兩種工藝提取的白玉菇蛋白理化性能比較

鄭文祺，張 穎，莫海珍，李紅波，周 威 ，劉振彬,

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710021；3.柘城縣雙河辦事處，河南商丘 476200）

白玉菇，又名白色蟹味菇、白色海鮮菇等[1]，是真姬菇的白色品系，野生資源分布于歐洲、北美各國(guó)和日本[2]。上世紀(jì)80 年代，我國(guó)從日本引入此菌種后，經(jīng)過(guò)雜交選育開(kāi)始商品化種植。由于其價(jià)格低廉，市場(chǎng)發(fā)展較快，目前日產(chǎn)量已達(dá)1000 噸[3]。它的蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸種類齊全，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白[4]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外植物蛋白的研究熱度持續(xù)攀升，食用菌資源在各領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用不斷擴(kuò)大，而對(duì)于白玉菇的研究主要集中在多糖的提取分離[5]，干燥特性[6]，酸性酶的性質(zhì)研究[7]，傳統(tǒng)堿法提取[8]，鮮味肽分離純化等方面[3]。蛋白的持水性、溶解性、起泡性、乳化性等理化性與其在食品加工的應(yīng)用場(chǎng)景密切相關(guān)，不同的提取方式會(huì)對(duì)蛋白的提取率和理化性質(zhì)產(chǎn)生一定程度的影響，張艷榮等[9]對(duì)白靈菇蛋白和汪正興等[10]對(duì)核桃粕蛋白的研究結(jié)論也說(shuō)明了這一點(diǎn)，但是不同提取方式對(duì)白玉菇蛋白提取率和理化性能影響方面的探索不多。

本研究以大豆蛋白作為參照物，分析了pH 濃度、離子強(qiáng)度、溫度等對(duì)白玉菇蛋白質(zhì)理化功能特性的影響，該研究對(duì)開(kāi)發(fā)食用菌蛋白資源，提升食用菌產(chǎn)業(yè)附加值有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白玉菇 山東農(nóng)發(fā)菌業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，購(gòu)自陜西省西安市農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng)；牛血清蛋白（96%）、甲基紅指示劑、大豆分離蛋白 上海麥克林生化科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)250 上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉、溴甲酚綠指示劑、硫酸銅 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸（98%）、鹽酸（36%）、磷酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸鉀、碳酸鈉 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品有限公司；95%乙醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；有機(jī)溶劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

JA2003N 分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司；WGL-230B 電熱鼓風(fēng)干燥箱 河北菲斯福儀器有限公司；WGL-230B 高速冷凍離心機(jī) 湖南安君研儀器有限公司；XO-SM100 超聲微波工作站 南京先歐儀器制造有限公司；HJ-4A 多頭磁力加熱攪拌器 常州國(guó)華儀器制造有限公司；LGJ-10E 真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)福瑞科技發(fā)展有限公司；FW-100D 高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津鑫博得儀器有限公司；P901 pH 計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；HHS6L 電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；Vertex-80 傅立葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Bruker 公司；DSC Q2000 差示掃描量熱分析儀、Discovery TGA 熱重分析儀 美國(guó)TA 儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 取適量白玉菇，自然風(fēng)干至恒重，粉碎制粉過(guò)篩，裝入自封袋于干燥器中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 氨基酸組成的測(cè)定實(shí)驗(yàn) 參照GB/T 5009.124-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》法，稱取白玉菇菌粉300 mg，將蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成游離氨基酸，利用氨基酸分析儀對(duì)白玉菇氨基酸組成進(jìn)行分析。數(shù)值統(tǒng)一保留一位小數(shù)。

1.2.3 白玉菇蛋白的提取工藝

1.2.3.1 白玉菇蛋白的傳統(tǒng)堿法提取 參照劉靜等[11]和彭瑋[12]的蛋白提取方法并略作改動(dòng)。預(yù)制不同濃度的堿液，按料液比加入白玉菇粉，1000 r/min 磁力攪拌3 min，依提取時(shí)間水浴后9000 r/min 離心10 min，取上清液測(cè)定蛋白含量，調(diào)pH 至最佳沉淀點(diǎn)后靜置6 h，10000 r/min 離心棄上清，將沉淀進(jìn)行冷凍干燥得到蛋白質(zhì)提取物。

1.2.3.2 白玉菇蛋白的超聲波輔助提取 參照1.2.3.1 的提取步驟，在傳統(tǒng)堿法最優(yōu)提取條件的基礎(chǔ)上，參考林洋[13]超聲輔助黑木耳蛋白提取方法，固定超聲功率500 W，超聲時(shí)間1 h，依次考察超聲功率（200、300、400、500、600 W），超聲時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）兩個(gè)因素對(duì)提取率的影響。

1.2.3.3 白玉菇蛋白提取率的測(cè)定 依照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3926-2014 分別制備500 mL、0.1 mg/mL 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，1 L 的考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液，裝入棕色容量瓶后，放入4 ℃冰箱內(nèi)備用。用移液槍分別吸取0.06、0.12、0.24、0.48、0.72、0.84 mL 的牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液于6 根具塞試管，分別加入蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，接著各加入考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液5 mL ，蓋上塞子，振蕩混勻，室溫下靜置2 min 后于595 nm 測(cè)定吸光值。

以牛血清蛋白含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得回歸方程：y=3.6695x+0.3744，決定系數(shù)R2=0.9985，相關(guān)性較好。

菌粉中粗蛋白含量測(cè)定采用凱氏定氮法（GB/T 15673-2009）；提取液中蛋白含量的測(cè)定采用Bradford（考馬斯亮藍(lán)）法[7]。

1.2.4 白玉菇蛋白的熱重分析 稱取3 mg 樣品，裝入鋁坩堝中，壓樣機(jī)封樣，放入熱重分析儀（TGA）中測(cè)試樣品質(zhì)量發(fā)生變化時(shí)的溫度。以空盒為空白對(duì)照，溫度掃描范圍：0～600 ℃；升溫速率：10 ℃/min；氮?dú)饬魉伲?0 mL/min。

1.2.5 白玉菇蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 分別稱取2.0 mg蛋白樣品、200.0 mg 光譜醇KBr，倒入瑪瑙研缽中，磨至細(xì)粉末狀，取適量樣品，用壓片模具和壓片機(jī)，制成薄片，放入光譜儀中做全波長(zhǎng)掃描。測(cè)試完成后，借助Peakfit 軟件，對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行高斯擬合求二級(jí)結(jié)構(gòu)比例。

1.2.6 白玉菇蛋白溶解性和持水性的測(cè)定 50 mL離心管稱重，加入200 mg 前期提取的白玉菇蛋白，對(duì)應(yīng)所測(cè)影響因素，用移液槍添加10 mL 不同pH（3、5、7、9、11、13）或NaCl 濃度（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）的溶液，靜置15 min，10000 r/min 離心，取上清液，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量，計(jì)算溶解性。用濾紙吸去蛋白沉淀管內(nèi)壁的多余溶液，帶管稱重后計(jì)算持水性。

研究溫度對(duì)這兩種功能特性的影響時(shí)，添加不同溫度（25、35、45、55、65 ℃）的蒸餾水后在不同的溫度梯度下水浴15 min，其余同法操作。

1.2.7 白玉菇蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的測(cè)定 重復(fù)1.2.6 所述步驟至加入蛋白靜置15 min，在轉(zhuǎn)速10000～15000 r/min 區(qū)間內(nèi)從低到高調(diào)整均質(zhì)機(jī)，分三次打發(fā)，每次勻漿10 s，間隔10 s，打發(fā)后測(cè)起泡性，靜置30 min 后測(cè)穩(wěn)定性。

1.2.8 白玉菇蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 參照喬璐[14]的方法，略加修改。加200 mg 前期提取的白玉菇蛋白至50 mL 燒杯中，按1.2.6 中的溶液梯度所對(duì)應(yīng)的pH 強(qiáng)度、NaCl 濃度、溫度等影響因素，先用移液槍分別吸取10 mL 的不同梯度溶液或不同溫度的蒸餾水，接著用移液槍添加10 mL 大豆油，靜置5 min，在轉(zhuǎn)速10000～15000 r/min 區(qū)間內(nèi)從低到高調(diào)整均質(zhì)機(jī)，分三次攪勻，每次勻漿10 s，間隔10 s，形成乳狀液。倒入10 mL 離心管中，測(cè)量液面高度，以1000 r/min 離心10 min，取出后測(cè)量上層乳化層的高度。室溫靜置30 min 后，測(cè)量乳化層的高度。

1.2.9 白玉菇蛋白吸油性的測(cè)定 參照史瑞婕[15]的方法，略加修改。50 mL 離心管稱重，加入200 mg前期提取的白玉菇蛋白，移液槍添加10 mL 大豆油，在不同溫度（25、35、45、55、65 ℃）下水浴15 min，10000 r/min 離心棄油，濾紙吸去管內(nèi)壁的多余油液，帶管稱重后計(jì)算吸油性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)做三個(gè)水平計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差。用Origin 2021 繪圖求熱處理數(shù)據(jù)一階導(dǎo)數(shù)，Ominic、Peakfit進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，SPSS Statistics 25 進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 白玉菇氨基酸組成分析

有研究表明，富硒平菇中門(mén)冬氨酸、精氨酸與酪氨酸氨酸的含量相對(duì)豐富[12]；斑玉蕈品系中總游離氨基酸和必需氨基酸的含量高于杏鮑菇和金針菇[1]。為了研究白玉菇的氨基酸成分，本實(shí)驗(yàn)采用酸性水解氨基酸檢測(cè)法，故表1 中無(wú)色氨酸測(cè)定結(jié)果。國(guó)際參考模式（FAO/WHO）提出，理想蛋白中人體必需氨基酸應(yīng)占40%[16]，由表1 可知，白玉菇氨基酸種類齊全，人體必需氨基酸占氨基酸總量的35.77%，是一種優(yōu)良的食用菌蛋白。依據(jù)氨基酸評(píng)分可知，蛋氨酸為白玉菇蛋白的第一限制氨基酸，這在實(shí)際生產(chǎn)時(shí)可與其他蛋白互補(bǔ)使用，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。異亮氨酸評(píng)分最高，蘇氨酸和纈氨酸次之。蘇氨酸在食品風(fēng)味中，與甜味相關(guān)[17]。異亮氨酸和纈氨酸屬于支鏈氨基酸，主要參與骨骼肌代謝，同骨骼肌的合成關(guān)系密切[18]。還有研究表明，支鏈氨基酸可改善運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體功能，改善運(yùn)動(dòng)性疲勞，提高大鼠的運(yùn)動(dòng)耐力[19]。因此，白玉菇蛋白在食品加工領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用場(chǎng)景。

表1 白玉菇蛋白氨基酸組成及評(píng)價(jià)Table 1 Amino acid composition and evaluation of white Hypsizygus marmoreu protein

2.2 兩種提取工藝對(duì)白玉菇蛋白提取率的影響

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，考慮到生產(chǎn)實(shí)際中大量工業(yè)廢水對(duì)環(huán)境的不利影響，以及時(shí)間成本等原因，最終選定傳統(tǒng)堿法的最適提取工藝為：堿液濃度0.15 mol/L，料液比1:30，在55 ℃下，提取1.5 h。

按傳統(tǒng)堿法優(yōu)化后的最適工藝，在水浴的同時(shí)開(kāi)始超聲輔助，進(jìn)行蛋白提取。重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著超聲功率的加大，蛋白提取率逐漸提高，在500 W 后提取率變化趨于平緩，這可能是超聲功率小時(shí)，超聲波對(duì)細(xì)胞壁發(fā)揮的破碎力度和傳質(zhì)作用不強(qiáng)[20]，蛋白溶出較少。隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)至50 min 后，提取率變化不顯著，這可能是超聲波產(chǎn)生的空化、振動(dòng)、粉碎、攪拌等綜合效應(yīng)促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶出[21]；綜上，最終選定超聲功率為500 W，超聲時(shí)間1 h。按此重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如圖1，超聲輔助下蛋白的提取率由23.4%上升到31.4%，比傳統(tǒng)堿法提高8%。

圖1 不同提取方法對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of different extraction methods on extraction rate

2.3 白玉菇蛋白結(jié)構(gòu)特性性質(zhì)分析

2.3.1 白玉菇蛋白熱學(xué)性質(zhì)分析 食品加工中，蛋白質(zhì)會(huì)隨著加工條件的變化，而發(fā)生性質(zhì)改變，這會(huì)對(duì)功能特性產(chǎn)生一定的影響，故有必要測(cè)定蛋白質(zhì)的變性溫度。從圖2 可知，傳統(tǒng)堿法提取的蛋白熱性能參數(shù)比超聲輔助法提取略高。這可能是因?yàn)閭鹘y(tǒng)堿法提取的蛋白水分含量略高所致[22]。兩種方法提取的蛋白有兩個(gè)失重臺(tái)階（圖2a），第一次發(fā)生分解的溫度在50～100 ℃之間，這可能是由于樣品水分的蒸發(fā)引起。在100～250 ℃之間變化趨于平緩，250 ℃之后開(kāi)始第二次快速分解，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)和多糖等有機(jī)成分開(kāi)始降解[23]。由圖2b 可知，超聲提取蛋白最大失重速率溫度為311.4 ℃，傳統(tǒng)提取蛋白為334.8 ℃。由圖2c 可知，兩種蛋白在60 ℃附近熱流發(fā)生了變化，這可能是蛋白質(zhì)發(fā)生了一定程度的變性或聚集所致[24]。

圖2 不同提取方法的熱力學(xué)特性分析Fig.2 Thermodynamic analysis of different extraction methods

2.3.2 傅里葉紅外光譜分析 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本類型包括α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲等，它與其功能性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有一定關(guān)系[25]。酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶的伸縮振動(dòng)在紅外光譜圖譜上表現(xiàn)為特征性的吸收峰，故可通過(guò)紅外吸收光譜對(duì)部分蛋白結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行研究[26]。

如圖3a，兩種提取方法的蛋白在1200～1300 cm-1處酰胺Ⅲ帶的區(qū)別，說(shuō)明超聲輔助提取使蛋白內(nèi)部氫鍵的結(jié)合發(fā)生了巨大變化[27]，引起1500～1700 cm-1處的酰胺Ⅰ帶和Ⅱ帶的N-H 出現(xiàn)彎曲振動(dòng)，傳統(tǒng)堿法使C=O 和C-N（肽鍵）發(fā)生伸縮振動(dòng)[28]。對(duì)比兩種提取方法在3200～3300 cm-1處二向色性的變化，可知傳統(tǒng)堿法提取蛋白由平行二向色性向垂直二向色性快速過(guò)渡，超聲輔助提取的蛋白過(guò)渡緩慢[29]。如圖3b，兩種提取方法蛋白的α螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲變化明顯。傳統(tǒng)堿法破壞了白玉菇蛋白質(zhì)分子中的氫鍵[30]，分子間的靜電斥力增加，使α螺旋結(jié)構(gòu)減少，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)大量增加，超聲輔助對(duì)這兩個(gè)參數(shù)的影響則與此相反。β折疊不如α螺旋的變化明顯，可能是因?yàn)榈鞍滋崛r(shí)溶液中的粘度起了作用[31]。顯然，兩種提取方法對(duì)β轉(zhuǎn)角的影響不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同提取方法的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig.3 Comparison of secondary structures by different extraction methods

2.4 白玉菇蛋白的理化特性分析

大豆分離蛋白屬于全價(jià)蛋白[32]，營(yíng)養(yǎng)豐富，研究課題多樣化且深入，食品加工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。本研究選其作為參照標(biāo)準(zhǔn)，將兩種工藝提取的白玉菇蛋白在理化性質(zhì)上與其作對(duì)比，展開(kāi)分析。

2.4.1 不同pH 對(duì)白玉菇蛋白理化性的影響 從圖4可知，兩種方法提取的白玉菇蛋白和大豆分離蛋白的乳化穩(wěn)定性隨著pH 的改變，變化不顯著（P＞0.05）。相同的pH 對(duì)兩種提取工藝的白玉菇蛋白持水性、乳化穩(wěn)定性影響不顯著。pH 為5 時(shí)，處在白玉菇蛋白的等電點(diǎn)附近，因此除了它的穩(wěn)定特性之外，其余理化性均在此時(shí)最差。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)后，這些性質(zhì)都得到了明顯改善。

圖4 不同 pH 對(duì)白玉菇蛋白理化性的影響Fig.4 Effect of different pH on protein physicochemical properties of white Hypsizygus marmoreu

蛋白質(zhì)在不同pH 下的溶解性非常重要，它與蛋白質(zhì)的其他功能特性，如乳化性、起泡性等直接相關(guān)[33]。從圖4a 可知，隨著酸性或堿性值變大，兩種方法提取的白玉菇蛋白的溶解性與大豆分離蛋白之間的差距在逐漸縮小。僅當(dāng)pH 為9 時(shí)，兩種提取方法的白玉菇蛋白溶解性差異顯著（P＜0.05），其余梯度值時(shí)二者之間差異不顯著（P＞0.05）。但是，不同提取方法的白玉菇蛋白各自在不同的pH 梯度值之間的溶解性差異顯著（P＜0.05）。

從圖4b 可知，白玉菇蛋白的持水性不如大豆分離蛋白，這可能是由于白玉菇蛋白分子表面的疏水基團(tuán)比大豆分離蛋白多。傳統(tǒng)堿法提取蛋白的持水性略好于超聲輔助提取的蛋白，但并不顯著（P＞0.05）。這可能是因?yàn)榈鞍追肿颖砻娴臉O性基團(tuán)在超聲過(guò)程中發(fā)生了變化，而蛋白持水性與分子極性基團(tuán)的數(shù)目成正比關(guān)系[34]。傳統(tǒng)堿法提取的蛋白持水性在pH3與9 時(shí)，差異不顯著（P＞0.05），其余pH 梯度值之間差異顯著（P＜0.05），超聲輔助提取的蛋白隨pH 梯度值變化的持水差異顯著性亦如此。

圖4b 中持水性數(shù)值的變化趨勢(shì)，pH 為5 時(shí)，蛋白在等電點(diǎn)附近，持水性卻最大。這是因?yàn)榘幢狙芯恐械姆椒y(cè)試持水性時(shí)，蛋白溶解越少，舍棄上清后，蛋白秤量值越大，持水性的計(jì)算值也就越大。

在食品行業(yè)，蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性通常用來(lái)改善烘焙類食品加工特性[35]，可用于糕點(diǎn)的裝飾，維持食物的松軟組織結(jié)構(gòu)和舒適的口感等方面。如圖4c，白玉菇蛋白的起泡性在堿性條件下，得到了更好的改善，pH 為11 和13 時(shí)，超聲輔助提取的白玉菇蛋白的起泡性顯著好于大豆蛋白（P＜0.05）。這可能由于隨著pH 的變化，蛋白質(zhì)溶解度發(fā)生了變化，增加了靜電荷，從而削弱了自身的疏水互作，使得蛋白質(zhì)分子在空氣和水的界面能快速舒展，加大了和空氣的接觸面積，也更易形成泡沫[36]。超聲輔助提取的白玉菇蛋白起泡性僅在這兩個(gè)梯度之間的差異顯著（P＜0.05），其余pH 梯度值之間差異均不顯著（P＞0.05）。傳統(tǒng)堿法提取的蛋白在pH 為3、7 和9 時(shí)，差異不顯著（P＞0.05），其余三個(gè)梯度之間差異顯著（P＜0.05）。在pH 偏堿性后，相同pH 下，兩種提取方式的蛋白之間差異顯著（P＜0.05）。

如圖4d，pH 為3 和13 時(shí)，不同提取方法的白玉菇蛋白與大豆的起泡穩(wěn)定性差異顯著（P＜0.05），其余梯度值時(shí)它們之間差異不顯著（P＞0.05），這可能是由于偏酸性條件下不易形成泡沫。僅當(dāng)pH 為13時(shí)，兩種提取方法的白玉菇蛋白起泡穩(wěn)定性差異顯著（P＜0.05），其余梯度值時(shí)二者之間差異不顯著（P＞0.05）。

蛋白質(zhì)的乳化性是指蛋白與水、油按一定比例互作后，形成乳狀液的能力。乳化活性與溶解度呈正相關(guān)[37]，這是因?yàn)槿芙舛却蟮牡鞍踪|(zhì)，其分子向水油界面的擴(kuò)散速度更快，利于分散體系的快速形成[38]。pH 的變化對(duì)三種蛋白的乳化性及穩(wěn)定性的影響如圖4e 和圖4f，在等電點(diǎn)兩側(cè)，乳化性開(kāi)始增加。白玉菇蛋白在偏堿性條件下的乳化性得到顯著提高，僅在pH 為中性時(shí)，大豆蛋白與兩種提取方法的白玉菇蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性差異顯著（P＜0.05），其余pH 梯度值時(shí)，差異不顯著（P＞0.05）。不同提取方式白玉菇蛋白乳化性之間的差異，也僅在pH 為中性時(shí)顯著（P＜0.05）。傳統(tǒng)堿法提取的蛋白乳化性在pH11 與13 時(shí)，差異不顯著（P＞0.05），其余pH 梯度值之間差異顯著（P＜0.05），超聲輔助提取的蛋白隨pH 梯度值變化的乳化差異顯著性亦如此。這是因?yàn)樗嵝原h(huán)境下減弱了乳化液滴間的相互結(jié)合，當(dāng)pH 逐漸變大趨于堿性環(huán)境時(shí)，相鄰液滴的庫(kù)侖斥力逐漸變大，帶電蛋白的分子水化也相應(yīng)變大，使得界面能量降低，乳化液滴產(chǎn)生更好的結(jié)合[39]。

2.4.2 NaCl 濃度對(duì)白玉菇蛋白理化性質(zhì)的影響 由圖5a 可知，NaCl 濃度在0.5 mol/L 附近時(shí)，兩種提取法的白玉菇蛋白溶解性顯著大于大豆蛋白（P＜0.05）。在相同NaCl 濃度時(shí)，兩種提取法的白玉菇蛋白之間的溶解性差異均不顯著（P＞0.05）。NaCl 濃度在0.5 和1 mol/L 時(shí)，不同提取方法的白玉菇蛋白各自之間的溶解性差異顯著（P＜0.05），在NaCl 濃度達(dá)到1.5 mol/L 后，兩種提取法蛋白各自之間的溶解性差異不顯著（P＞0.05）。這是因?yàn)殡S著NaCl 濃度的加大，蛋白溶解性逐漸減弱并開(kāi)始呈“鹽析”現(xiàn)象。

圖5 不同 NaCl 濃度對(duì)白玉菇蛋白功能性的影響Fig.5 Effect of different NaCl concentrations on protein function of white Hypsizygus marmoreu

由圖5b 可知，因?yàn)椤胞}溶”和“鹽析”隨著NaCl濃度的增加開(kāi)始轉(zhuǎn)化，兩種方法提取的白玉菇蛋白和大豆蛋白的持水性均不斷增加，至NaCl 濃度達(dá)到1.5 mol/L 時(shí)，蛋白基本出，隨后變化微弱。大豆分離蛋白持水性的下降是在1.5 mol/L 附近。NaCl 濃度在0.5mol/L 時(shí)，不同提取方法的白玉菇蛋白之間的持水性差異顯著（P＜0.05）。NaCl 濃度達(dá)到1 mol/L后，蛋白各自之間的持水性開(kāi)始緩慢降低，差異趨于不顯著（P＞0.05）。

從圖5c 和圖5d 中可知，NaCl 濃度在0.5～1 mol/L時(shí)，大豆蛋白的起泡性均好于不同提取工藝的白玉菇蛋白。蛋白質(zhì)要具備良好的發(fā)泡特性，必須能夠在空氣和水的界面遷移、展開(kāi)重新排列[40]。隨著NaCl 濃度的增加，“鹽析”出現(xiàn)，弱化了蛋白的空間重排，三種蛋白的起泡現(xiàn)象均不斷減弱，泡沫可變化的空間體積隨之減少，穩(wěn)定性變化不大。不同提取方法的白玉菇蛋白，起泡性在NaCl 濃度0.5～1 mol/L 時(shí)，變化不顯著（P＞0.05），起泡穩(wěn)定性在不同NaCl 濃度梯度下變化不顯著（P＞0.05）。

由圖5e 和圖5f 可知，NaCl 濃度在0.5～1 mol/L時(shí)，兩種提取方式的白玉菇蛋白之間，乳化性差異顯著（P＜0.05），其余濃度下差異不顯著（P＞0.05）。不同提取方法的白玉菇蛋白，乳化穩(wěn)定性在相同NaCl 濃度梯度下差異不顯著（P＞0.05）。NaCl 濃度在0.5 mol/L時(shí)，超聲輔助提取的白玉菇蛋白在乳化性上已經(jīng)強(qiáng)于大豆分離蛋白（P＜0.05），乳化穩(wěn)定性上與大豆蛋白的差異不顯著（P＞0.05）。這主要是因?yàn)辂}離子通過(guò)靜電屏蔽減少了液滴間的斥力，同時(shí)高濃度的電解質(zhì)，使水分子的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化[41]，并在脂肪層的周圍形成靜電層，引發(fā)相互斥力或者在界面物質(zhì)周圍形成水化層，從而降低了界面能量，延緩液滴的結(jié)合[42]，對(duì)乳化性和乳化穩(wěn)定性產(chǎn)生了一定影響。

2.4.3 溫度對(duì)白玉菇蛋白理化性質(zhì)的影響 由圖6可知，傳統(tǒng)提取方式的白玉菇蛋白的吸油性略好，兩種提取工藝蛋白的這一特性都與大豆分離蛋白差異不顯著（P＞0.05）。隨著溫度的變化，此特性先呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，但在45 ℃后開(kāi)始呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殡S著溫度的繼續(xù)升高，油的黏性開(kāi)始降低，流動(dòng)性增大，與蛋白樣品間相互吸附作用減弱[43]，使蛋白吸油能力下降。白玉菇蛋白良好的吸油性，對(duì)其替代肉類產(chǎn)品的應(yīng)用非常重要，因?yàn)樗鼙Ａ麸L(fēng)味并增進(jìn)口感[44]。有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白與油的結(jié)合能力和其乳化性能呈正相關(guān)，這是其作為脂肪的替代品在食品加工中應(yīng)用的關(guān)鍵[45]。

圖6 不同溫度對(duì)吸油性的影響Fig.6 Effect of different temperatures on oil absorption.

由圖7 可知，在本實(shí)驗(yàn)選定的溫度范圍內(nèi)，兩種方式提取的蛋白在溶解性、持水性、起泡性、乳化性和乳化穩(wěn)定性都不如大豆分離蛋白，這可能與蛋白自身結(jié)構(gòu)以及提取時(shí)的工藝條件等原因有關(guān)。

圖7 不同溫度對(duì)白玉菇蛋白功能性的影響Fig.7 Effect of different temperatures on protein function of white Hypsizygus marmoreu

由圖7a 可知，溫度在25～45 ℃區(qū)間內(nèi)，兩種提取法的白玉菇蛋白之間溶解性的差異均不顯著（P＞0.05），在55～65 ℃區(qū)間內(nèi)，溶解性差異顯著（P＜0.05）。溶解性隨著溫度的增加出現(xiàn)先增長(zhǎng)后平緩的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榈鞍纂S著溫度的不斷升高先溶解，接著發(fā)生聚集所致[46]。溫度從25～65 ℃區(qū)間內(nèi)，兩種提取法的白玉菇蛋白之間持水性的差異均不顯著（P＞0.05）。圖7b 中持水性的計(jì)算值在25 ℃時(shí)最大，這與2.4.1 中測(cè)試pH 對(duì)持水性影響時(shí)的分析同理。

由圖7c 可知，35～45 ℃區(qū)間內(nèi)超聲輔助提取的蛋白，其發(fā)泡性較好，與傳統(tǒng)堿法提取玉菇蛋白之間的差異顯著（P＜0.05），在25～35 ℃，55～65 ℃區(qū)間內(nèi)，二者起泡性差異不顯著（P＞0.05）。隨著溫度的升高，兩種方式提取的蛋白和大豆分離蛋白的發(fā)泡性都呈現(xiàn)出先增長(zhǎng)后降低的現(xiàn)象，這與它們?cè)诓煌瑴囟认碌娜芙庑在厔?shì)一致。這可能是因?yàn)椋S著蛋白在水中的溶解度減小，未能溶于水的蛋白質(zhì)粒子聚集在界面膜上，使膜的流動(dòng)性變差，彈性降低，難以修復(fù)局部膜的薄化[40]。由圖7d 可知，55～65 ℃區(qū)間內(nèi)，超聲輔助提取蛋白的起泡穩(wěn)定性好于大豆蛋白（P＜0.05）。在本實(shí)驗(yàn)選定的相同溫度下，不同提取方法的白玉菇蛋白之間，起泡穩(wěn)定性差異顯著（P＜0.05）。

由圖7e 和圖7f 可知，在本實(shí)驗(yàn)選定的相同溫度下，超聲輔助提取蛋白的乳化性好于傳統(tǒng)提取蛋白（P＜0.05），但二者之間的乳化穩(wěn)定性差異不顯著（P＞0.05）。隨著溫度的升高，兩種方式提取的蛋白和大豆分離蛋白的乳化性先升高后下降，這可能是由于適當(dāng)?shù)臏囟仁沟鞍踪|(zhì)分子伸展度增大，利于其吸附于油水界面[47]，但繼續(xù)升溫又另乳化顆粒運(yùn)動(dòng)加劇，降低了吸附在油水界面上蛋白質(zhì)凝膠作用，減弱了膜黏度和硬度[48]。

3 結(jié)論

本研究首先對(duì)白玉菇的氨基酸組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)人體必需氨基酸含量占其氨基酸總量的35.77%，其中與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的支鏈氨基酸含量最多。通過(guò)超聲輔助提取實(shí)驗(yàn)，使蛋白的提取率提高8%，達(dá)到31.4%。進(jìn)一步對(duì)熱力學(xué)特性數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)超聲提取蛋白最大失重速率溫度為311.4 ℃，傳統(tǒng)提取蛋白為334.8 ℃。分析傅里葉紅外數(shù)據(jù)得出傳統(tǒng)堿法提取使白玉菇蛋白的α螺旋結(jié)構(gòu)減少，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)大量增加。最后以大豆分離蛋白為參照，發(fā)現(xiàn)白玉菇蛋白的吸油性與其相當(dāng)，在pH 非中性或鹽離子濃度0.5 mol/L時(shí)，白玉菇蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性與其差異不顯著。在相同NaCl 濃度下，兩種提取工藝的白玉菇蛋白溶解性、起泡穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性差異不顯著。在25～65 ℃區(qū)間內(nèi)，不同提取方法的白玉菇蛋白在吸油性方面與大豆分離蛋白差異不顯著；在此區(qū)間內(nèi)，不同提取方法的白玉菇蛋白溶解性和起泡性均隨溫度的變化呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，起泡穩(wěn)定性差異顯著（P＜0.05）。上述結(jié)論說(shuō)明，白玉菇蛋白具有良好的加工適應(yīng)性。然而本研究對(duì)白玉菇蛋白熱力學(xué)特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)與理化功能性之間的相關(guān)性探討不深，有待進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)，展開(kāi)實(shí)驗(yàn)深入探索，以期揭示這些特性、結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)聯(lián)。綜上，本研究為白玉菇蛋白資源在食品領(lǐng)域的市場(chǎng)化開(kāi)發(fā)利用提供了一定的實(shí)驗(yàn)借鑒和理論依據(jù)。