大豆分離蛋白與金線魚肌球蛋白的相互作用對其凝膠特性的影響

劉 珍，王金廂，李學鵬, ，高瑞昌，勵建榮，儀淑敏，楊 青，位正鵬，季廣仁

（1.渤海大學食品科學與工程學院，國家魚糜及魚糜制品加工技術研發(fā)分中心，遼寧錦州 121013；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3.榮成泰祥食品股份有限公司，農(nóng)業(yè)部冷凍調(diào)理海洋食品加工重點實驗室，山東威海 234309；4.錦州筆架山食品有限公司，遼寧錦州 121007）

魚糜是一種穩(wěn)定的魚肉肌原纖維蛋白濃縮物，主要成分為肌球蛋白。魚糜制品是以魚糜為原料生產(chǎn)的一種具有高持水性、高黏彈性的凝膠狀食品，因其食用方便（無魚刺）、營養(yǎng)價值高（高蛋白、低脂肪）深受消費者喜愛。金線魚肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)物質(zhì)豐富、捕撈量大，其魚肉加工成的魚糜具有良好延展性、不易發(fā)生凝膠劣化、硬度適中等優(yōu)點，是加工魚糜及魚糜制品的第二大海水魚種，僅次于阿拉斯加鱈魚[1-2]。

凝膠性能是評價魚糜及魚糜制品品質(zhì)最重要的性能之一。據(jù)現(xiàn)有研究報道，影響魚糜及魚糜制品凝膠性的因素有很多，如魚的種類、生產(chǎn)工藝、外源添加物，其中外源添加物是提高魚糜凝膠強度常用的方法[3]。常用的外源添加物主要有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Transglutaminase，TGase）、動植物蛋白、淀粉、親水膠體及其它天然產(chǎn)物[4]。其中，植物蛋白廣泛應用于魚糜制品加工中，不僅可以提高魚糜制品的質(zhì)量，而且可以替代脂肪、動物蛋白生產(chǎn)出更健康、低脂的雙蛋白產(chǎn)品，提升產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。常用的植物蛋白有豆類分離蛋白、花生分離蛋白、活性谷蛋白、小麥蛋白等[4-5]。彭晶[6]研究發(fā)現(xiàn)添加1.5%的菜籽蛋白能夠改善白鰱魚魚糜的凝膠特性。Borderías 等[7]研究發(fā)現(xiàn)添加適量的豌豆分離蛋白能夠形成具有良好交聯(lián)凝膠網(wǎng)絡的、更具健康價值的魚肌原纖維蛋白凝膠。Wang 等[8]研究表明適量的花生分離蛋白或鷹嘴豆分離蛋白能改善帶魚肌球蛋白的凝膠特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰鮮金線魚 錦州市水產(chǎn)市場，平均尾重（120±10） g；大豆分離蛋白 生物試劑，蛋白質(zhì)≥85%，北京索萊寶科技有限公司；三磷酸腺苷二鈉、牛血清白蛋白標準品 北京索萊寶科技有限公司；馬來酸、乙酸鎂等其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

SORVALL Stratos 冷凍高速離心機 美國Thermo公司；UV-2550 紫外可見光分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；Fluoromax-4NIR 熒光分光光譜儀法國HORIBA 公司；Varian 640-IR 傅里葉變換紅外光譜儀 德國瓦瑞安公司；NanoBrook 粒度及Zeta電位分析儀 美國Brookhaven 儀器公司；TA.XT plus 質(zhì)構(gòu)儀 Stable Micro Systems 公司；S-4800 冷場發(fā)射掃描電鏡 日本日立公司；Discovery HR-1流變儀 美國TA 儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金線魚肌球蛋白的制備 參考Park 等[16]的方法并修改。取冰鮮金線魚背脊肉絞碎成肉糜，加入8 倍體積的鹽緩沖液A（含0.1 mol/L KCl 及20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5），均質(zhì)，反應15 min，3000 r/min 離心8 min（4 ℃）。取沉淀加入3 倍體積的鹽緩沖液B（含0.2 mol/L 乙酸鎂、0.45 mol/L KCl、1 mmol/L EGTA、5 mmol/Lβ-巰基乙醇及20 mmol/L Tris-馬來酸，pH6.8），加入三磷酸腺苷二納至其終濃度為10 mmol/L，均質(zhì)，4 ℃冰箱中靜置80 min，11000 r/min 離心15 min（4 ℃）。取上清液加入3 倍體積的碳酸氫鉀溶液（1 mmol/L），4 ℃冰箱中放置30 min，11000 r/min 離心15 min（4 ℃）。取沉淀加入2.5 倍體積的鹽緩沖液C（含0.5 mol/L KCl、5 mmol/Lβ-巰基乙醇及20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5），4 ℃下反應15 min，加入5 倍體積的碳酸氫鉀溶液（1 mmol/L），最后加入氯化鎂至其終濃度為10 mmol/L，4 ℃靜置過夜。第2 d 離心（18000 r/min，25 min，4 ℃），得到金線魚肌球蛋白沉淀（用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度，牛血清白蛋白作為標準蛋白制作標準曲線，得到的標準曲線方程為y=0.0499x+0.0008，R2=0.9997）。

1.2.2 金線魚肌球蛋白-SPI 混合樣品的制備 參考李政翰[17]的方法并修改。用緩沖液D（0.6 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl，pH7.0）調(diào)整金線魚肌球蛋白濃度為60 mg/mL，以溶液中金線魚肌球蛋白質(zhì)量為基準添加0、2%、3%、4%、6%和8%（w/w）的SPI 粉，混勻即為混合溶液，4 ℃儲藏（3 d 內(nèi)使用）。兩段式水浴加熱（40 ℃，30 min；93 ℃，20 min）后制得金線魚肌球蛋白-SPI 混合凝膠，冰水冷卻后于4 ℃冰箱中靜置過夜。

1.2.3 混合溶液平均粒徑的測定 用粒度儀測定樣品的平均粒徑。將添加SPI 的金線魚肌球蛋白濃度用緩沖液D 調(diào)整至0.5 mg/mL。測定溫度25 ℃，每組3 個平行。

1.2.4 混合溶液總巰基含量的測定 參考Yongsawatdigul 等[18]的方法并修改。取1.5 mL 5 mg/mL的混合溶液加入13.5 mL 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含8 mol/L 尿素、0.6 mol/L KCl、10 mmol/L EDTA，pH7.0），加入1.5 mL 10 mmol/L DTNB（5,5'-二硫雙（2-硝基苯甲酸））溶液，室溫下避光反應30 min，412 nm 處測定吸光度?？値€基含量按式（1）計算。

沒有尊重就沒有教育，教育是建立在尊重基礎上的教育，也是教育的出發(fā)點和歸宿。尊重源于對學生人格的認可，在教育教學面前教師與學生、學生與學生其實都是平等的個體，學生可能在智力、能力、情感等方面存在千差萬別的情況，但作為學生的基本屬性是不變的，都是我們教育的對象，是我們傳授知識的主體，是學習的主人，也是教學成敗的關鍵評價指標，不是好學生才評價，差學生也是評價的主體。只有尊重學生才愿意學；只有尊重學生才更喜歡學；只有尊重學習才更有尊嚴。尊重學生是我們從事教育教學的前題。

式中：T-SH 為總巰基含量；A 為412 nm 處的吸光度值；D 為稀釋倍數(shù)；C 為蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.5 混合溶液的紫外光譜 將添加SPI 的金線魚肌球蛋白濃度調(diào)整為0.5 mg/mL，掃描范圍為220～350 nm，掃描速度為高速，采樣間隔為1 nm，以緩沖液D 為空白。

1.2.6 混合溶液的熒光色譜 用熒光分光光譜儀測定其內(nèi)源熒光強度，將添加SPI 的金線魚肌球蛋白濃度調(diào)整為0.25 mg/mL。激發(fā)波長設置為280 nm，發(fā)射波長掃描范圍為300～420 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫為2.5 nm/3.0 nm。

1.2.7 凝膠強度的測定 金線魚肌球蛋白-SPI 混合凝膠的凝膠強度用質(zhì)構(gòu)儀測定。測定條件：P/5S 探頭，形變量40%，觸發(fā)力5 g，測前速度為2 mm/s，測中速度和測后速度均為1 mm/s。每組5 個平行。

1.2.8 凝膠質(zhì)構(gòu)的測定 將冷卻過夜的凝膠切成高度為20 mm 的圓柱體，進行TPA 分析，主要參數(shù)：探頭類型：P/50，測前速度為2 mm/s，測中速度和測后速度均為1 mm/s，壓縮比為40%，觸發(fā)力10 g。每組5 個平行。

1.2.9 動態(tài)流變學性質(zhì) 參考Sun 等[19]的方法并稍作修改。測定條件：金線魚肌球蛋白質(zhì)量濃度40 mg/mL、夾板直徑40 mm、狹縫間距為0.5 mm。升溫階段以3 ℃/min 的速度從25 ℃升溫至85 ℃，振蕩頻率1 Hz，應變0.5%。

1.2.10 凝膠分子間作用力的測定 參考Gómez-Guillén 等[20]的方法并稍做修改。稱取2 g 切碎的混合凝膠樣品，分別與10 mL 的0.05 mol/L NaCl（SA）、0.6 mol/L NaCl（SB）、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L 尿素（SC）和0.6 mol/L NaCl+8 mol/L 尿素（SD）混合，均質(zhì)，4 ℃放置1 h，8000 r/min、4 ℃離心20 min，使用雙縮脲試劑測定上清液的蛋白濃度。SB 液和SA 液中蛋白質(zhì)濃度之差、SC 液和SB 液中蛋白質(zhì)濃度之差以及SD 液和SC 液中蛋白質(zhì)濃度之差分別表示離子鍵含量、氫鍵含量和疏水相互作用含量。蛋白質(zhì)濃度按式（2）計算。

式中：C 為蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；A'為540 nm 處的吸光度值。

1.2.11 凝膠傅里葉紅外光譜的測定 混合蛋白凝膠冷凍干燥后研磨成粉末，將KBr 與粉末狀樣品按100:1 的比例混均壓片，用紅外光譜儀掃描，掃描波數(shù)范圍為400～4000 cm-1。

1.2.12 凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察 利用掃描電子顯微鏡觀察凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，凝膠用手術刀切成3 mm 左右厚的薄片，用2.5%的戊二醛溶液浸泡固定12 h，再用0.2 mol/L pH7.2 的磷酸鹽緩沖液沖洗，然后進行梯度濃度乙醇脫水，15 min/次。將脫水后的樣品真空冷凍干燥，凍干的樣品進行噴金處理。在掃描電鏡下用10 kV 的加速電壓觀察標本。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 25.0 和 Origin 9.0 進行統(tǒng)計分析和作圖，并以“均值±標準差”表示，采用Duncan 多重比較檢驗各均值的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI 添加量對金線魚肌球蛋白-SPI 混合溶液平均粒徑的影響

粒徑是蛋白質(zhì)聚集體大小的宏觀表現(xiàn)。當?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生變性、聚集時，粒徑就會增大。如圖1 所示，所有試驗組的粒徑均高于對照組，并且隨著SPI 添加量的增加粒徑逐漸變大。這是因為SPI 與金線魚肌球蛋白發(fā)生相互作用，誘導金線魚肌球蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，暴露出更多的疏水基團，蛋白分子通過疏水相互作用、靜電相互作用等聚集成簇，使粒徑增大[21]。Niu 等[22]發(fā)現(xiàn)SPI 和和肌肉蛋白之間主要通過疏水相互作用、氫鍵和二硫鍵產(chǎn)生相互作用，且經(jīng)過溫和加熱結(jié)合酸處理后的SPI 與肌肉蛋白間產(chǎn)生了更強的相互作用。在2%～4%的添加量范圍內(nèi)，粒徑增量較大，添加量超過4%以后，粒徑增量變小，表明4%添加量時，SPI、金線魚肌球蛋白間的結(jié)合近似飽和。

圖1 不同添加量SPI 對金線魚肌球蛋白粒徑的影響Fig.1 Effect of different addition of SPI on particle size of Nemipterus virgatus myosin

2.2 SPI 添加量對金線魚肌球蛋白-SPI 混合溶液總巰基含量的影響

蛋白分子的巰基含量變化趨勢在一定程度上表征蛋白三級結(jié)構(gòu)和二硫鍵的變化。由圖2 可知，未加熱條件下隨著SPI 添加量的增加，混合溶液的總巰基含量呈現(xiàn)先顯著增加后顯著減少的趨勢（P＜0.05）。這可能是因為適量的SPI 使金線魚肌球蛋白三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、蛋白分子變性展開，暴露出更多的活性巰基和隱藏巰基[23]；添加過量的SPI 又可能將暴露出來的活性巰基和隱藏巰基再次包埋或覆蓋，從而使總巰基含量呈現(xiàn)減少趨勢。Du 等[24]研究發(fā)現(xiàn)熱處理（＞ 40℃）導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開，原來位于內(nèi)部的巰基暴露、交聯(lián)形成二硫鍵。在SPI 添加量4%時混合溶液的總巰基含量最高，表明添加4% SPI 組樣品加熱后易形成更多的二硫鍵，這有助于凝膠特性的改善。

圖2 不同添加量SPI 對金線魚肌球蛋白總巰基含量的影響Fig.2 Effect of different addition of SPI on total sulfhydryl content of Nemipterus virgatus myosin

2.3 SPI 添加量對金線魚肌球蛋白-SPI 混合溶液紫外光譜的影響

紫外光譜是表征蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的一種常用方法，大多數(shù)蛋白質(zhì)由于色氨酸和酪氨酸殘基對光的吸收在280 nm 附近存在吸收峰。由圖3 可知，混合溶液有一個紫外吸收峰，波長在275 nm 左右，該峰峰值的變化與芳香族氨基酸的暴露有關。隨著SPI 添加量的增加，混合溶液紫外吸收峰值呈現(xiàn)出先上升后下降最后上升的趨勢，且SPI 添加組的吸光度均高于對照組。表明隨著SPI 添加量的增加，蛋白之間發(fā)生不同程度的交聯(lián)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，埋藏在內(nèi)部的發(fā)色基團有不同程度的暴露，導致特征峰值有不同程度的升高[25]。其中4%和8%的SPI 添加量時峰值較高，說明4%和8%的SPI 添加量下蛋白結(jié)構(gòu)展開的程度較高，更多的發(fā)色基團暴露在環(huán)境中。此外，6%的SPI 添加量時吸光度的下降可能是由于形成了高分子量聚合物，導致一些非極性芳香氨基酸殘基被部分掩蓋[26]；8%的SPI 添加量時吸光度上升的原因可能是添加的過量的SPI 本身所含有的芳香族氨基酸的引入以及蛋白的交聯(lián)共同作用的結(jié)果。

圖3 不同添加量SPI 對金線魚肌球蛋白紫外吸收光譜的影響Fig.3 Effect of different addition of SPI on the UV absorption spectra of Nemipterus virgatus myosin

2.4 SPI 添加量對金線魚肌球蛋白-SPI 混合溶液內(nèi)源熒光光譜的影響

內(nèi)源熒光強度通常用于通過估計受熒光能量影響的芳香族氨基酸殘基（主要是色氨酸）的變化來確定蛋白三級結(jié)構(gòu)的變化。由圖4 可知，添加SPI 后，混合溶液的熒光強度均低于對照組，出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象。表明SPI 與金線魚肌球蛋白的混合使金線魚肌球蛋白三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的芳香族氨基酸分子的側(cè)鏈基團暴露，金線魚肌球蛋白分子中色氨酸或酪氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了改變[27]。此外，隨著SPI 添加量的增加，混合溶液的熒光強度呈現(xiàn)先下降后上升最后下降的趨勢，4% SPI 組的內(nèi)源熒光強度最低，表明4%的SPI 與金線魚肌球蛋白相互作用時，更接近于位于蛋白疏水空腔內(nèi)自發(fā)熒光的氨基酸殘基[28]。SPI 添加量低于4%時熒光猝滅的主要原因可能是適量的SPI 誘導金線魚肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的內(nèi)部芳香族氨基酸殘基；6%的SPI 添加量時熒光強度的上升可能是由于形成了高分子量聚合物，導致一些非極性芳香氨基酸殘基被掩蓋；8%的SPI 添加量時熒光強度再次下降的原因可能是添加過量的SPI 本身所含有的芳香族氨基酸殘基的暴露和金線魚肌球蛋白暴露出的芳香族氨基酸殘基共同作用的結(jié)果。熒光光譜（圖4）與紫外光譜（圖3）的結(jié)果一致，均證明了SPI 的添加使金線魚肌球蛋白三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進而影響氨基酸殘基的微環(huán)境。

圖4 不同添加量的SPI 對金線魚肌球蛋白內(nèi)源熒光強度的影響Fig.4 Effect of different addition of SPI on the intrinsic fluorescence intensity of Nemipterus virgatus myosin

2.5 SPI 添加量對金線魚肌球蛋白凝膠強度的影響

由圖5 可知，在8%的SPI 添加量范圍內(nèi)，金線魚肌球蛋白凝膠強度隨著SPI 添加量的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，添加4% SPI 組樣品的凝膠強度最高（1255.253 g·mm），與對照組（1155.161 g·mm）相比，凝膠強度增加了8.66%。表明適量的SPI 能顯著提高金線魚肌球蛋白凝膠強度，原因可能是SPI 的填充效應使金線魚肌球蛋白凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加緊密[29]，而過多的SPI 對金線魚肌球蛋白的稀釋效應或添加過量的SPI 可能會阻礙金線魚肌球蛋白的交聯(lián)導致混合蛋白整體的凝膠性下降[14]。鄧立青等[30]研究發(fā)現(xiàn)添加3%的SPI 時銅盤魚魚糜的凝膠強度最好、崔旭海等[12]研究發(fā)現(xiàn)添加適量的外源性蛋白可以提高鯉魚魚糜的凝膠強度，和本文的研究結(jié)果相似。此外，凝膠強度的變化趨勢和圖2 總巰基含量的變化趨勢一致，證實了巰基氧化形成二硫鍵有利于凝膠特性的改善。

圖5 不同添加量SPI 對金線魚肌球蛋白凝膠強度的影響Fig.5 Effect of different addition of SPI on gel strength of Nemipterus virgatus myosin

2.6 SPI 添加量對金線魚肌球蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

如表1 所示，0%～4%的SPI 添加量范圍內(nèi)，金線魚肌球蛋白凝膠的硬度隨著SPI 添加量的增加而逐漸上升，4% SPI 添加量時硬度達到最大值569.70 g，之后逐漸下降。與對照組相比，彈性、粘聚性、膠著度、咀嚼度和回復性都呈現(xiàn)出先上升后下降最后略微上升的趨勢，于4% SPI 添加量時達到最大值。4% SPI 添加量之前，質(zhì)構(gòu)特性改善的原因可能是SPI 對金線魚肌球蛋白凝膠網(wǎng)絡的填充作用[29]和其本身作為內(nèi)源酶抑制劑能夠抑制霉變、改善質(zhì)構(gòu)的作用[11]；4% SPI 添加量之后，質(zhì)構(gòu)特性下降的原因可能是過量SPI 的添加對金線魚肌球蛋白產(chǎn)生了較強的稀釋作用、阻礙了金線魚肌球蛋白的交聯(lián)[14]，而8% SPI 添加量時金線魚肌球蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性又略微得到改善的原因可能是過量的SPI 對水分的吸收和加熱后形成的SPI 聚集體對金線魚肌球蛋白凝膠基質(zhì)的強化效應大于SPI 對金線魚肌球蛋白的稀釋作用。綜上，SPI 添加量為4%時，金線魚肌球蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性最好，與凝膠強度的結(jié)果一致。

表1 不同添加量SPI 對金線魚肌球蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 1 Effect of different addition of SPI on the texture properties of Nemipterus virgatus myosin gel

2.7 SPI 添加量對金線魚肌球蛋白動態(tài)流變學性質(zhì)的影響

儲能模量（G'）表示樣品的彈性趨勢，損耗模量（G''）表示樣品的粘性趨勢。如圖6 所示，對照組的G'在38.65 ℃時達到峰值323.952 Pa，表明金線魚肌球蛋白頭部變性形成彈性凝膠網(wǎng)絡，50.90 ℃之后隨著溫度的升高G'緩慢增加，添加SPI 組樣品的G'變化趨勢與對照組基本一致。G''與G'的變化趨勢相似，加熱過程中，G'值大于G''值，表明金線魚肌球蛋白形成了彈性凝膠[31]。隨著SPI 添加量的增加，G'值與G''值都呈先增加后減少最后增加的趨勢，且都高于對照組，這可能是由于加熱增強了SPI 與金線魚肌球蛋白的變性和交聯(lián)，形成了高彈性的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[32]。0%～4%的SPI 的添加能結(jié)合自由水，填充金線魚肌球蛋白凝膠網(wǎng)絡，從而強化了金線魚肌球蛋白凝膠基質(zhì)，使蛋白分子間的相互作用增強；4%添加量之后，G'值與G''值下降的原因可能是過量SPI 的添加阻礙了金線魚肌球蛋白的交聯(lián)[14]，而8% SPI 添加量時金線魚肌球蛋白的G'與G''值再次上升的原因可能是過量的SPI 加熱后本身所具有的粘彈性對金線魚肌球蛋白凝膠基質(zhì)的強化作用大于SPI 對金線魚肌球蛋白的稀釋作用。綜上，添加4%SPI 組樣品的G'值與G''值最大，表明添加4%SPI 時金線魚肌球蛋白凝膠的粘彈性最好，此結(jié)果和凝膠強度、質(zhì)構(gòu)特性的結(jié)果一致。

圖6 不同添加量SPI 對金線魚肌球蛋白儲能模量（G'）和損耗模量（G''）的影響Fig.6 Effect of different addition of SPI on the storage modulus (G') and loss modulus (G'') of Nemipterus virgatus myosin

2.8 SPI 添加量對金線魚肌球蛋白凝膠化學作用力的影響

由圖7 可知，疏水相互作用是維持蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的主要作用力，離子鍵占比最小。蛋白質(zhì)受熱變性，離子鍵斷裂、疏水基團暴露，相鄰蛋白分子之間疏水部分的結(jié)合可以降低凝膠體系熵值，促進蛋白間相互作用，從而增強凝膠強度[17]。氫鍵主要維持蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，它是轉(zhuǎn)變β-折疊的主要驅(qū)動力[33]。隨著SPI 添加量的增加，疏水相互作用呈現(xiàn)出先下降后上升再下將最后上升的趨勢，氫鍵含量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，離子鍵含量呈現(xiàn)出先減少后略微增大的趨勢。添加SPI 后離子鍵含量減小可能是由于SPI 阻止了蛋白質(zhì)之間和金線魚肌球蛋白內(nèi)部離子鍵的形成，使金線魚肌球蛋白分散，當加入過多的SPI 時，pH 值的差異可能會改變氨基酸的電荷分布位點，導致離子鍵略有增加[34-35]；氫鍵含量增加可能是由于添加的SPI 與自由水結(jié)合，導致總體蛋白與水分子間的作用增強，氫鍵增加，而3% SPI 添加量之后氫鍵又減少可能是由于過量的SPI 與金線魚肌球蛋白競爭水分子，使蛋白質(zhì)與水分子間的作用減弱，氫鍵減少[36]；添加2%和6% SPI 時疏水相互作用下降可能是由于SPI 吸水后粘度變大，限制了部分蛋白質(zhì)分子的伸展和分子內(nèi)部疏水基團的暴露以及6%時過量的SPI 對暴露出來的疏水基團的再次埋藏作用，3%～4%適量的SPI 的添加促進了金線魚肌球蛋白分子內(nèi)部疏水基團的暴露，和巰基變化規(guī)律相似，而8%較多過量的SPI 添加由于SPI 自身可形成凝膠網(wǎng)絡，可顯著增加疏水相互作用[35]。在0%～8%的SPI 添加量范圍內(nèi)，3% SPI 添加量時氫鍵值最大、離子鍵值最小，4% SPI 添加量時疏水相互作用值最大，表明3%～4%的SPI 添加量范圍內(nèi)金線魚肌球蛋白凝膠的化學作用力最有利于蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定，從而利于金線魚肌球蛋白凝膠特性的改善，與前面的試驗結(jié)果一致。

圖7 不同添加量SPI 對金線魚肌球蛋白凝膠化學作用力的影響Fig.7 Effect of different addition of SPI on chemical forces of Nemipterus virgatus myosin gel

2.9 SPI 添加量對金線魚肌球蛋白凝膠分子構(gòu)象的影響

紅外光譜圖中酰胺A 振動波段（3500～3250 cm-1）與O-H 振動伸縮有關，其吸收峰的變化主要受氫鍵的影響；酰胺Ⅰ帶（1600～1700 cm-1）常與酰胺Ⅲ帶（1220～1330 cm-1）結(jié)合分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[37]。由圖8 可知，在3290 cm-1附近有一個較為明顯的吸收峰，這是由蛋白質(zhì)羥基和 N-H 的伸縮振動引起的[38]，添加0%、2%、3%、4%、6%、8% SPI 時該峰的波數(shù)分別為3293.453、3292.488、3291.524、3291.524、3290.560 和3291.524 cm-1。與對照組相比，隨著SPI 添加量的增加，實驗組該峰值對應的波數(shù)發(fā)生不同程度的降低，表明混合凝膠中氫鍵增強，與圖7 結(jié)果一致，而增強的氫鍵是混合蛋白凝膠強度增加的原因之一。添加SPI 前后的峰位和峰形基本相同，說明添加SPI 沒有改變金線魚肌球蛋白的功能性基團，也沒有新的功能性基團生成[17]。

圖8 不同SPI 含量的金線魚肌球蛋白凝膠的傅里葉紅外光譜圖Fig.8 FT-IR spectra of Nemipterus virgatus myosin gel with different contents of SPI

對酰胺Ⅲ帶進行傅里葉去卷積、高斯擬合和二階求導處理，得到的凝膠二級結(jié)構(gòu)含量的變化如圖9 所示。由圖9 可知，各組樣品的二級結(jié)構(gòu)均是以β-折疊或β-轉(zhuǎn)角為主。與對照組相比，添加SPI后金線魚肌球蛋白凝膠的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量減少，同時伴隨著β-折疊和無規(guī)則卷曲含量的增加；添加3% SPI 時β-折疊含量最高，添加4% SPI 時α-螺旋含量最低。這一結(jié)果表明，在蛋白質(zhì)凝膠形成過程中會發(fā)生蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化，α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-折疊、無規(guī)則卷曲，而SPI 的添加會增加金線魚肌球蛋白凝膠β-折疊的含量、降低α-螺旋的含量。在0%～8%的SPI 添加量范圍內(nèi)，3%～4%的SPI 添加量更有利于α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)化，促進形成結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、質(zhì)構(gòu)特性更好的凝膠[39]。

圖9 不同添加量SPI 對金線魚肌球蛋白凝膠二級結(jié)構(gòu)含量的影響Fig.9 Effect of different addition of SPI on secondary structure content of Nemipterus virgatus myosin gel

2.10 SPI 添加量對金線魚肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

金線魚肌球蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)與其凝膠特性密切相關。如圖10 所示，對照組凝膠有大而不規(guī)則的孔洞且表面粗糙。0～4%的添加量范圍內(nèi)，隨著SPI 添加量的增加，凝膠表面孔洞減少且變得光滑、結(jié)構(gòu)更加致密；4%～8%的添加量范圍內(nèi)隨著SPI 添加量的增加，凝膠表面再次變得粗糙，孔洞增加但孔徑較小。金線魚肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的改變可能與SPI 對其凝膠網(wǎng)絡的修飾有關，適量的SPI 會填充在金線魚肌球蛋白網(wǎng)絡中，誘導蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的巰基和疏水性基團，并在加熱后α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-折疊，最終導致凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)更加致密均勻，而過量的SPI 會黏附在金線魚肌球蛋白凝膠網(wǎng)絡上，形成厚的絲和孔，阻礙金線魚肌球蛋白的交聯(lián)。添加4% SPI 時，金線魚肌球蛋白凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)最致密均勻，且表面平整，這與凝膠強度、質(zhì)構(gòu)特性、總巰基、化學作用力和流變特性的試驗結(jié)果一致。Lin 等[14]研究發(fā)現(xiàn)將14%（w/w）的植物蛋白混合物加入肌原纖維蛋白中，形成的混合蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)更加致密均勻，與本文的結(jié)果相似。

圖10 不同添加量SPI 對金線魚肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響 (3000×)Fig.10 Effects of different addition of SPI on the microstructure of Nemipterus virgatus myosin gel (3000×)

3 結(jié)論

本研究分析了未加熱條件下SPI 和金線魚肌球蛋白混合體系中的相互作用對金線魚肌球蛋白凝膠特性的影響。結(jié)果表明，向金線魚肌球蛋白溶液中添加SPI，疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵等非共價相互作用和共價相互作用發(fā)生改變，影響了蛋白的變性，最終改變了金線魚肌球蛋白的凝膠特性。0～8%的SPI 添加量范圍內(nèi)，當SPI 的添加量為4%時，SPI 與金線魚肌球蛋白的相互作用最強，混合凝膠具有最佳的凝膠特性和致密均勻的微觀結(jié)構(gòu)。因此，適量的SPI 能有效誘導金線魚肌球蛋白與SPI 間的相互作用，促進蛋白分子間的交聯(lián)、聚集，形成致密均勻的凝膠微觀結(jié)構(gòu)，從而改善金線魚肌球蛋白凝膠特性，為高品質(zhì)魚糜制品的生產(chǎn)提供參考依據(jù)。本研究僅從理化特性、光譜特性、流變特性和凝膠特性方面研究了未加熱條件下SPI 與金線魚肌球蛋白的相互作用對其凝膠特性的影響，而關于不同加熱溫度、加熱方式、加熱前蛋白聚集程度對蛋白凝膠特性的影響以及分子水平上二者相互作用的機制有待進一步研究。