]、富麩饅頭[9]等。但乳酸菌和酵母菌相互作用研究表明，在共培養(yǎng)體系中既存在協(xié)同（互促）作用，也存在拮抗（互抑）作用[10]。如Xu 等[11]在水開菲爾中發(fā)現(xiàn)霍爾迪乳酸桿菌（Lactobacillus hordei）和釀酒酵母（Sacchromyces cerevisiae）通過代謝產(chǎn)物的交換促進(jìn)各自的生長。Branco 等[12]通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)釀酒酵母細(xì)胞凋亡可產(chǎn)生抗微生物肽（antimicrobial peptides，AMPs），并對葡萄酒中的乳酸菌等產(chǎn)生抑制作用[13]。Carbonetto 等[14]通過面團(tuán)的共培養(yǎng)發(fā)酵發(fā)現(xiàn)乳酸菌的存在阻礙了酵母菌的生長，在碳代謝過程中表現(xiàn)出潛在的競爭關(guān)系。

在乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵體系中，當(dāng)菌株間作用為相互促進(jìn)時，可提高發(fā)酵效率并獲得更為豐富的代謝產(chǎn)物，菌株之間的良性互動也有益于提升發(fā)酵食品的品質(zhì)[15]。但乳酸菌與酵母菌之間的互作關(guān)系，也可能表現(xiàn)為營養(yǎng)競爭、相互抑制的拮抗作用，影響最終發(fā)酵效果[16]。因此在乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵應(yīng)用前，應(yīng)深入分析復(fù)配菌組間的互作關(guān)系，使發(fā)酵應(yīng)用效果最佳化。

泡菜口感脆爽，風(fēng)味獨特，是主要的蔬菜發(fā)酵產(chǎn)品。泡菜發(fā)酵過程中，乳酸菌起主導(dǎo)作用并含有酵母菌輔助發(fā)酵，其熟制加工方式為冷加工，對營養(yǎng)物質(zhì)有較好保留，同時富含益生菌，使其具有開胃、健脾、促消化、降低膽固醇、抗動脈硬化、抗肥胖作用等功效[17-18]，目前國內(nèi)發(fā)酵泡菜中微生物研究多集中于菌群分布及自然發(fā)酵泡菜與人工接種發(fā)酵泡菜發(fā)酵效果比較[19-20]，篩選復(fù)配優(yōu)勢菌株組合再進(jìn)行泡菜人工接種發(fā)酵的研究鮮有報道?；诖?，本研究擬分析不同組合乳酸菌和酵母菌復(fù)配的相互關(guān)系，篩選菌株組合，將其應(yīng)用在泡菜發(fā)酵實驗中，為篩選發(fā)酵性能較強的菌株組合及人工接種發(fā)酵泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)，提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株 信息見表1，采用傳統(tǒng)分離純化方法從自然發(fā)酵泡菜及酸乳樣品中，分離得到13 株乳酸菌和酵母菌，通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化實驗、16S rDNA 和26S rDNA 序列分析，對菌株種屬進(jìn)行鑒定，前期實驗表明，同類型所選菌株生長速度與產(chǎn)酸性能較接近[21]；新鮮大白菜（Brassica rapa pekinensis）、泡菜鹽 均為市售；MRS 培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）、改良查爾莫斯培養(yǎng)基（Modified Chalmers Agar，MC），孟加拉紅培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；水葡萄糖 分析純，天津奧普升有限公司；鹽酸 分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；亞甲藍(lán)、硫酸銅、冰乙酸、氫氧化鈉、乙酸鋅、酚酞、亞鐵氰化鉀、正辛醇、硫酸鋅、氨水、活性炭、酒石酸鉀鈉均為分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

表1 實驗菌種信息Table 1 Experimental strains information

ST16R 高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技有限公司；GH6000 電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特設(shè)備有限公司；SHKE6000-8CE 恒溫振蕩搖床 美國Thermo Scientific 有限公司；紫外可見分光光度計UV1900上海佑科儀器；ELX-800 酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；R40-IIB2 超凈工作臺 中國青島海爾有限公司；GI54DW 高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；雷磁pHS-25 酸度計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；WY-01 電熱爐 浙江偉遠(yuǎn)工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無菌代謝產(chǎn)物制備 參照劉敏敏等[22]方法并改進(jìn)。將活化好的乳酸菌（1×108CFU/mL）以1%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h；將活化好的酵母菌（4×106CFU/mL）以1%的接種量接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液在6000 r/min 離心15 min，取上清，用1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至6.0，0.22 μm 濾膜過濾除菌，得無菌代謝產(chǎn)物，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種初篩 將制備好的酵母菌代謝產(chǎn)物按體積分?jǐn)?shù)30%加入到MRS 液體培養(yǎng)基中，以同樣比例在MRS 液體培養(yǎng)基中添加pH6.0 的YPD 液體培養(yǎng)基為對照組，以1%接種量接種乳酸菌（1×108CFU/mL），30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，振蕩混勻在600 nm處測定吸光度。

將制備好的乳酸菌代謝產(chǎn)物按體積分?jǐn)?shù)30%加入到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，以同樣比例在YPD 液體培養(yǎng)基中添加pH6.0 的MRS 液體培養(yǎng)基作為對照組，以1%接種量接種酵母菌（4×106CFU/mL），30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，振蕩混勻后在 600 nm 處測定吸光度。選取乳酸菌和酵母菌菌體濃度較對照差異顯著組吸光度顯著大于對照組，P＜0.05）作為復(fù)篩的出發(fā)菌組。

1.2.3 菌種復(fù)篩 以篩選出來的促進(jìn)生長的菌組作為研究對象。將乳酸菌（1×108CFU/mL）和酵母菌（4×106CFU/mL）以1%的接種量接種在MRS 液體培養(yǎng)基中30 ℃靜置共培養(yǎng)12 h 后，將共培養(yǎng)菌液用無菌生理鹽水按10 倍進(jìn)行梯度稀釋，取適當(dāng)稀釋度的發(fā)酵液進(jìn)行平板涂布法計數(shù)，使用改良MC 培養(yǎng)基平板測定乳酸菌活菌數(shù)，使用孟加拉紅培養(yǎng)基平板測定酵母活菌數(shù)，于30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，每個稀釋度做3 個重復(fù)，取菌落數(shù)在30～300 的平板計數(shù)，取平均值。

1.2.4 培養(yǎng)方式的確定 將酵母菌（4×106CFU/mL）以1%的接種量接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃下分別進(jìn)行靜置與振蕩兩種培養(yǎng)方式培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液以6000 r/min 離心15 min，取上清，0.22 μm 濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆?。MRS 液體培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)為30%的兩種不同培養(yǎng)方式的酵母菌無菌代謝產(chǎn)物為實驗組；添加等量的YPD 液體培養(yǎng)基作為對照組。將植物乳桿菌（1×108CFU/mL）以1%接種量接種在上述液體培養(yǎng)基，4、8、12、16、20、24 h 測定菌液在600 nm 處的吸光度。

1.2.5 接種順序的確定 將乳酸菌（1×108CFU/mL）以1%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)12 h，然后接種1%的酵母菌（4×106CFU/mL），共培養(yǎng)至24 h；以乳酸菌單菌于第0 h 和酵母菌單菌于第12 h 以同接種量接種至MRS 液體培養(yǎng)基為對照。每隔4 h 使用pH 計測定pH，使用改良MC 培養(yǎng)基平板測定乳酸菌活菌數(shù)，使用孟加拉紅培養(yǎng)基平板測定酵母活菌數(shù)。

將酵母菌（4×106CFU/mL）以1%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)12 h，然后接種1%的乳酸菌（1×108CFU/mL），共培養(yǎng)至24 h，以酵母菌單菌于第0 h 和乳酸菌單菌于第12 h 以同接種量接種至MRS 液體培養(yǎng)基為對照。每隔4 h 測定活菌數(shù)和pH。

1.2.6 接種比例的確定 乳酸菌與酵母菌活菌數(shù)以10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、100:1 的比例接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，其中酵母菌菌體濃度固定為（4×106CFU/mL），乳酸菌菌體濃度隨比例調(diào)節(jié)，先接種酵母菌后接種乳酸菌；以相同菌體濃度的乳酸菌和酵母菌單菌接種于MRS 培養(yǎng)基為對照組，30 ℃靜置培養(yǎng)，在12、18、24 h 測定活菌數(shù)。

1.2.7 發(fā)酵效果比對實驗

1.2.7.1 菌懸液制備 將互促菌組植物乳桿菌J05和釀酒酵母Y21 以及互抑組合乳酸乳球菌RQ 和畢赤酵母Y1，分別接入MRS 與YPD 培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化兩代之后，4500 r/min 離心15 min，棄去上清，無菌生理鹽水重懸沉淀，調(diào)節(jié)菌體濃度為前期篩選出的最佳比例乳酸菌:酵母菌=30:1（此時乳酸菌菌體濃度為1.2×108CFU/ml；酵母菌菌體濃度為4×106CFU/mL）。

1.2.7.2 泡菜制作工藝與實驗處理 泡菜工藝流程參考熊濤等[23]的方法并加以改進(jìn)，制作流程如下：

泡菜原料挑選→整理篩選→泡菜壇預(yù)處理→沖洗控水→切塊裝壇→接種發(fā)酵劑→鹽水封口→發(fā)酵→成品。

取45 個320 mL 的玻璃密封罐，洗凈，烘箱烘干。分別稱取50 g 白菜樣品放入玻璃密封罐中。用冷沸水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4%的泡菜鹽水，以2%的接種量（以白菜質(zhì)量計）添加菌液發(fā)酵。按照1:2 的料液比，分別量取100 mL 泡菜鹽水完全淹沒樣品，保鮮膜加蓋密封，室溫條件下自然發(fā)酵。從腌制之日起，每隔 2 d 取樣測定相關(guān)指標(biāo)。

本實驗設(shè)5 個處理：單菌植物乳桿菌J05 組，單菌釀酒酵母Y21 組，互促組植物乳桿菌J05 和釀酒酵母Y21，互抑組乳酸乳球菌RQ 和畢赤酵母Y1 以及空白對照組（自然發(fā)酵）。

1.2.7.3 泡菜理化指標(biāo)測定 泡菜發(fā)酵液pH 采用pH 計直接測定?？偹釡y定參照GB/T 12456-2021《食品中總酸的測定》直接滴定法；還原糖含量測定參照GB 5009.7-2016《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測定》直接滴定法；亞硝酸鹽含量測定參照GB 5009.33-2016《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》紫外分光光度法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均設(shè)置3 個重復(fù)，實驗數(shù)據(jù)使用SPSS.20 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用ANOVA 對各組間差異進(jìn)行單因素方差分析，采用t檢驗對兩組之間的差異進(jìn)行分析，P＜0.05 表示有顯著性差異，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果，使用Origin 2021 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 互促乳酸菌和酵母菌的初篩

由表2、表3 可得，通過比較乳酸菌、酵母菌在添加代謝產(chǎn)物培養(yǎng)基和單一培養(yǎng)基的生長情況，從所有菌株組合中篩選出具有偏利關(guān)系的組合23 對，占比28.75%；相互促進(jìn)的組合4 對（P＜0.05），即植物乳桿菌J05 和釀酒酵母Y21，植物乳桿菌J05 和畢赤酵母Y163，屎腸球菌HR 和畢赤酵母Y163 以及屎腸球菌B2 和畢赤酵母Y163，占比5.00%；僅對一方有抑制作用的組合24 對，占比30.00%；相互抑制的組合8 對（P＜0.05），包括乳酸乳球菌RQ 和畢赤酵母Y1 等，占比10.00%。由此可見，乳酸菌和酵母菌復(fù)配，菌株間會表現(xiàn)出不同的菌間關(guān)系，而能夠互相促進(jìn)的組合占比較低。在劉敏敏等[22]的實驗中有相似結(jié)果，其從分離自酸馬奶的8 株乳酸菌和7 株酵母菌中僅篩選出3 對具有相互促進(jìn)作用的乳酸菌和酵母菌組合。許多研究表明乳酸菌能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物如有機酸、抗真菌肽等對酵母菌的生長產(chǎn)生不同影響[24-25]。酵母菌的代謝產(chǎn)物（游離氨基酸和維生素）大多對乳酸菌產(chǎn)生促進(jìn)作用，部分酵母菌的代謝產(chǎn)物甚至?xí)せ钊樗峋腖uxS/AI-2 QS 系統(tǒng)[26]，從而調(diào)節(jié)群體密度，影響菌群生長。但也有報道證明一些酵母菌會分泌抑菌物質(zhì)抑制乳酸菌的生長[27]。

表2 乳酸菌代謝產(chǎn)物對酵母菌生長影響Table 2 Effects of lactic acid bacteria metabolites on yeast growth

表3 酵母菌代謝產(chǎn)物對乳酸菌生長影響Table 3 Effects of yeast metabolites on the growth of lactic acid bacteria

2.2 互促乳酸菌和酵母菌的復(fù)篩

表4 結(jié)果表明，對初篩中選出的4 對乳酸菌和酵母菌組合進(jìn)行菌組共培養(yǎng)復(fù)篩，只有植物乳桿菌J05 和釀酒酵母Y21 顯示出明顯穩(wěn)定的相互促進(jìn)關(guān)系（P＜0.05），因此選該菌株組合作為后續(xù)篩選實驗的研究對象。

表4 乳酸菌和酵母菌復(fù)篩活菌數(shù)Table 4 The viable number of lactic acid bacteria and yeast

2.3 培養(yǎng)方式的確定

結(jié)果如圖1 所示，釀酒酵母Y21 靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)的無菌代謝產(chǎn)物都可以促進(jìn)植物乳桿菌J05 的生長，且對該菌的促進(jìn)作用表現(xiàn)在4～16 h 之間，而靜置培養(yǎng)的無菌代謝產(chǎn)物對植物乳桿菌J05 的促進(jìn)作用更加明顯。酵母菌屬于兼性厭氧菌，靜置培養(yǎng)過程中酵母菌與空氣接觸較少，可將糖分分解成乙醇和CO2等代謝產(chǎn)物，振蕩培養(yǎng)過程中酵母菌主要進(jìn)行耗氧代謝，此時糖分降解較徹底，酵母菌在不同氧含量情況下代謝產(chǎn)物不同，對乳酸菌的影響也可能不同。郭倩茹[28]使用振蕩培養(yǎng)酵母無細(xì)胞上清液與乳酸菌共培養(yǎng)，篩選出了互利的乳酸菌和酵母菌；趙小麗[29]使用厭氧發(fā)酵的酵母培養(yǎng)物來測定對植物乳桿菌的促進(jìn)效果，并建立了酵母菌厭氧發(fā)酵體系。

圖1 釀酒酵母不同代謝產(chǎn)物對植物乳桿菌的生長的影響Fig.1 Effects of different metabolites of S. cerevisiae on the growth of L. plantarum

2.4 接種順序?qū)晟L情況的影響

從圖2A 的結(jié)果分析，先接種植物乳桿菌J05 培養(yǎng)12 h，后接種釀酒酵母Y21，結(jié)果顯示與單菌J05 組相比，共培養(yǎng)J05 的生長無明顯差異，與單菌Y21 組相比，共培養(yǎng)Y21 在16 h 時生長受到抑制，20 h 后恢復(fù)正常。結(jié)合圖2C 中pH 結(jié)果，釀酒酵母Y21 在接種前期可能受到酸抑制，適應(yīng)環(huán)境后，利用植物乳桿菌J05 的部分代謝產(chǎn)物加速生長。從圖2B與圖2D 的結(jié)果分析，先接種釀酒酵母Y21 培養(yǎng)12 h，后接種植物乳桿菌J05，結(jié)果顯示與單菌Y21組相比，共培養(yǎng)Y21 的生長狀態(tài)改善，且在16 和20 h時活菌數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），表明加入植物乳桿菌J05 后促進(jìn)了釀酒酵母Y21 的生長；接入植物乳桿菌J05 后，共培養(yǎng)J05 活菌數(shù)較單菌對照組提高，在20 h 時差異顯著（P＜0.05），表明此時釀酒酵母Y21 的代謝產(chǎn)物可以促進(jìn)植物乳桿菌J05 的生長。在共培養(yǎng)菌株的接種順序研究中，周鈺涵等[30]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母與球擬酵母接種順序不同，對發(fā)酵體系中還原糖含量及CO2總失重有不同程度影響；吳軒德[31]在對釀酒酵母與巴氏醋桿菌相互作用的研究中表明，在酵母菌發(fā)酵24 h 后接種醋酸菌對酵母酒精發(fā)酵影響最大。因此本實驗中不同接種順序下菌株表現(xiàn)出不同的生長情況，推測與共培養(yǎng)體系中不同時段的代謝產(chǎn)物的差異相關(guān)。

圖2 不同接種順序下植物乳桿菌和釀酒酵母的活菌數(shù)及pHFig.2 Number of viable strains and pH of L. plantarum and S.cerevisiae in different inoculation sequences

2.5 接種比例對菌株生長情況的影響

結(jié)果如圖3 所示，菌株復(fù)配比例對菌株生長有一定影響，在12 h 時，與單菌對照組相比，各復(fù)配組的活菌數(shù)出現(xiàn)明顯差異（P＜0.05），而在18 h 和24 h時沒有明顯差別，該結(jié)果與閆彬等[32]的研究結(jié)果較為接近，而與Xu 等[11]的結(jié)果有一定差異，可能是各菌株分泌有利代謝物質(zhì)的時間有差異所致[33]。在12 h 時，不同菌株比例對復(fù)配組中植物乳桿菌J05 的生長均有促進(jìn)作用，對釀酒酵母Y21 的生長影響有差異，說明復(fù)配對植物乳桿菌J05 生長促進(jìn)效果明顯，而對釀酒酵母Y21 的影響有限。其中30:1和40:1 的比例是菌株復(fù)配的較佳比例，在這兩個比例下，復(fù)配組的活菌數(shù)均顯著高于單菌組。

圖3 不同接種比例植物乳桿菌和釀酒酵母的活菌數(shù)Fig.3 Number of viable strains of L.plantarum and S.cerevisiae under different inoculation ratios

2.6 泡菜發(fā)酵過程中pH 和總酸的變化

pH 作為泡菜發(fā)酵過程中一項重要指標(biāo)，對微生物生長和代謝產(chǎn)物形成具有重要影響[34]。由表5 可知，除酵母組外，所有組在0～2 d 之間pH 均急速下降，第10 d 至發(fā)酵過程完結(jié)，各組pH 趨于穩(wěn)定，互促組pH 最低（P＜0.05），而互抑組和對照組的pH 最高。由圖4 可知，在發(fā)酵過程中，各組總酸含量均逐漸增加到10 d 后趨于穩(wěn)定，其中互促組總酸含量維持在較高水平，穩(wěn)定期與其他組相比總酸含量最高（P＜0.05）。所有組別在發(fā)酵過程中總酸含量均低于國內(nèi)貿(mào)易行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10439-2007（≤2 g/100 g），結(jié)果與pH 變化情況基本一致。對照組與互抑組總酸增加緩慢，在2～10 d 內(nèi)，總酸含量均低于互促組和單菌組。各實驗組接種菌量相同的情況下，互促組產(chǎn)酸量大，說明發(fā)酵能力最強，互抑組從第8 d 開始，酸產(chǎn)量不再增加，總酸產(chǎn)量比空白對照組低，說明發(fā)酵能力最差。

表5 泡菜發(fā)酵過程中pH 變化Table 5 Change of pH during pickle fermentation

研究表明，在泡菜發(fā)酵過程中，其pH 達(dá)到3.5～3.8 可認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束，泡菜此時為成熟狀態(tài)，理論上風(fēng)味最佳，可進(jìn)行食用[35]。本實驗中，互促組pH 在第6 d 下降到3.66，且一直維持在最低水平，結(jié)合總酸含量變化情況分析，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，各組發(fā)酵泡菜中總酸含量不斷增加，在總酸的積累量上，互促組都要高于其他組別，這是因為互促組乳酸菌與酵母菌為互利共生菌組，生長繁殖速度更快，產(chǎn)酸更多。而其他組別中的乳酸菌與酵母菌未能形成互促關(guān)系，相比于互促組，發(fā)酵繁殖周期較長，成為優(yōu)勢菌種所需時間更久，產(chǎn)酸量和產(chǎn)酸速率都要低于互促組，所以到達(dá)發(fā)酵結(jié)束時間也就越久。凌榮秀等[36]研究表明泡菜酸性環(huán)境可抑制有害菌的生長和代謝，有利于乳酸菌的發(fā)酵，陳影等[37]研究表明，泡菜發(fā)酵體系中乳酸菌量增加有助于降低pH 與提升總酸含量，縮短泡菜發(fā)酵時間。

2.7 泡菜發(fā)酵過程中還原糖含量變化

由圖5 所示，發(fā)酵泡菜的還原糖含量均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，除對照組外，添加菌組都在第2 d 到達(dá)峰值。泡菜發(fā)酵初期，微生物活動較弱，泡菜葉中淀粉、多糖類物質(zhì)被降解成還原糖，當(dāng)還原糖溶解速度大于微生物利用的速度，導(dǎo)致泡菜液中的還原糖含量上升，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，大量的微生物生長繁殖消耗碳源，導(dǎo)致還原糖含量逐漸降低[38]，符合微生物對碳源分解利用的規(guī)律[39]。其中釀酒酵母單菌Y21 組的還原糖含量最高，有利于其后期的發(fā)酵利用。而互促組的還原糖含量在整個發(fā)酵過程中均維持在較低水平，表明該組別中微生物對還原糖利用率較高，因此發(fā)酵充分，該結(jié)果與產(chǎn)酸結(jié)果相一致?；ゴ俳M的還原糖含量在第2 d 時處于各組別中最低值，可能由于酵母產(chǎn)的還原糖被乳酸菌快速利用，兩菌在代謝上存在相互作用，有利于發(fā)酵的進(jìn)行。而互抑組在整個發(fā)酵過程中還原糖含量較高，而產(chǎn)酸量較低，說明發(fā)酵能力較差。

圖5 泡菜發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.5 Changes of reducing sugar content in the fermentation of pickle

2.8 泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量變化

亞硝酸鹽含量作為判斷泡菜產(chǎn)品是否可以安全食用的一項重要指標(biāo)，得到消費者關(guān)注[40]，在《食品中污染物限量國家標(biāo)準(zhǔn)》中有明確規(guī)定，其殘留量在醬菜中不得超過20 mg/kg[41]。由圖6 可知，各組中“亞硝峰”都出現(xiàn)在第2 d，其中對照組峰值最高為8.03 mg/kg，互促組峰值含量為5.38 mg/kg，均未超過20 mg/kg；發(fā)酵第10 d，所有組別中亞硝酸鹽含量都下降到3 mg/kg 以下，遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)限量值。

圖6 泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.6 Changes of nitrite content in the fermentation of pickle

本實驗各處理組亞硝酸鹽含量均在發(fā)酵第2 d達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。泡菜發(fā)發(fā)酵過程中產(chǎn)酸可抑制硝酸鹽還原菌的生長，逐漸降低亞硝酸鹽含量；且在酸性條件下，亞硝酸根離子可與氫離子結(jié)合形成亞硝酸，發(fā)生自身歧化反應(yīng)生成二氧化氮和一氧化氮，從而降低亞硝酸鹽含量[42]。在所有實驗組中，自然發(fā)酵的對照組亞硝酸鹽含量最高，說明添加發(fā)酵微生物有利于抑制泡菜亞硝酸鹽的生成，互促組與釀酒酵母Y21 組中亞硝酸鹽含量較低，結(jié)合pH 和總酸發(fā)酵結(jié)果分析，說明發(fā)酵充分，能有效抑制硝酸鹽還原菌生長，有利于降低亞硝酸鹽含量。較多研究表明，人工接種復(fù)合乳酸菌進(jìn)行泡菜發(fā)酵，可起到抑制亞硝酸鹽含量的作用。任亭等[34]研究復(fù)合菌種對青菜頭泡菜品質(zhì)的影響，結(jié)果顯示，接種組亞硝酸鹽峰值為2.61 mg/kg，對照組為6.12 mg/kg，接種組較對照組低。陳大鵬等[38]以娃娃菜的尾菜為原料，接種混合菌種發(fā)酵泡菜，自然發(fā)酵泡菜的“亞硝峰”出現(xiàn)在發(fā)酵的第3 d，為32.1 mg /kg，而人工接種發(fā)酵泡菜的“亞硝峰”出現(xiàn)在發(fā)酵第2 d，峰值較低，為9.03 mg /kg。本實驗得到結(jié)果與上述相似。

3 結(jié)論

本研究通過代謝產(chǎn)物與菌株共培養(yǎng)初篩，乳酸菌與酵母菌共培養(yǎng)復(fù)篩，篩選出一對具有相互促進(jìn)作用的植物乳桿菌J05 與釀酒酵母Y21，對該菌組間培養(yǎng)方式、接種順序、接種比例等進(jìn)行探究，再將篩選得到的菌組應(yīng)用到人工接種發(fā)酵泡菜中，研究各菌組的發(fā)酵性能。發(fā)現(xiàn)互促組可較快進(jìn)入發(fā)酵成熟期，縮短泡菜發(fā)酵周期，其還原糖含量在整個發(fā)酵過程中均維持在較低水平，各添加菌組亞硝酸鹽含量均要低于自然發(fā)酵組，其中互促組在整個發(fā)酵過程亞硝酸鹽含量較低，提高了泡菜食用的安全性。上述結(jié)果為乳酸菌與酵母菌互作關(guān)系研究及人工接種發(fā)酵泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)，提供了一定的科學(xué)理論依據(jù)。