酵母菌乳酸菌共發(fā)酵對臍橙飲品品質的影響

葉 洪，周雪瑞，王 素，張瀠月，孫 月，曾朝懿，張 慶，唐 潔

（西華大學食品與生物工程學院，四川成都 610036）

臍橙（Navel orange）屬薔薇亞綱無患子目蕓香科柑橘屬，是柑橘品種中最優(yōu)良的甜橙種類，含有多種常量和微量元素、維生素、氨基酸、膳食纖維等營養(yǎng)物質[1]。經(jīng)常食用臍橙具有解油膩、分解脂肪、醒酒、促進腸道蠕動、清腸通便、增進食欲等功效[2]。

目前，臍橙飲品主要是單一酵母菌或酵母菌與非釀酒酵母菌發(fā)酵，研究主要集中在果酒[3]、果醋[4]以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化，針對臍橙飲品中酵母菌與乳酸菌共發(fā)酵特性的研究較少。釀酒酵母菌[5]和植物乳桿菌[6]共發(fā)酵是一個生物混合體系，體系中微生物之間大多具有生長代謝協(xié)調作用[7]。有相關研究報道，乳酸菌和酵母菌共發(fā)酵不但能夠相互促進生長，而且可以獲得某些純種發(fā)酵不易得到的產(chǎn)物，這些物質賦予了飲品獨特的風味和口感[8-10]。Sun 等[11]研究了酵母菌LAIVIN RC212 與乳酸菌PL18 共同接種對櫻桃酒化學和感官特性的影響，不僅使共發(fā)酵的揮發(fā)性物質更多，而且縮短了發(fā)酵時間；陳毅堅等[12]利用乳酸菌RSJ-1 與酵母菌JMJ-1 發(fā)酵新型乳制品，使苯乙醇和3-甲基丁醇等風味物質含量大大增加；馬麗娟等[13]利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵菠蘿汁，發(fā)現(xiàn)該飲品既保留了菠蘿原有的營養(yǎng)物質和特有香氣，還賦予一定的發(fā)酵風味。金曉帆[14]利用酵母菌DV10 與植物乳桿菌（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵芒果漿，使得醇類、酯類以及總酚含量增加，抗氧化能力更強。

本文以臍橙汁為原料，利用實驗室保藏的酵母菌和乳酸菌菌株進行共菌發(fā)酵實驗，以單一菌株發(fā)酵為對照，探究發(fā)酵過程中臍橙飲品的活菌數(shù)、酒精度、還原糖、總酚、抗氧化性、揮發(fā)性香氣物質變化特性，為釀酒酵母和植物乳桿菌共發(fā)酵臍橙飲品的開發(fā)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

臍橙 四川金堂臍橙果園，直徑約75～80 mm，無公害；酵母菌（釀酒酵母SC-125）、乳酸菌（植物乳桿菌B-5） 均由西華大學古法發(fā)酵（釀造）生物技術研究所保藏；乳酸細菌培養(yǎng)基（MRS）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD） 青島高科園海博生物技術有限公司；1,1-二苯-2-庫基肼（DPPH 試劑） 成都市科隆化學品有限公司；3,5-二硝基水楊酸 福晨（天津）化學試劑有限公司；仲辛醇 成都市科隆化學品有限公司；以上試劑均為分析純。

FA1104 型電子天平 上海舜宇恒平有限公司；BPH-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；INFINITEF200 型酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司；GCMS-QP2020NX 型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 島津公司；5804R 型冷凍離心機 Eppendorf 公司；PEN3 型電子鼻 德國AIRSENSE 公司；G154DWS型全自動高壓滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 臍橙飲品發(fā)酵試驗 將臍橙鮮果的皮殼和核去掉，用榨汁機將果肉榨汁制備成果漿狀，以3000 r/min 離心30 min，120 目分樣篩過濾后取上清液置于250 mL 發(fā)酵容器中，于60 ℃巴氏滅菌15 min。通過預實驗，確定最佳接種量和種子液濃度，同時將釀酒酵母菌SC-125、植物乳桿菌B-5 活化（釀酒酵母菌種子液濃度為106CFU/mL，植物乳桿菌種子液濃度為108CFU/mL）按2%的比例添加，30 ℃恒溫靜置發(fā)酵，設置三個平行，使用阿貝折光儀檢測發(fā)酵狀態(tài)，直至可溶性固形物穩(wěn)定，主發(fā)酵結束。期間每隔12 h 進行取樣，在超凈臺收集臍橙發(fā)酵上清液，將其-50 ℃冷凍保存。

1.2.2 菌落計數(shù)方法 用PDA 瓊脂平板計數(shù)法和MRS 瓊脂平板計數(shù)法分別測定釀酒酵母SC-125 和植物乳桿菌B-5 協(xié)同發(fā)酵臍橙汁在不同發(fā)酵階段的活細胞數(shù)。同時分別以兩種菌株單獨發(fā)酵臍橙為對照?；罴毎麛?shù)以每毫升菌落形成單位（CFU/mL）表示。

1.2.3 臍橙飲品理化指標的測定 可溶性固形物：手持糖度儀測定；pH：pH 計測定；均參照GB/T 15038-2006 的方法[15]；還原糖含量：參照高文軍等[16]的DNS 法；總酚：福林酚法[17],以沒食酸計。

1.2.4 酒精度的測定 酒精度含量的測定參照Fulgencio 等[18]通過外標法利用氣相色譜測定白酒酒精度，其標準曲線方程為y=5255.3x-769.1，R2=0.998。

色譜條件：初始溫度45 ℃，保持5 min，以3 ℃·min-1升溫至60 ℃，保持3 min，以20 ℃·min-1升溫至200 ℃，保持5 min。色譜柱為Rtx-Wax 毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純度氦氣，載氣流速1.0 mL·min-1；進樣口溫度: 200 ℃。

1.2.5 臍橙飲品抗氧化能力測定

1.2.5.1 DPPH 自由基清除率 取1 mL 待測臍橙飲品溶液和1 mL 0.5 mmol·L-1的DPPH 溶液，搖勻避光靜置30 min，于517 nm 處測定其吸光度值A1，同時用蒸餾水做空白對照，無水乙醇做陽性對照[19]。DPPH 自由基清除率計算公式如式（1）：

式中：A0為蒸餾水代替臍橙飲品溶液的吸光度；A1為加入臍橙飲品溶液的吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH 溶液的吸光度。

1.2.5.2 羥基自由基清除率 參考Hui 等[20]的方法，精確吸取9 mmol·L-1硫酸亞鐵1 mL，加入1 mL 9 mmol·L-1水楊酸乙醇溶液，然后加入酒樣1 mL，最后加入8.8 mmol·L-1的H2O21 mL，搖勻后在37 ℃的恒溫水浴鍋中反應30 min，在波長510 nm下測定吸光度A1，同時用甲醇做空白對照，蒸餾水代替H2O2做陽性對照。羥基自由基清除率計算公式如式（2）：

式中：A0為甲醇代替臍橙飲品溶液的吸光度；A1為加入臍橙飲品溶液的吸光度；A2為蒸餾水代替H2O2溶液的吸光度。

1.2.6 揮發(fā)性成分的分析

1.2.6.1 樣品預處理 參照文獻[21-22]的方法，基于HS-SPME/GC-MS 對揮發(fā)性物質的分析，采用內標法進行半定量分析，內標選用濃度為0.4175 mg·L-1的仲辛醇。取3.8 mL 發(fā)酵樣品加入0.2 mL 稀釋的仲辛醇（用超純水稀釋1×105倍），置于頂空瓶中，加入1 g NaCl，加蓋密封，放入60 ℃恒溫水浴中平衡20 min，將老固相微萃取器插在樣品瓶上，吸附20 min 后拔出，插入氣相色譜儀進樣口，于220 ℃解吸3 min，進行GC-MS 檢測分析。

1.2.6.2 GC-MS 檢測條件 a.氣相色譜條件：色譜柱為DB-Wax（30 mm×0.25 mm×0.25 μm），進樣溫度為240 ℃；程序升溫：初始溫度40 ℃保持2 min；以6 ℃·min-1升至240 ℃保持4 min；載氣為氦氣，線速為1.0 mL·min-1，不分流。

b.質譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70 eV，燈絲流量為0.20 mA，離子源溫度為200 ℃，接口溫度為250 ℃。

1.2.7 電子鼻香氣成分的測定 電子鼻可對特定香氣成分進行響應，然后可以通過模式識別算法來執(zhí)行區(qū)分和分類[23]。為了研究臍橙汁發(fā)酵過程中風味的變化，分析發(fā)酵中的風味變化，采用頂空吸氣法[24]檢測，比較氣味的差異性，并使用Origin 2018 進行主成分分析對其風味特征進行比較，表1 為電子鼻的10 個傳感器性能。

表1 電子鼻的10 個傳感器的性能Table 1 Ten sensors performance of the e-nose

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 進行顯著性分析，柱狀圖折線圖采用 Origin 2018 進行繪制，每組試驗三個平行，所有結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 臍橙發(fā)酵過程中活菌數(shù)和pH 的變化

在臍橙發(fā)酵初期，酵母菌SC-125 和植物乳桿菌B-5 都能很好的代謝臍橙中的有機質，表現(xiàn)出了較好的生長能力。如圖1A 所示，在共發(fā)酵前期，酵母菌SC-125 迅速增加達約8.0 CFU·mL-1，這是由于臍橙汁中的還原糖為酵母菌提供了營養(yǎng)物質。盡管隨著發(fā)酵時間的延長，共發(fā)酵酵母菌SC-125 活菌數(shù)在降低，但共發(fā)酵中的植物乳桿菌B-5 活菌數(shù)保持相對的穩(wěn)定，其利用酵母代謝產(chǎn)物和還原糖等營養(yǎng)物質代謝產(chǎn)生了乳酸、氨基酸等[25]，使飲品中的可滴定酸含量升高，導致pH 下降（如圖1B 所示）。葡萄酒pH 的最佳活性是2.5～3.8，三種不同菌種發(fā)酵飲品的pH 均在此范圍，而且都有下降趨勢，pH 的大小會影響最終產(chǎn)品中高級醇的含量，從而影響飲品的風味。

圖1 臍橙發(fā)酵過程中活菌數(shù)（A）和pH（B）的變化趨勢Fig.1 Variation trend of viable count (A) and pH (B) during navel orange fermentation

2.2 臍橙發(fā)酵過程中酒精度和還原糖含量的變化

還原糖的利用表明了酵母進行酒精發(fā)酵和底物轉化的能力[26]，而微生物對糖的耐受性和利用率也成為發(fā)酵終點判斷的重要指標之一。如圖2 所示，在發(fā)酵前期，釀酒酵母SC-125 單獨發(fā)酵和共培養(yǎng)的還原糖含量從70.31 g·L-1迅速下降，分別達到3.4 和3.2 g/L，符合葡萄酒還原糖的標準[15]，即4 g/L 以下；臍橙飲品酒精度持續(xù)升高，0～96 h，釀酒酵母SC-125 單獨發(fā)酵的酒精度比共發(fā)酵的酒精度高，酒精度都在60 h 時達到最高峰，說明植物乳桿菌B-5 同型乳酸發(fā)酵利用還原糖生長繁殖，與釀酒酵母SC-125 共發(fā)酵中能起到一定的降低酒精度的作用。整個發(fā)酵過程中，共發(fā)酵酒精度在0～6%左右，發(fā)酵終點酒精度為5.2%，與葡萄酒低醇標準6%以下相符。

圖2 臍橙發(fā)酵過程中酒精度和還原糖含量的變化Fig.2 Changes in alcohol content and reducing sugar content during navel orange fermentation

2.3 臍橙發(fā)酵過程中總酚含量的變化和臍橙飲品抗氧化能力分析

由于酵母細胞會對酚類物質產(chǎn)生吸附作用，隨著發(fā)酵液環(huán)境的變化，又會產(chǎn)生解吸作用[27]，從圖3A 可知，對照組釀酒酵母SC-125 單獨發(fā)酵過程中，總酚含量差異波動較大，而隨著植物乳桿菌B-5 的添加，共發(fā)酵總酚含量最高，共發(fā)酵總酚含量從338.78 mg·L-1上升到355.5 mg·L-1，相比對照組酵母SC-125 總酚提高了7.73%。共發(fā)酵對DPPH 自由基的清除率和羥基自由基清除率最高，這與總酚含量的變化是一致的，共發(fā)酵臍橙飲品的抗氧化能力與總酚含量呈正相關關系，這與王東偉等[28]的研究是一致的。如圖3B 所示，對照組釀酒酵母SC-125、對照組植物乳桿菌B-5 以及共發(fā)酵對DPPH 自由基的清除率分別由臍橙汁的62.67%提高到75.54%、72.45%、78.82%，對羥基自由基的清除率分別由初始的68.77%提高到74.71%、71.82%、77.08%。共發(fā)酵對DPPH 自由基的清除率和羥基自由基清除率最高，。證明菌株的協(xié)同作用發(fā)酵有利于抗氧化活性的增加，且共發(fā)酵的抗氧化能力效果最佳。

圖3 臍橙發(fā)酵過程中總酚含量（A）的變化和自由基清除率（B）Fig.3 Changes of total phenolic content (A) and free radical scavenging rate (B) during navel orange fermentation

2.4 臍橙發(fā)酵飲品揮發(fā)性物質及電子鼻主成分分析

通過對發(fā)酵結束后的樣品進行HS-SPME/GCMS 進行分析，得到如圖4 及表2 的結果。釀酒酵母SC-125 單菌發(fā)酵共有41 種揮發(fā)性成分，含有16 種酯類、16 種醇類、4 種酸類、4 種醛酮類、1 種其他類；植物乳桿菌B-5 單菌發(fā)酵共檢測出38 種，含有15 種酯類、15 種醇類、3 種酸類、4 種醛酮類、1 種其他類；共發(fā)酵共檢測出53 種揮發(fā)性成分，包括23 種酯類、19 種醇類、4 種酸類、5 種醛酮類、2 種其他類。相比于釀酒酵母SC-125 和植物乳桿菌B-5，共發(fā)酵后有更多的風味物質，還產(chǎn)生特有的揮發(fā)性成分，如甲酸異丙酯、十一酸乙酯、乙酸異丁酯、丁酸甲酯、四氫芳樟醇、1-十四醇、2-戊醇、十一醛、2-硝基丙烷，這些物質賦予臍橙飲品醚香、梨子、蘋果、干酪、玫瑰和木香橙皮等香氣特征，這與之前的研究類似，即酵母菌與乳酸菌共發(fā)酵會產(chǎn)生更多的揮發(fā)性物質[30]。

圖4 臍橙飲品揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of volatile components in navel orange beverage

表2 三種發(fā)酵方式的臍橙飲品揮發(fā)性物質的含量Table 2 Content of volatile substances in three kinds of fermented navel orange drinks

續(xù)表2

酯類化合物對果酒的主體香型具有重要的作用，是構成果酒香氣的重要物質[31]。共發(fā)酵酯類物質含量和種類高于酵母菌SC-125 和植物乳桿菌B-5，其中酵母菌SC-125 的酯類物質種類及含量高于植物乳桿菌B-5，主要產(chǎn)生的香氣物質有乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯和3-羥基己酸乙酯，共發(fā)酵使這些物質的含量分別提高到479.54、407.48、309.44、273.51、65.24 、127.57 μg/L。乙酸苯乙酯[32]呈草莓香味，月桂酸乙酯呈油脂水果味，乙酸乙酯具有果子的芳香，癸酸乙酯具有白蘭地和果香，辛酸乙酯具有花香和酒香，增加了臍橙飲品的復雜性。

醇類物質是果酒中的主要香氣成分，主要通過糖代謝分解產(chǎn)生或是果酒中氨基酸轉化形成[33]。對比三種發(fā)酵方式，醇類物質在種類和含量上均有不同，其中在共發(fā)酵中種類更多，含量最高，主要的醇類物質如：苯乙醇、4-萜烯醇[34]、異戊醇和正己醇。苯乙醇具有溫和淡雅的玫瑰花氣味，4-萜烯醇呈胡椒香和較淡的泥土香，異戊醇有蘋果白蘭地香氣，正己醇微帶酒香和果香。張毅堅等[12]的研究表明酵母菌與植物乳桿菌共培養(yǎng)增加了更多的醇類物質，使發(fā)酵制品具有更好的風味。

酸類物質是酵母代謝產(chǎn)生的次級物質，在本研究中，酸類物質主要有辛酸、庚酸、油酸和9-癸烯酸，共發(fā)酵的酸類物質含量比單菌發(fā)酵含量更少，這可能是共發(fā)酵中的酸與醇發(fā)生反應產(chǎn)生更多酯類物質[35]。

醛酮類和其他類物質在本試驗中含量占比較少，如正辛醛、3-羥基-2-丁酮和2-甲基吡嗪，正辛醛呈果香、茉莉香氣，3-羥基-2-丁酮呈奶油香氣，2-甲基吡嗪有牛肉加熱時的香味和果仁香味，這些物質與酯類、醇類和酸類物質相互協(xié)同，賦予了飲品更多的風味。

2.5 通過電子鼻比較臍橙飲品香氣成分

由圖5 可知，第一主成分區(qū)分貢獻率為83.9%，第二主成分區(qū)分貢獻率為8.2%，兩個主成分區(qū)分貢獻率和為92.1%，大于90%，表明兩個主成分已經(jīng)基本代表了樣品的主要信息特征[36]，而且風味相互獨立，整體區(qū)分度較好，其中W5S、W1S、W2S 貢獻較大，他們分別對氮氧化合物、短鏈烷烴、乙醇靈敏。PCA 顯示臍橙發(fā)酵飲品與臍橙原汁區(qū)分明顯，共發(fā)酵與單菌發(fā)酵的臍橙飲品在第一主成分和第二主成分上雖然有交叉，但是雷達圖可以明顯看出，共發(fā)酵10 個傳感器得分均高于臍橙原汁和單菌，尤其在W5S、W1S、W2S 三個傳感器的得分更高，因此判斷共發(fā)酵飲品香氣物質相較于臍橙原汁以及單菌發(fā)酵飲品更加豐富。

圖5 臍橙原汁與不同發(fā)酵飲品的PCA 圖和雷達圖Fig.5 PCA and radar plots of navel orange juice and different fermented beverage

3 結論

本研究以金堂臍橙為發(fā)酵原料，首次利用釀酒酵母和植物乳桿菌發(fā)酵臍橙飲品，并比較了釀酒酵母SC-125 和植物乳桿菌B-5 單獨發(fā)酵以及共發(fā)酵臍橙過程中各項指標的變化規(guī)律，結果表明：在共發(fā)酵前期釀酒酵母SC-125 迅速繁殖，還原糖含量下降；酒精度持續(xù)上升后下降最終達到為5.33%，低于釀酒酵母SC-125 單獨發(fā)酵；其抗氧化能力強，共揮發(fā)性成分的種類更加豐富，特有成分賦予了共發(fā)酵的臍橙飲品椰子、堅果和醚香等香氣；結合主成分分析，共發(fā)酵飲品對氮氧化合物、短鏈烷烴、乙醇更加靈敏?？傮w來說，釀酒酵母與植物乳桿菌協(xié)同發(fā)酵制備臍橙飲品口感酸甜適中，香氣濃郁，為臍橙風味飲品提供了理論依據(jù)和技術參考。后續(xù)還可以針對臍橙飲品的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，進一步探討不同菌種接種量及其接種順序等因素對臍橙飲品品質的影響。