基于大腸桿菌表達系統(tǒng)制備β-酪蛋白研究

艾正文

（乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司，乳業(yè)研究院，上海 200436）

酪蛋白是牛乳中含量最多的蛋白質(zhì)，約占牛奶總蛋白質(zhì)的80%。其中，β-酪蛋白約占酪蛋白的30%左右[1]。根據(jù)研究顯示，由于受到自然界奶牛的雜交和基因突變等因素的影響，牛乳中β-酪蛋白有多達10 余種變異體，其中以A1 和A2 為比較常見的變異體[2-4]。有研究表明，A2β-酪蛋白（A2，βcasein-A2）在消化過程中不會像A1β-酪蛋白（A1，βcasein-A1）一樣產(chǎn)生β-酪啡肽-7（BCM-7）[5-6]，而BCM-7 可能與過敏、消化吸收障礙有關(guān)[7-8]。因此近幾年A2β-酪蛋白牛奶成為人們關(guān)注的焦點之一。通過分析表明，A1 和A2β-酪蛋白區(qū)別在于第67 位氨基酸的不同，這種分子結(jié)構(gòu)細微的差別，為后期分離和純化帶來了挑戰(zhàn)[9]，也是市面上還無商業(yè)化的A1 和A2 蛋白標準品可供使用的重要原因。目前對A1 和A2 蛋白的定量主要通過購買的β-酪蛋白的混合標準品進行折算定量，從而會對其定量的準確性和穩(wěn)定性帶來影響[10]。

隨著生物學技術(shù)的發(fā)展，細胞工廠概念應運而生。以大腸桿菌、酵母為代表的微生物表達系統(tǒng)具有成本低、易于擴大培養(yǎng)等特點[11-13]，已作為最為常用的生物合成手段之一，廣泛應用于目標蛋白[14]、天然產(chǎn)物[15-16]、藥物[17]和食品[18]的合成中。牛乳中的酪蛋白作為牛乳蛋白質(zhì)的重要組成成分之一，具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。雖然陳愛亮等[19]通過篩選純合型A1 或A2 奶牛，并從其乳汁中通過反復離心、過濾以及沉淀等過程可以得到A1 或者A2 蛋白，但是傳統(tǒng)方式獲取牛奶中的特定β-酪蛋白具有生產(chǎn)效率低、蛋白純度低以及資源消耗大的特點。如何高效且低成本的獲得可替代蛋白成為在過去的一段時間內(nèi)各國研究的熱點，且并在此領域研究已經(jīng)取得了一系列突破[20-21]。雖然目前通過基因工程手段已在實驗室階段實現(xiàn)了利用大腸桿菌、畢赤酵母菌等微生物作為底盤細胞實現(xiàn)α-乳白蛋白、β-乳球蛋白以及乳鐵蛋白等乳成分蛋白的生物合成[22-25]。Keppler 等[23]以大腸桿菌為載體成功實現(xiàn)了β-乳球蛋白不同變異體的重組表達，所獲得的重組蛋白與原生β-乳球蛋白在理化特性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及翻譯后修飾都基本相似，然而目前針對β-酪蛋白變異體合成的相關(guān)研究還鮮有報道。

本研究以大腸桿菌為工程載體，通過構(gòu)建特定β-酪蛋白變異體表達系統(tǒng)，探索A1 和A2β-酪蛋白生物合成的可能性，從而解決采用傳統(tǒng)分離純化手段制備結(jié)構(gòu)細微差異的變異體蛋白帶來的工藝難題，從而為后續(xù)乳蛋白定向合成以及相關(guān)乳制品的A1 和A2 蛋白定量檢測提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表達質(zhì)粒pET-28a（+）、大腸桿菌感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化宿主Top10 上海生工；表達宿主菌大腸桿菌BL21（DE3） 卡梅德生物；蛋白Maker、aq DNA 聚合酶、NdeI、XhoI 限制性內(nèi)切酶 賽默飛世爾公司；Ni Sepharose FF GE；Tricine、SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 大連寶生物工程公司；引物合成和測序 均由上海生工完成；卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）等其他化學試劑 均為國產(chǎn)市售分析純。

AKTAprime plus 蛋白純化系統(tǒng) GE 公司；5418R高速冷凍離心機 Eppendorf；5200 凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；BJ-2CD 超凈工作臺 上海博迅儀器有限公司；FreeZone 真空冷凍干燥機 Labconco；Mini-PROTEAN Tetra 電泳儀 伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；HPP110 恒溫恒濕培養(yǎng)箱德國美墨爾特公司；ZQLY-180ES 搖床 上海知楚儀器有限公司；ABI Veriti PCR 儀 賽默飛世爾公司；UV-1780 紫外分光光度計 島津公司。

1.2 實驗方法

本研究針對我院收治的82例患者的血管超聲檢查結(jié)果進行對比分析后發(fā)現(xiàn)，＞60歲組在性別、吸煙史、高血壓、糖尿病、冠心病、下肢動脈疾病的比例明顯高于≤60歲組，P＜0.05。這也進一步表明頸動脈狹窄與年齡呈現(xiàn)正相關(guān)，年齡越大意味著頸動脈病變發(fā)生率越高，進而引發(fā)腦卒中的幾率就越高。分析其原因與老年人免疫功能下降、血壓升高、代謝紊亂等一系列不良因素相關(guān)。老年人下肢動脈病變和冠心病的發(fā)生率較高，進而頸動脈病變的發(fā)生率隨之升高。

A1 蛋白氨基酸序列：

MKVLILACLVALALARELEELNVPGEIVES LSSSEESITRINKKIEKFQSEEQQQTEDELQDKIH PFAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQNIPPLTQTPVVVP PFLQPEVMGVSKVKEAMAPKHKEMPFPKYPVE PFTESQSLTLTDVENLHLPLPLLQSWMHQPHQP LPPTVMFPPQSVLSLSQSKVLPVPQKAVPYPQR DMPIQAFLLYQEPVLGPVRGPFPIIV

1.2.3 表達菌株轉(zhuǎn)化 取大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)一只100 μL，放置冰上化凍，超凈工作臺內(nèi)取1.5 mL無菌離心管，并均分50 μL 感受態(tài)細胞。在超凈工作臺中向感受態(tài)細胞中加入20 μL 制備的質(zhì)粒，輕輕混勻后，冰浴30 min。隨后，在42 ℃條件下熱擊90 s后立即冰浴5 min，取30 μL 涂布LB（含50 μg/mL卡那霉素）平板，37 ℃培養(yǎng)14 h（過夜培養(yǎng)）后挑取單克隆進行活化培養(yǎng)。

2011年九十月份的一天，鄧強告訴林中偉，可以讓他來做安居華苑項目，但是需要城投公司下屬的肇慶市建筑工程有限公司（以下簡稱“市建公司”）去投標，等市建公司中標后再和林中偉合作。此前，鄧強已經(jīng)和市建公司分管經(jīng)營的副總經(jīng)理程某打好了招呼，說會有一個姓林的找他，準備拿市建公司的資質(zhì)投標肇慶城投準備建的經(jīng)濟適用房項目，讓程總適當照顧一下林總。

MKVLILACLVALALARELEELNVPGEIVES LSSSEESITRINKKIEKFQSEEQQQTEDELQDKIH PFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVP PFLQPEVMGVSKVKEAMAPKHKEMPFPKYPVE PFTESQSLTLTDVENLHLPLPLLQSWMHQPHQP LPPTVMFPPQSVLSLSQSKVLPVPQKAVPYPQR DMPIQAFLLYQEPVLGPVRGPFPIIV

1.2.2 表達載體的構(gòu)建 根據(jù)其設計對應的堿基序列和相應的帶Nde I 和Xho I 酶切位點的引物（見表1）進行目的片段的克隆。然后將PCR 擴增產(chǎn)物和表達載體pET28a（+）分別用Nde I 和Xho Ⅰ雙酶切，用試劑盒回收后進行連接得到pET28a（+）-CSN2-A1 和pET28a（+）-CSN2-A2。連接產(chǎn)物隨后分別轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)細胞，并提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。根據(jù)鑒定結(jié)果，將鑒定正確的質(zhì)粒做進一步測序[27]。

表1 設計引物序列Table 1 Design primer sequence

A2 蛋白氨基酸序列：

1.2.4 表達鑒定 方法參考文獻[28-29]略作修改，具體如下，從1.2.3 的LB 平板中挑取單克隆，加入2 mL LB 液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL 卡那霉素）活化至菌體OD600為0.6～0.8 后，轉(zhuǎn)接到5 mL LB 液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL 卡那霉素）培養(yǎng)至菌體OD600為0.6～0.8 后加入不同濃度的IPTG（0.2 mmol/L 和1 mmol/L）在37 ℃和15 ℃分別誘導表達4 h 和30 h，收集菌體。

取誘導表達前與誘導后各條件的菌體進行超聲破碎后，取上清和沉淀制樣SDS-PAGE 分析，SDSPAGE 分離膠的配制和實驗方法見相關(guān)文獻報道[15]。

1.2.5 放大表達與親和純化

A1 和A2 蛋白目標基因片段長度為684 bp，并分別與表達質(zhì)粒pET28a（+）構(gòu)建得到pET28a（+）-CSN2-A1 和pET28a（+）-CSN2-A2（產(chǎn)物長度：684+5.3k bp）重組表達質(zhì)粒后分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆進行質(zhì)粒提取，用Nde I 和Xho I 雙酶切鑒定。通過SDS-PAGE 電泳發(fā)現(xiàn)有符合大小的目的條帶出現(xiàn)（圖2），鑒定結(jié)果表明提取的質(zhì)粒為重組表達，且測序結(jié)果與理論一致。

1.2.1 目的表達蛋白氨基酸序列 通過在Uniprot數(shù)據(jù)庫（www.uniprot.org）中查找β-酪蛋白有224 氨基酸序列（P02666），其中在N 端包含15 個氨基酸組成的信號肽序列[26]。根據(jù)A1 和A2 蛋白在氨基酸組成上的差異分別得到對應的氨基酸序列后委托卡梅德生物設計相應的堿基序列。同時通過Prot Param 軟件分別對A1 和A2 蛋白理化性質(zhì)進行預測。

1.2.5.1 放大表達 從1.2.3 表達鑒定中選取能夠表達目的蛋白的BL21 菌株，接種到1L LB 培養(yǎng)基（含50 μg /mL 卡那霉素）中，220 r/min，37 ℃搖床擴大培養(yǎng)至OD600值至0.6～0.8，再加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG 37 ℃誘導培養(yǎng)4 h 后，4000 r/min 離心收集菌體待用[30]。

1.2.5.2 親和純化 重組蛋白的親和純化方法主要參考文獻[31-32]，并稍作修改。即將收集獲得的菌泥用40 mL 含20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl 的緩沖液（pH=7.2）進行重懸。然后在參考冰浴條件下超聲破碎，功率為420 W，超聲3 s，間隔5 s，持續(xù)15 min。最后4 ℃，12000 r/min 條件下離心20 min，收集上清和沉淀，待用。

總而言之，在新的社會形勢下，博物館承擔的非物質(zhì)文化保護責任愈來愈重，這就決定著我們地方政府要加大對博物館模式的支持力度。此外，博物館模式運營時間較短，仍存在一些不足之處，如何加強非物質(zhì)文化遺產(chǎn)的傳承和發(fā)揚有待于進一步探索。

1.2.5.3 上清純化 1.2.5.2 中上清經(jīng)過0.22 μm 過濾后進行Ni 柱親和層析純化。正式純化前先用不少于5 倍柱體積的雙蒸水沖洗Ni 柱，然后柱子用平衡緩沖液平衡100 mL。平衡后用上清分批緩慢注入Ni 柱中，隨后用不同梯度的咪唑緩沖液依次洗脫柱子，并分別取樣。實驗過程中可以利用Bradford 檢測洗脫情況，當洗脫液在Bradford 液中未變藍，則沖洗干凈。平衡緩沖液為20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl，pH=8.0。清洗緩沖液為20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl，咪唑濃度分別為5、20、50、和80 mmol/L，pH=8.0。最后用pH=8.0，20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+300 mmol/L 咪唑緩沖液洗脫。

1.2.5.4 包涵體純化 1.2.5.2 中沉淀加入適量20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl，pH=8.0 緩沖液分散后在4℃，12000 r/min 條件下離心10 min。隨后沉淀用含0.3%曲拉通的緩沖液（20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl，pH=8.0）和20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+2mol/L 尿素， pH=8.0 再按照相同步驟清洗兩次。然后在沉淀中加入15 mL 的20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+8 mol/L 尿素，pH=8.0，在4 ℃條件下緩慢攪拌，溶解沉淀。最后4 ℃，12000 r/min 離心10 min 獲得沉淀復溶上清并經(jīng)過0.22 μm 過濾后進行Ni 柱親和富集純化。后續(xù)純化步驟同“上清純化”，平衡緩沖液為20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+8 mol/L 尿素，pH=8.0，清洗緩沖液為20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+8 mol/L尿素（pH=8.0），咪唑濃度分別為5、20、50 和80 mmol/L 清洗。最后用20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+8 mol/L 尿素+300 mmol/L 咪唑，pH=8.0 緩沖液洗脫。流穿純化樣品取50 μL 加入loading buffer 后100 ℃煮樣后進行SDS-PAGE 分析。

1.2.5.5 包涵體復性 上述純化樣品先用20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl，pH=8.0，以2 mL/min 流速滴加稀釋至尿素終濃度為4 mol/L，4 ℃冰箱中以350 r/min 攪拌速度攪拌48 h 后，將樣品裝入7 kDa孔徑透析袋中進行復性，方法參考相關(guān)文獻報道并略作調(diào)整[15,33]，詳細步驟如下：用1 L 20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+2 mol/L 尿素，pH=8.0 緩沖液，4 ℃冰箱中以350 r/min 攪拌速度攪拌24 h，按順序更換1L 20 mmol/L PB+150 mmmol/L NaCl+1 mol/L 尿素（pH=8.0）、1 L 20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+0.5 mol/L 尿素（ pH=8.0） 、 1L 20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+0.5 mol/L 尿素（pH=8.0）和1L 20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl（pH=8.0）透析緩沖液，分別在4 ℃冰箱中以350 r/min 攪拌速度攪拌24 h。從透析袋中移出經(jīng)透析的蛋白質(zhì)溶液，然后12000 r/min，4 ℃離心10min 取上清50 μL，加入10 μL loading buffer 100 ℃煮樣，進行SDS-PAGE檢測。同時用BCA 蛋白檢測試劑盒對復性后的蛋白濃度進行測定。

一是有利于開拓教學新陣地。院校各系部、各教研室可以結(jié)合自身特點開設專欄，及時發(fā)布并更新政府部門制定的一系列會計、稅收、工商等財經(jīng)法規(guī)，引入在線精品課程、在線題庫、在線交流、掌上高校等教學資源，作為會計教學的出發(fā)點和落腳點。同時，積極回應學生、企事業(yè)單位、學生家長和社會關(guān)注的問題，利用微博、微信及時處理學生反應的問題，解疑釋惑。

2．AP患者性別比：1991-1995年、1996-2000年、2001-2005年、2006-2010年AP患者的男女性別比分別為1.507(101/67)、2.449(196/78)、2.619(241/92)、2.862(269/94)，1996-2010年的3個時間段男女性別比的差異無統(tǒng)計學意義，但3個時間段所有AP患者的性別比為2.655(701/264)，較1991-1995年間顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(χ2 =12.193，P=0.0005)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010，蛋白質(zhì)理化特性分析采用在線Prot Param 軟件，引物設計采用Primer 5，序列分析采用軟件DNASTAR。

2 結(jié)果與分析

2.1 A1 和A2 蛋白理化性質(zhì)預測

通過Prot Param 軟件對A1 和A2 蛋白氨基酸序列進行分析得到對應蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，結(jié)果見表2。A1 和A2 蛋白分子量在25 kDa 左右，理論等電點在5.2～5.4 之間，為酸性蛋白質(zhì)，其中帶負電殘基明顯多于帶正電殘基。此外A1 和A2 蛋白經(jīng)過預測，不穩(wěn)定系數(shù)均超過40，因此均屬于不穩(wěn)定蛋白[26]。同時，根據(jù)所有氨基酸親水值的總和與氨基酸總數(shù)量的比值（親水系數(shù)）來看這兩種蛋白均偏親水性，其負值越大表示親水性越強[35]。從圖1 可以看到A1 和A2 蛋白親疏水性基本相同，最強疏水性氨基酸殘基均位于氨基酸序列的第7 位（Ala，Score:3.378），而最強親水性氨基酸殘基同樣位于氨基酸序列的第55 位（Gln，Score:-3.189）。

圖1 A1 和A2 蛋白親疏水性預測結(jié)果Fig.1 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction results of A1/A2 proteins

表2 A1/A2 蛋白理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of A1/A2 proteins

2.2 A1 和A2 蛋白重組表達載體的構(gòu)建

7月27日下午到前半夜,受強雷雨云團影響,桐廬、建德、淳安等地發(fā)生短時暴雨、雷雨大風等強對流天氣。根據(jù)雷達回波顯示,事件發(fā)生時桐廬縣合村鄉(xiāng)有雷暴云團覆蓋。27日19:35前后起,合村鄉(xiāng)出現(xiàn)局地強對流天氣,距廊橋所在位置約900 m的合村自動氣象觀測站(以下簡稱合村氣象站)于19:34測得的極大風速為24.1 m/s(圖1),風向109°(東南偏東風);19—20時雨量8.4 mm。根據(jù)現(xiàn)場踏勘,該站探測環(huán)境符合氣象觀測規(guī)范要求,氣象探測設施維護到位,設備工作狀態(tài)正常,觀測資料具備可用性。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig.2 Results of recombinant plasmid for doubleenzyme digestion

2.3 單克隆菌株的篩選

分別將提取的質(zhì)粒加入到感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）中，然后在含有卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)。隨后挑選單菌落加入到含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中活化、傳代培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入濃度為0.2 mmol/L 的IPTG 進行誘導表達。因此取誘導表達前與誘導后各條件的菌體進行超聲破碎后，取沉淀制樣SDS-PAGE 分析，驗證結(jié)果見圖3。兩種重組表達菌株分別與各自未加IPTG 的重組表達菌株做對比。由于在重組蛋白C 端分別帶有6×His 標簽，因此A1 和A2 重組蛋白的理論相對分子量分別為25.98 和25.94 kDa。

1.2.6 質(zhì)譜鑒定 通過SDS-PAGE 分離得到的目的蛋白，利用干凈的刀片收集目的蛋白膠條經(jīng)酶解后在卡梅德生物科技有限公司進行質(zhì)譜覆蓋度檢測。同時目的蛋白經(jīng)過胰蛋白酶酶解后采用LC-MS/MS，分別以IHPFAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQNIPPLT QTPVVVPPFLQPEVMGVSK（A1）和IHPFAQTQS LVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEV MGVSK（A2）為特征性肽段進行定性分析，具體方法可參考文獻[34]報道。

圖3 不同A1 重組菌體誘導表達SDS-PAGE 考馬斯亮藍染色結(jié)果Fig.3 Results of SDS-PAGE by commassie blue staining for different A1 recombinant stains of induced expression

結(jié)果表明，A1 和A2 不同單克隆菌株均在25 kDa條帶附近具有比較明顯的目的蛋白條帶。從表1 可知，A1/A2 蛋白中帶負電的氨基酸殘基較多，分子間和分子內(nèi)的靜電斥力較大，因此電泳圖中顯示的實際蛋白分子量略微偏大[26]。此外，從圖3 和圖4 中均可以發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)誘導的A1 和A2 重組表達載體在分子量25 kDa 處也有不同程度的目的條帶出現(xiàn)，因此顯示A1 和A2 單克隆菌株未經(jīng)誘導即可能發(fā)生了輕微泄露表達，但是經(jīng)過誘導單克隆菌株表達相對更加明顯。隨后挑選表達明顯單克隆菌株用于后續(xù)表達放大。

圖4 不同A2 重組菌體誘導表達SDS-PAGE 考馬斯亮藍染色結(jié)果Fig.4 Results of SDS-PAGE by commassie blue staining for different A2 recombinant stains of induced expression

2.4 不同溫度以及不同IPTG 濃度誘導表達結(jié)果

為了研究陽性克隆菌株在不同誘導劑濃度和溫度條件下重組表達載體目的蛋白表達情況，分別將A1 和A2 重組表達載體在37 ℃和16 ℃條件下添加不同濃度的IPTG（0.2 和1 mmol/L）進行誘導表達。實驗結(jié)果見圖5 和圖6。結(jié)果表明，A1 和A2蛋白均以包涵體的形式表達，存在于細胞破碎后的沉淀中，而上清液中基本不含目的表達蛋白。這與相關(guān)研究結(jié)果類似[24]，原因可能與大腸桿菌表達系統(tǒng)的特點有關(guān)。當重組蛋白在大腸桿菌細胞內(nèi)大量表達時，可能受到環(huán)境脅迫以及缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子等因素，從而造成不溶性蛋白的產(chǎn)生[36]。目前有研究報道通過低溫培養(yǎng)能夠提高目標蛋白的表達可溶性[37]，但是通過對蛋白表達條件進行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，A1 和A2 重組蛋白在15 ℃條件下僅少量表達，同時鑒于IPTG 具有一定的毒性[30]，因此選擇37 ℃，0.2 mmol/L IPTG 為后續(xù)誘導表達條件。

周家糧鋪院是村中一位周姓財主建造的自家宅院，兼做住宅和糧食鋪，由于此處高差變化大，建造時工匠根據(jù)“前店后廠”的傳統(tǒng)建筑布局思路[13]，建成了“下店上廠”的特色店鋪院落格局，下院主做糧食鋪，上院東廂房做糧倉，其余窯洞做居住或其他功能使用，測繪時的手繪鳥瞰圖如圖所示（圖5）。院落西面保留有村中唯一的一座石磨，上院的院中及下院東側(cè)散落有石碾及石砘，更體現(xiàn)了此處的糧鋪建筑屬性。下院五孔窯洞，東側(cè)兩孔為糧食鋪，因下院商業(yè)建筑的功能需求，使得與驛道相連的走道具有了重要的交通作用，不僅要滿足院落主人的使用，還要滿足來往買糧人的交通要求。

圖5 A1 重組菌株誘導表達SDS-PAGE 考馬斯亮藍染色結(jié)果Fig.5 Results of SDS-PAGE by commassie blue staining for A1 recombinant stains of induced expression

圖6 A2 重組菌株誘導表達SDS-PAGE 考馬斯亮藍染色結(jié)果Fig.6 Results of SDS-PAGE by commassie blue staining for A2 recombinant stains of induced expression

2.5 包涵體蛋白純化和復性

由于A1 和A2 蛋白均以包涵體的形式表達，因此將1.2.5.2 獲得的沉淀進行梯度洗脫后用8 mol/L尿素溶解，沉淀復溶上清過膜后用Ni 柱進行親和富集純化，分別收集上樣流出液、清洗樣和洗脫樣進行SDS-PAGE 電泳。圖7 和圖8 分別為A1 和A2 重組表達菌株誘導后得到的沉淀樣、復溶以及純化后樣品SDS-PAGE 電泳圖。實驗結(jié)果表明A1 和A2包涵體蛋白經(jīng)過清洗、復溶和純化后在25 kDa 附近出現(xiàn)目的蛋白條帶以外基本無其他雜蛋白，因此達到了預期純化目標。

圖7 A1 重組蛋白包涵體純化SDS-PAGE 考馬斯亮藍染色結(jié)果Fig.7 Purification results of SDS-PAGE by commassie blue staining for inclusion bodies of A1 recombinant protein

圖8 A2 重組蛋白包涵體純化SDS-PAGE 考馬斯亮藍染色結(jié)果Fig.8 Purification results of SDS-PAGE by commassie blue staining for inclusion bodies of A2 recombinant protein

包涵體通過純化后利用透析袋進行復性，得到復性后的重組的A1 和A2 蛋白樣品。SDS-PAGE檢測后呈單一條帶（圖9），且純度超過90%。經(jīng)BCA 蛋白定量檢測試劑盒測定，A1 和A2 重組蛋白濃度分別為1.5 和2.0 mg/mL。

城鄉(xiāng)規(guī)劃編制的一項重要內(nèi)容是城市用地豎向規(guī)劃，它是指在某規(guī)劃地段，對原地形地貌進行改造開發(fā)而開展的一系列規(guī)劃設計工作，包括平衡土石方、高程控制和確定坡度等內(nèi)容，前提是必須綜合滿足城市景觀、道路交通、建筑布置、地面排水等方面的要求。規(guī)劃者可以從城市豎向設計的實際需要出發(fā)搭建一個三維地理仿真環(huán)境，通過對測繪地理等多源數(shù)據(jù)的集成和融合，來研究場地設計、用地因子評價、綜合管網(wǎng)以及路網(wǎng)優(yōu)化等內(nèi)容，同時參考其他幾項關(guān)鍵技術(shù)，比如協(xié)同設計框架、參數(shù)化驅(qū)動的三維建模、漸進式規(guī)劃設計等，來完成基于三維地理空間環(huán)境下的城市用地豎向規(guī)劃方案(如圖2所示)。

圖9 A1 和A2 重組蛋白復性SDS-PAGE 考馬斯亮藍染色結(jié)果Fig.9 Results of SDS-PAGE by commassie blue staining for A2 recombinant protein after renaturation

2.6 質(zhì)譜鑒定

將重組表達得到的目的蛋白條帶切膠后用胰蛋白酶酶解后，離心和過濾后用于質(zhì)譜檢測。以A1和A2 蛋白理論序列為模板，利用質(zhì)譜檢測得到的多肽片段與理論氨基酸序列進行比較，圖10 分別為A1 和A2 重組表達蛋白質(zhì)譜檢測中匹配到的短肽，多肽覆蓋率分別為54%和45%。同時利用LC-MS/MS 對合成的重組A1 和A2 蛋白進行定性，實驗結(jié)果表明在重組表達的A1 和A2 蛋白中分別未檢出A2 和A1 蛋白特征肽段，且A1 和A2 蛋白占β-酪蛋白百分比均為100%。因此可以基本確定重組蛋白表達滿足要求。

圖10 質(zhì)譜檢測得到的A1 和A2 重組蛋白的短肽Fig.10 Short peptides of A1 and A2 recombinant proteins by MS detection（Bold means matched

3 結(jié)論

A1 和A2 蛋白作為β-酪蛋白兩種常見的變異體類型，由于兩者在分子結(jié)構(gòu)上的細微差異使其在用常規(guī)方法制備和純化上存在困難。通過Prot Param分析表明A1/A2 蛋白屬于不穩(wěn)定親水性蛋白，本研究利用分子生物學方法分別構(gòu)建了pET28a（+）-CSN2-A1 和pET28a （+）-CSN2-A2 兩個原核表達載體，并將其分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，在37 ℃，0.2 mmol/L IPTG 誘導條件下培養(yǎng)4 h 可以實現(xiàn)β-酪蛋白變異體蛋白的過表達，最終獲得的A1 和A2 重組蛋白含量分別為1.5 和2.0 mg/mL。這為人工合成特定變異體的β-酪蛋白提供了新的借鑒。然而由于大腸桿菌表達系統(tǒng)的局限性，實驗結(jié)果表明重組A1 和A2 蛋白均以包涵體形式表達，需要進行復性等操作后才能進一步應用。如何進一步優(yōu)化表達系統(tǒng)，實現(xiàn)重組蛋白可溶性表達是后續(xù)需要進一步的研究方向。