不同脫蛋白方法對青錢柳多糖的結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的影響

何思辰，陳凌利，陳 慧，嚴(yán) 謹(jǐn)，王文君

（江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330045）

青錢柳（Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinskaja）系雙子葉植物胡桃科青錢柳屬植物，為我國獨(dú)有的單種屬植物[1]，食用歷史悠久（食用部位為青錢柳葉，食用方式為沖泡）[2]。已有多項(xiàng)研究表明，青錢柳多糖具有降血糖[3]、抗氧化[4]、提高免疫力[5]及抗炎[6]等生物活性。

多糖的提取多采用水提的方式，提取物中蛋白質(zhì)的存在會干擾后續(xù)多糖的結(jié)構(gòu)和活性的分析[7]，因而脫除蛋白對于多糖的純化必不可少。常用的多糖脫除蛋白的方法有Sevage 法、酶法、HCl 法、trichloroacetic acid （TCA）法和NaCl 法。其中Sevage法雖條件溫和但其操作繁瑣且試劑（氯仿）對環(huán)境有害[8]；酶法需要對酶的種類、比例及反應(yīng)條件進(jìn)行摸索，應(yīng)用較為困難[9]；HCl 法通過調(diào)節(jié)溶液pH 使其達(dá)到蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)沉降蛋白；TCA 法根據(jù)蛋白質(zhì)在有機(jī)酸的作用下形成不可逆的沉淀除去蛋白；NaCl 法以增加溶液中的鹽濃度而使蛋白質(zhì)鹽析沉淀，這三種方法操作相對簡單且對環(huán)境的危害較小。并且已有不少文獻(xiàn)報(bào)道脫除蛋白質(zhì)的方式會對多糖的結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生影響[10-11]。Zeng 等[10]采用中性蛋白酶法、TCA 法和CaCl2法處理靈芝多糖發(fā)現(xiàn)，TCA 法具有較好的蛋白質(zhì)脫除效率，而酶法處理后多糖具有更佳的抗氧化活性。Mohammed 等[11]比較了四種方法（HCl 法、TCA 法、NaCl 法和CaCl2法）對阿爾貢棕櫚果實(shí)多糖結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明四種方法處理后多糖具有相似的官能團(tuán)但各官能團(tuán)的紅外吸收峰強(qiáng)度不同，HCl 法處理后多糖的表面粗糙、不規(guī)則具有孔隙結(jié)構(gòu)，TCA 法處理后多糖表面粗糙具有紡錘形分支，NaCl 法和CaCl2法處理后多糖外觀呈片狀或碎屑狀。

目前，關(guān)于青錢柳多糖（Cyclocarya paliuruspolysaccharides, CPP）的研究中常用的脫除蛋白質(zhì)的方法為Sevage 法[3-6]，而對于青錢柳多糖脫除蛋白方法的研究較少。僅有謝建華[12]考察了Sevage 法在振搖次數(shù)為六次、HCl 法在pH3、TCA 法在10% TCA調(diào)節(jié)溶液pH3、Sevage 法聯(lián)用酶法在木瓜蛋白酶或胰蛋白酶處理后再用Sevage 法振搖三次的處理情況下，多糖溶液中多糖保留率和蛋白脫除率的變化，但卻沒有比較四種方法在不同處理?xiàng)l件下（如振搖次數(shù)、pH 高低、TCA 濃度、酶反應(yīng)條件等）脫除蛋白質(zhì)的效果。因此，本研究采用三種方法（HCl 法、TCA 法和NaCl 法）對青錢柳多糖進(jìn)行處理，從蛋白脫除率和多糖保留率的角度對三種方法脫除蛋白效率進(jìn)行了評價(jià)，同時(shí)考察了經(jīng)不同除蛋白方式脫除蛋白后所得到的多糖在結(jié)構(gòu)和抗氧化活性方面的差異，以期為后續(xù)青錢柳多糖的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青錢柳葉 于2021 年9 月采摘自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)園；石油醚、水楊酸 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙醇、濃鹽酸、氯化鈉、苯酚、濃硫酸、硫酸亞鐵 分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；三氯乙酸 分析純，阿拉?。ㄉ虾＃┰噭┯邢薰荆黄咸烟?超級純，阿拉?。ㄉ虾＃┰噭┯邢薰荆慌Ｑ灏椎鞍?、考馬斯亮藍(lán)、DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical） 、 ABTS（ 2,2'-Azinobis-（ 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）） 北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫 分析純，天津玉福泰化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸 分析純，美國ACROS 公司；醋酸鈉優(yōu)級純，美國ThermoFishe 公司；50%氫氧化鈉溶液 優(yōu)級純，美國Alfa Aesar 公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸） 分析純，深圳市博睿糖生物技術(shù)有限公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（5000、11600、23800、48600、80900、148000、273000、4098000、667800）美國Sigma 公司。

V-5600 紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；101-1BS 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、UGC-24M 氮吹儀 上海力辰邦西儀器科技有限公司；LC-10A 高效液相色譜儀、RI-10A 示差檢測器 日本島津公司；ICS5000 離子色譜儀 美國ThermoFisher 公司；BRT 105-104-102 色譜柱串聯(lián)BRT105-104-102（8 mm×300 mm）凝膠柱 深圳市博睿糖生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青錢柳多糖的制備 根據(jù)Zhao 等[13]的方法略作修改提取。將新鮮的青錢柳葉烘干，粉碎過60 目篩，置于聚乙烯袋中避光干燥保存待用。稱取500 g青錢柳粉末，加入石油醚浸泡過夜除去脂質(zhì)等物質(zhì)，于80 ℃，料液比1:15，水浴2 h，取上清液，將濾渣重復(fù)上述操作2 次，合并上清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于55 ℃減壓濃縮至原體積的1/10。向濃縮液中加入95%的乙醇溶液（1:4，V/V），于4 ℃冰箱中放置過夜，以4000 r/min 離心，收集沉淀復(fù)溶后減壓濃縮，冷凍干燥得到青錢柳粗多糖樣品。準(zhǔn)確稱取青錢柳粗多糖粉末5 g 加蒸餾水定容至500 mL 容量瓶中，配制青錢柳多糖溶液（10 mg/mL）。

1.2.2 TCA 法脫除蛋白 根據(jù)Zeng 等[10]的方法，取青錢柳多糖溶液（10 mg/mL）20 mL 五份，向其中加入三氯乙酸，使其終濃度分別為0.5%、1%、2%、4%、8%，溶液混合均勻后于4 ℃冰箱中放置過夜，以4000 r/min 離心10 min，取上清液測定多糖的保留率和蛋白質(zhì)的脫除率。

1.2.3 HCl 法脫除蛋白 根據(jù)Mohammed 等[11]的方法，取青錢柳多糖溶液（10 mg/mL）20 mL 五份，向其中滴加2 mol/L 鹽酸溶液分別調(diào)節(jié)pH 至1、2、3、4、5，將溶液混合均勻后放置12 h，4000 r/min 離心10 min，取上清液測定多糖的保留率和蛋白質(zhì)的脫除率。

1.2.4 NaCl 法脫除蛋白 根據(jù)Cheng 等[14]的方法略作修改，取青錢柳多糖溶液（10 mg/mL）20 mL 五份，向其中加入2% NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至9，后加入NaCl 使其濃度為3、5、7、9、11%（W/V）煮沸30 min，冷卻，以4000 r/min 離心10 min，取上清液測定多糖的保留率和蛋白質(zhì)的脫除率。

1.2.5 多糖含量和蛋白含量的測定 多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[15]，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制回歸方程，測定其在490 nm 處的吸光度值再通過換算因子進(jìn)行計(jì)算。蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[16]，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制回歸方程，測定其在595 nm 處的吸光度值再通過換算因子進(jìn)行計(jì)算。

多糖的保留率和蛋白質(zhì)脫除率分別按照下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：A0和A1分別為除蛋白前后采用苯酚硫酸法測定的溶液在490 nm 處的吸光度值；B0和B1分別為除蛋白前后采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定的溶液在595 nm 處的吸光度值；A水和B水為水的吸光度值。

1.2.6 脫除蛋白后多糖的制備

1.2.6.1 綜合評分 通過計(jì)算多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率的均值[17]，綜合評價(jià)不同條件下三種脫蛋白方法的效果，分別選擇HCl 法pH2；TCA 法TCA 質(zhì)量濃度為2%；NaCl 法 NaCl 質(zhì)量濃度為7%的處理?xiàng)l件進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.6.2 HCl 法脫蛋白處理后多糖的制備 向上述HCl 法（pH2）處理后的多糖溶液中滴加2 mol/L 的NaOH 溶液，調(diào)節(jié)pH 至7，蒸餾水透析24 h 期間多次換水（透析袋截留分子量為3500 Da），將透析液冷凍干燥得到HCl 法脫蛋白后的青錢柳多糖樣品。

1.2.6.3 TCA 法脫蛋白處理后多糖的制備 向上述TCA 法（TCA 質(zhì)量濃度為2%）處理后的多糖溶液中滴加2 mol/L 的NaOH 溶液，調(diào)節(jié)pH 至7，蒸餾水透析24 h 期間多次換水（透析袋截留分子量為3500 Da），將透析液冷凍干燥得到TCA 法脫蛋白后的青錢柳多糖樣品。

1.2.6.4 NaCl 法脫蛋白處理后多糖的制備 向上述NaCl 法（NaCl 質(zhì)量濃度為7%）處理后的多糖溶液中滴加1 mol/L 的HCl 溶液，調(diào)節(jié)pH 至7，蒸餾水透析24 h 期間多次換水（透析袋截留分子量為3500 Da），將透析液冷凍干燥得到NaCl 法脫蛋白后的青錢柳多糖樣品。

1.2.7 不同除蛋白方法對青錢柳多糖結(jié)構(gòu)的影響

1.2.7.1 分子量測定 參照Zhang 等[18]的方法，采用高效液相凝膠色譜法測定三種青錢柳多糖的分子量分布。稱取三種脫除蛋白方式得到的多糖樣品，配制成5 mg/mL 溶液，12000 r/min 離心10 min，取上清過0.22 μm 濾膜，采用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，色譜柱為BRT105-104-102 串聯(lián)凝膠柱（8 mm×300 mm），以0.05 mol/L NaCl 溶液作為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測器為RI-10A 示差檢測器。

1.2.7.2 單糖組成測定 參考錢朋志等[19]的方法略作修改，采用離子色譜法測定三種青錢柳多糖的單糖組成。精密稱取5 mg 三種多糖樣品置于安瓿瓶中，加入3 mol/L TFA 2 mL，120 ℃水解3 h，吸取酸水解溶液轉(zhuǎn)移至管中氮吹吹干，加入5 mL 水，渦旋混勻，吸取50 μL 混合液加入950 μL 去離子水，12000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行離子色譜檢測。色譜柱為Dionex CarbopacTMPA20（3 mm×150 mm），流動(dòng)相為A：H2O；B：15 mmol/L NaOH；C：15 mmol/L NaOH &100 mmol/L NaAc；流速為0.3 mL/min 進(jìn)樣量為5 μL，檢測器為電化學(xué)檢測器。

1.2.7.3 傅里葉紅外光譜的測定 參考Wang 等[20]的方法，將三種多糖樣品與KBr 粉末烘干至恒重，按100:1 壓片后，掃描波數(shù)400～4000 cm-1，記錄光譜圖。

1.2.8 不同除蛋白方法對青錢柳多糖的體外抗氧化活性影響

1.2.8.1 DPPH 自由基清除能力測定 DPPH 自由基清除能力的測定參考Chen 等[21]的方法略作修改。向0.5 mL 的三種青錢柳多糖溶液（0～0.1 mg/mL）中加入0.2 mmol/L 的DPPH-無水乙醇溶液0.5 mL 渦旋混勻后，暗反應(yīng)30 min，于517 nm 處測定吸光度值，以無水乙醇作為空白對照，抗壞血酸作為陽性對照，每個(gè)處理重復(fù)三次試驗(yàn)。DPPH 自由基清除率計(jì)算如公式所示：

式中：A0為去離子水替代多糖溶液的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；A2為無水乙醇替代DPPH-無水乙醇溶液的吸光度。

1.2.8.2 ABTS+自由基清除能力測定 ABTS+自由基清除能力的測定參考Wang 等[22]的方法略作修改。以2.45 mmol/L K2S2O4溶液為溶劑配制7 mmol/L的ABTS 溶液，避光靜置16 h，去離子水稀釋混合液使其在734 nm 處吸光度值至0.70±0.01。向200 μL多糖溶液（0～0.1 mg/mL）加入800 μL 稀釋后的ABTS 溶液渦旋混勻后，反應(yīng)10 min，于734 nm 處測定吸光度值，以去離子水作為空白對照，抗壞血酸作為陽性對照，每個(gè)處理重復(fù)三次試驗(yàn)。ABTS+自由基清除率計(jì)算如公式所示：

式中：A0為去離子水替代多糖溶液的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；A2為去離子水替代ABTS溶液的吸光度。

1.2.8.3 羥基自由基清除能力測定 羥基自由基清除能力的測定參考Chen 等[23]的方法略作修改。向0.4 mL 的三種青錢柳多糖溶液（0～1 mg/mL）中快速加入0.4 mL 9×10-3mol/L 的FeSO4溶液和0.4 mL9×10-3mol/L 的水楊酸-乙醇溶液（醇濃度為70%），最后再加入0.4 mL 9×10-3mol/L 的H2O2溶液，渦旋混勻后，反應(yīng)30 min，于510 nm 處測定吸光度值，以去離子水作為空白對照，抗壞血酸作為陽性對照，每個(gè)處理重復(fù)三次試驗(yàn)。羥基自由基清除率計(jì)算如公式所示：

式中：A0為去離子水替代多糖溶液的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；A2為去離子水替代H2O2溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistic 20.0 進(jìn)行處理，圖形采用Origin 2021 進(jìn)行繪制，所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性分析采用ANOVA法，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同除蛋白方法的效果比較

三種常見的脫蛋白方法脫除效果可見圖1。

圖1 溶液pH、TCA 濃度、NaCl 濃度對脫除蛋白效率和多糖保留率的影響Fig.1 Effects of solution pH, TCA dosage and NaCl dosage on deproteinization efficiency and polysaccharide residue rate

圖1A 為HCl 法中不同pH 對多糖溶液的蛋白脫除率和多糖保留率的影響。從中可看出隨著pH 的不斷增大，蛋白脫除率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在pH 為2 時(shí)達(dá)到最高，為73.48%，多糖保留率隨pH 的增大呈現(xiàn)上升趨勢，表明強(qiáng)酸性環(huán)境可能會導(dǎo)致多糖的降解，其原因可能為酸性溶液能引起多糖中糖苷鍵的斷裂，使多糖降解為低分子片段[24]。

圖1B 為TCA 濃度對多糖溶液的蛋白脫除率和多糖保留率的影響?？梢杂^察到隨著TCA 溶液體積分?jǐn)?shù)的增大，蛋白脫除率上升并在質(zhì)量濃度為2%時(shí)達(dá)到最高值79.88%，后隨著TCA 質(zhì)量濃度的增加而略微下降，多糖保留率隨TCA 質(zhì)量濃度的增大而明顯降低。這一現(xiàn)象可能是由于兩方面的原因?qū)е拢浩湟唬?dāng)溶液pH 小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，TCA 與蛋白質(zhì)形成了不溶性鹽[25]，并且TCA 使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水性基團(tuán)而聚集沉淀；其二，形成的不溶性聚合物吸附了部分多糖從而造成了多糖的損失[17]，并且高濃度的TCA 會對青錢柳多糖造成降解，同時(shí)在一定程度上發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化[26-27]。

圖1C 為NaCl 濃度對多糖溶液的蛋白脫除率和多糖保留率的影響。由圖可知蛋白脫除率與NaCl質(zhì)量濃度成正相關(guān)，而多糖保留率與之成負(fù)相關(guān)。這可能是加入的鹽溶液破壞了蛋白質(zhì)的水化膜，使其溶解度降低并形成沉淀[28-29]，同時(shí)沉淀的蛋白質(zhì)又吸附了少量的多糖導(dǎo)致多糖的損失。通過計(jì)算綜合評分，選擇NaCl 質(zhì)量濃度為7%的處理進(jìn)行后續(xù)的研究。

圖1D 是在三種方法最優(yōu)的條件下獲得的數(shù)據(jù)比較（計(jì)算方法為多糖保留率和蛋白脫除率的均值），其中HCl 法在pH 為2 時(shí)，蛋白脫除率為73.48%，多糖保留率為74.86%；TCA 法在TCA 質(zhì)量濃度為2%時(shí)，蛋白脫除率為79.88%，多糖保留率為81.78%；NaCl 法在NaCl 質(zhì)量濃度為7%時(shí)，蛋白脫除率為47.90%，多糖保留率為82.51%?？梢院苊黠@地看出NaCl 法對青錢柳多糖中的蛋白質(zhì)清除效果最不理想；TCA 法和HCl 法的清除效果較好，在最優(yōu)條件下分別為79.88%和73.48%，三種方法在其最優(yōu)條件下對溶液中的多糖都具有較高的保留率。綜上所述，在TCA 法（TCA 質(zhì)量濃度為2%）處理后，青錢柳多糖的多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率都較為理想。

2.2 不同除蛋白方法對青錢柳多糖結(jié)構(gòu)的影響

由于不同除蛋白方法作用于青錢柳多糖的原理不同，所以效果不同，對于青錢柳多糖的結(jié)構(gòu)的影響也可能差異不同，因此，選取了在三種方法的最優(yōu)條件下得到的三種青錢柳多糖，進(jìn)一步對其進(jìn)行了多糖分子量分布、單糖組成和紅外光譜官能團(tuán)的測定。

2.2.1 不同除蛋白方法對青錢柳多糖分子量分布的影響 對三種除蛋白方法處理后的青錢柳多糖的分子量分布進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖2 所示，從高效液相凝膠色譜圖可以看到，三種方法得到的多糖有相似的洗脫出峰時(shí)間，說明得到的多糖分子量分布類似，大體可分為三個(gè)部分（具體分子量分布見表1）。三者相比，NaCl 法處理后多糖在30～40 kDa 所占比例較高，TCA 法在100～130 kDa 所占比例較高。可以看出三種除蛋白的方法均能脫除多糖中的蛋白，但因原理不同，其對不同分子量組分的青錢柳多糖的影響不同。從表中可以很明顯看出，TCA 方法處理過后的CPP在730 kDa 左右發(fā)生了降解，使其500 kDa 和130 kDa左右的多糖含量增加，同時(shí)在較小分子量即40 kDa左右的組分也同樣發(fā)生了降解，與另外兩種方法相比出現(xiàn)了6 kDa 左右的組分，其可能是因?yàn)門CA 溶液對于多糖具有降解作用使得多糖的分子質(zhì)量偏小，結(jié)果與薛麗潔等[30]的研究相似。HCl方法與NaCl 方法處理后的多糖分子量分布類似，但NaCl 法得到的CPP 在分子量為100～130 kDa 左右的組分含量降低，而在分子量為30～40 kDa 左右的組分增加，這可能是由于堿性環(huán)境破壞了多糖的結(jié)構(gòu)使其發(fā)生降解所致[31]，Zeng 等[10]的研究中也出現(xiàn)類似結(jié)果。

表1 可溶性多糖各組分分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of soluble polysaccharide fractions

圖2 三種方法除蛋白后青錢柳多糖的分子量分布高效液相色譜圖Fig.2 HPCL chromatogram of molecular weight distribution of Cyclocarya paliurus polysaccharides deproteinized by HCl,TCA and NaCl

2.2.2 不同除蛋白方法對青錢柳多糖單糖組成的影響 采用離子色譜法對三種青錢柳多糖的單糖組成進(jìn)行了測定，離子色譜圖如圖3 所示，具體的三種多糖的單糖組成分布見表2。

表2 三種青錢柳多糖的單糖組成（%）Table 2 Monosaccharide composition of the three Cyclocarya paliurus polysaccharides (%)

圖3 三種方法除蛋白后青錢柳多糖的單糖組成離子色譜圖Fig.3 Ion chromatogram of Cyclocarya paliurus polysaccharides deproteinized by HCl, TCA and NaCl

由單糖組成的結(jié)果可以看出，三種青錢柳多糖均由8 種單糖組成，分別為半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸，且以半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖為主，但其摩爾比不相同，結(jié)果與之前報(bào)道過的青錢柳多糖的單糖組成相似[32-34]。其中HCl 法處理后多糖中阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖的含量最大，TCA 法處理后多糖中糖醛酸的含量更高，NaCl 法處理后多糖中的鼠李糖、木糖和甘露糖的含量最大。不同的單糖具有不同的生理功能[35]，三種方法處理后的多糖在單糖含量上的差異會使其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。另一方面，不同除蛋白方法得到的CPP 的單糖組成相同但其比例不同，其主要原因可能是多糖分子在強(qiáng)酸堿條件下被部分降解并且分子間的氫鍵被破壞，進(jìn)而引起單糖組成比例改變[36]。單糖組成結(jié)果與三種多糖的不同分子量分布結(jié)果相吻合。

2.2.3 三種青錢柳多糖的紅外光譜測定結(jié)果 從圖4中可看出三種多糖均在3000～3750 cm-1區(qū)域有一條寬譜帶，且在3416.28 cm-1處均具有較強(qiáng)的吸收峰，通常是由多糖羥基的O-H 伸縮振動(dòng)引起的[37]。此外，2927.90 cm-1處的弱吸收峰是由多糖烷基的CH 伸縮振動(dòng)引起[38]，多糖類物質(zhì)的典型基團(tuán)就是羥基和烷基，此結(jié)果也說明上述三種物質(zhì)均為多糖。在1640.16 cm-1和1323.41 cm-1處的強(qiáng)吸收峰分別是由C=O 和C-H 的彎曲振動(dòng)引起的，表明三種多糖均含有糖醛酸[39]，這與單糖組成結(jié)果相一致。在1000～1200 cm-1處的譜帶顯示了C-O-C 和C-O-H 鍵的存在，這是吡喃糖的特征峰[40]。在772.83 cm-1處的吸收峰是由D-吡喃糖環(huán)對稱伸縮振動(dòng)引起的[41]。其中，TCA 法和HCl 法相比，在上述提到的區(qū)域內(nèi)沒有明顯的吸收峰差異，但與這兩者相比，NaCl 法在1323.41 cm-1和772.83 cm-1處都出現(xiàn)了吸收峰強(qiáng)度的減弱，這表明該法對多糖的D-吡喃糖環(huán)的對稱性結(jié)構(gòu)影響較大，這可能是由于酸堿性環(huán)境對多糖官能團(tuán)產(chǎn)生的影響不同。

圖4 三種青錢柳多糖的傅里葉紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of Cyclocarya paliurus polysaccharides deproteinized by HCl, TCA and NaCl

2.3 三種青錢柳多糖的體外抗氧化活性

多糖的結(jié)構(gòu)與其生理活性密切相關(guān)，三種除蛋白方法處理后的青錢柳多糖結(jié)構(gòu)不同，因此建立了自由基模型對三種青錢柳多糖的抗氧化活性進(jìn)行了探究。由圖5 可知，隨著濃度的增加，三種青錢柳多糖對三種自由基的清除率呈現(xiàn)上升的趨勢，并且同濃度下其抗氧化活性有強(qiáng)弱之分，從強(qiáng)到弱依次為TCA 法、HCl 法、NaCl 法。值得注意的是，三種青錢柳多糖對ABTS+自由基都有較好的清除率，尤其是TCA 法處理后的多糖，其在濃度為100 μg/mL 時(shí)對ABTS+自由基的清除率顯著超過了陽性對照組VC（P＜0.05）。三種青錢柳多糖在抗氧化活性上的差異通常與其結(jié)構(gòu)不同有關(guān)[42]，多糖具有-OH、-COOH等可供氫官能團(tuán)，這些官能團(tuán)可以提供氫離子中和自由基中的未配對電子，實(shí)現(xiàn)自由基的清除[43]。隨著多糖分子量的增加，多糖含有更多的可供氫官能團(tuán)，具有更強(qiáng)的自由基清除能力，但分子量過大會導(dǎo)致分子間纏繞增加，空間障礙增大，官能團(tuán)無法暴露[44]。結(jié)合抗氧化活性與分子量的結(jié)果，三種方法處理后的青錢柳多糖在抗氧化活性上的差異或許與其在100～130 kDa 分子量范圍的多糖比例有關(guān)（TCA 法＞HCl法＞NaCl 法），后續(xù)還需要通過超濾等方法分離各個(gè)分子量片段的多糖，再對其抗氧化能力進(jìn)行評價(jià)加以驗(yàn)證。而從單糖組成的結(jié)果來看，三種青錢柳多糖具有較好的抗氧化活性可能是與阿拉伯糖和半乳糖的含量有關(guān)[45-46]。

圖5 三種青錢柳多糖的抗氧化活性分析Fig.5 Antioxidant activity analysis of Cyclocarya paliurus polysaccharides deproteinized by HCl, TCA and NaCl

3 結(jié)論

本研究采用三種不同的除蛋白方法對青錢柳多糖進(jìn)行處理，同時(shí)對得到的三種多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的分析。結(jié)果表明：三種方法因其除蛋白原理不同對多糖的結(jié)構(gòu)和活性造成的影響也不相同。多糖保留率和蛋白脫除率的結(jié)果表明TCA 法是一種較為理想的青錢柳多糖脫除蛋白的方法，在TCA 體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，蛋白脫除率為79.88%，多糖保留率為81.78%。分子量分布的結(jié)果表明青錢柳多糖主要由三個(gè)部分組成，單一組分還有待進(jìn)一步分離純化。從單糖組成結(jié)果可知青錢柳多糖主要由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖組成，不同方法處理會對其單糖組成比例造成影響。紅外光譜結(jié)果表明三種多糖均為酸性糖，其在1640.16 和1323.41 cm-1處具有C=O 和C-H 彎曲、振動(dòng)引起的強(qiáng)吸收峰，這與單糖組成結(jié)果相一致。抗氧化結(jié)果表明，三種多糖對于自由基（DPPH自由基、ABTS+自由基、OH 自由基）的清除率與其濃度呈正相關(guān)且不同方法對于多糖的抗氧化活性產(chǎn)生不同的影響；值得注意的是，在清除ABTS+自由基的試驗(yàn)中，同等濃度下（100 μg/mL 時(shí)）TCA 法處理后的多糖對自由基的清除能力超過VC。通過評價(jià)不同的除蛋白方法的清除效果及研究其對多糖的結(jié)構(gòu)和抗氧化活性造成的影響，可以從構(gòu)效關(guān)系的角度為挑選青錢柳多糖的分離純化方法和更深一步地開發(fā)利用青錢柳多糖提供一定的理論參考。