玉米阿魏酸對高脂血癥大鼠脂代謝和肝損傷的影響

張乃丹，佐兆杭，王 穎,2,3,4, ，孫 維，龐惟俏

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)中心，黑龍江大慶 163319；3.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319；4.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶 163319）

近年來，人們開始加強(qiáng)對營養(yǎng)和健康的重視，我國居民的膳食營養(yǎng)狀況隨之也得到部分改善，可總體上膳食結(jié)構(gòu)不合理的狀況卻并未消失。長期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致機(jī)體血脂升高，進(jìn)而引起體脂異常，導(dǎo)致高脂血癥等一系列糖脂代謝病。高脂血癥又稱脂質(zhì)代謝紊亂或異常，是引發(fā)心血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素之一[1-3]，可由多種遺傳或獲得性疾病引起，其特點(diǎn)是血脂水平升高。但大部分情況下，高脂血癥只能靠藥物來緩解。目前，高血脂患者多以口服西藥為主，目前他汀類藥物的產(chǎn)品，可以說是所有西藥制劑中目前應(yīng)用最廣泛有效的低脂藥物[4]，但其存在著耐受性差、毒副作用高等局限性[5]。因此，在高脂血癥及有關(guān)疾病的防治方面，目前主要偏向于挖掘天然的活性成分，為以后有可能代替藥物做基礎(chǔ)研究鋪墊，特別是其中表現(xiàn)出廣泛藥理特性的酚類物質(zhì)[6]。

玉米是我國重要的糧食作物，玉米皮為玉米的加工副產(chǎn)物，主要用作低價(jià)飼料[7-8]。玉米皮中有大量的酚酸類物質(zhì)，其中阿魏酸含量最高，阿魏酸具有很高的藥用價(jià)值，目前已知阿魏酸及其衍生物具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、防治心血管疾病的功效[9-10]，同時(shí)還具有抗血栓[11]、抗菌消炎[12]、抗氧化[13]、抗突變和抗癌等作用[14]。因此，其在食品加工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、化妝品領(lǐng)域的研究和應(yīng)用日益廣泛[15-17]。有研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸也具有一定的降血脂作用，但目前對高脂血癥的改善功效尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)以玉米皮中的阿魏酸為實(shí)驗(yàn)對象，通過建立高脂血癥大鼠模型，觀察玉米阿魏酸對其肝臟功能、血脂代謝的影響，提升了玉米皮的附加值，為玉米阿魏酸的保健功效提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，為高脂血癥人群提供新的飲食指導(dǎo)，以及未來在功能性食品中的應(yīng)用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性Wistar 大鼠 遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001；玉米阿魏酸（純度＞95%） 成都曼斯特生物科技有限公司；辛伐他汀片 哈藥集團(tuán)三精明水藥業(yè)有限公司；普通飼料、高脂飼料（高脂飼料配方：普通飼料中加20.0%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉） 北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；異氟烷 百特醫(yī)療用品貿(mào)易有限公司；低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDLC）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒和過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

KDC-2046 低速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；顯微鏡 明美光電公司；EGll50H包埋機(jī)、RM2245 切片機(jī) 德國徠卡公司；DK-8D 型水浴鍋 山東千司科學(xué)儀器；全波長酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；AL104 型電子天平 上海梅特勒-托利多儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型建立、分組及給藥 48 只SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠，在相對濕度50%±10%，環(huán)境溫度23±2 ℃下飼養(yǎng)，本試驗(yàn)遵循黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)原則，定期清洗消毒籠具并更換墊料，大鼠自由進(jìn)食和飲水，每周對大鼠體質(zhì)量進(jìn)行稱量。Wistar 大鼠自適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)選擇8 只作為正常組（CON），其余大鼠以高脂飼料飼喂，飼喂量與CON 組相同，喂養(yǎng)4 周后，測定大鼠TC、TG、HDL-C 和LDL-C 含量，若試劑盒結(jié)果顯示喂養(yǎng)高脂飼料組與CON 組相比血清HDL-C 含量顯著下降（P＜0.05），LDL-C、TG、TC 含量相比CON組顯著升高（P＜0.05），則表明建模成功。

建模完成之后，將高脂血癥大鼠隨機(jī)分成5 組（每組8 只），組名為玉米阿魏酸高（FA-H）、中（FAM）、低（FA-L）劑量組，陽性對照組（SV）和模型組（MOD）。MOD 和CON 組生理鹽水灌胃；SV 組辛伐他汀片（10 mg/kg）灌胃；FA-H（10 mg/kg）、FA-M（20 mg/kg）、FA-L（40 mg/kg）劑量組玉米阿魏酸灌胃（根據(jù)先前研究方法選擇[17]），每天定時(shí)對各組大鼠進(jìn)行灌胃，灌胃劑量均為2 mL/只。持續(xù)給藥42 d后，大鼠12 h 禁食，使用吸入異氟烷的方式麻醉，取血解剖，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 血清生化及抗氧化指標(biāo)測定 大鼠解剖后，從腹主動(dòng)脈進(jìn)行血液采集后靜置30 min 以上，離心（4℃，4000 r/min，10 min），提取的血清通過SOD、GSH-Px、AST、MDA、LDL-C、TC、CAT、ALT、HDL-C 和TG 試劑盒測定其含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.2.3 肝臟指數(shù)及肝臟組織病理變化 參考張明等[18]實(shí)驗(yàn)步驟，解剖肝臟用生理鹽水沖洗后，稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)[19]。肝臟指數(shù)公式如下：

取右小葉，10%甲醛固定液中固定48 h，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片后，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)形態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差方式對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)。采用Excel 2021 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂血癥模型建立

血脂是血漿中TC、TG 及類脂的總稱，長期的高脂飲食會(huì)引起TC、TG、HDL-C 和LDL-C 含量發(fā)生改變，并會(huì)引起高脂血癥的發(fā)生[20-21]。由表1 可以看出，喂食高脂飼料的大鼠TG、LDL-C、TC 較CON組極顯著升高（P＜0.01），而HDL-C 則較CON 組極顯著降低（P＜0.01）。表明高脂飲食引起了大鼠的脂肪代謝異常，成功建立大鼠高血脂模型。

表1 Wistar 大鼠第5 周的血脂水平Table 1 Blood lipid level of Wistar rats at the 5th week

2.2 玉米阿魏酸對高脂血癥大鼠體重和肝臟指數(shù)的影響

長期喂食高脂膳食會(huì)導(dǎo)致大鼠體重超過標(biāo)準(zhǔn)值，并會(huì)影響肝臟代謝[22-23]。整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期由圖1中可以看出，1～5 周時(shí)CON 組的體重均顯著低于其他劑量組（P＜0.05），且各組的生長狀況良好，體重均穩(wěn)定增長。在完成分組進(jìn)行給藥后，在表2 中可以看出，MOD 組大鼠體重增長率可達(dá)到0.85%±0.21%，與之相比SV 組、FA-M 組的體重增長率顯著性降低（P＜0.05）；FA-H 組體重增長率為0.62%±0.12%，降低了0.23%，極顯著性降低（P＜0.01）。MOD 組的肝臟指數(shù)為2.71%±0.24%，極顯著高于CON 組（P＜0.01），經(jīng)過玉米阿魏酸影響后的大鼠肝臟指數(shù)與MOD 組的相比均表現(xiàn)出極顯著降低（P＜0.01），最高降低0.14%。由此表明一定濃度的玉米阿魏酸能夠顯著地降低高脂血癥大鼠體重和肝臟質(zhì)量，并能有效地抑制高脂大鼠的肝臟指數(shù)增加。

圖1 玉米阿魏酸對大鼠體重的影響Fig.1 Effect of corn ferulic acid on body weight of rats

表2 Wistar 大鼠第5 周的體重增長率和肝臟指數(shù)Table 2 Weight gain rate and liver index of Wistar rats at the 5th week

2.3 玉米阿魏酸對高脂血癥大鼠血脂代謝的影響

循環(huán)水平的TC、TG 和LDL-C 升高，HDL-C 降低，是高脂血癥的特征之一[24-25]。TC 具有疏水性，可與高、低密度脂蛋白（HDL、LDL）結(jié)合成為HDLC 和LDL-C。其中HDL-C 可以將TC 輸送至肝臟進(jìn)行代謝；LDL-C 可以作為載體，將TC 與受體結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)到各個(gè)組織[26]。TG 和TC 的含量越高，機(jī)體的脂肪酸含量也就越高[27]。從圖2 中可以看出，與CON 組相比，MOD 組TC、TG、LDL-C 極顯著升高（P＜0.01），HDL-C 極顯著降低（P＜0.01），說明MOD組大鼠的高脂血癥特征明顯。與MOD 組相比，隨著玉米阿魏酸劑量的不斷增加，TC、LDL-C 和TG含量均有所降低，F(xiàn)A-H 組效果最好，TC 降低25.45%、TG 降低52%、LDL-C 降低48.28%，均具有極顯著性差異（P＜0.01）。而FA-M 組和FA-H 組HDL-C的含量分別增加48.65%、56.76%，均具有顯著性差異（P＜0.05）。與潘奕鷗等[28]在阿魏酸對脂肪沉積的ob/ob 小鼠血脂水平，TC、TG、LDL-C 和HDL-C含量影響變化的趨勢研究結(jié)果相似?？赡苁怯捎谟衩装⑽核峒涌炝薍DL-C 的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而加快膽固醇排出，并抑制脂肪酸與甘油的結(jié)合。表明玉米阿魏酸能夠降低高脂血癥大鼠的血脂，促進(jìn)機(jī)體代謝。

圖2 玉米阿魏酸對大鼠血脂代謝的影響Fig.2 Effect of corn ferulic acid on blood lipids in rats

2.4 玉米阿魏酸對高脂血癥大鼠血清中ALT、AST的影響

肝臟是進(jìn)行膽固醇、脂肪等脂類物質(zhì)分解的主要器官[29]。AST 和ALT 的指標(biāo)可以反映肝功損傷和恢復(fù)情況[30-31]。肝損傷時(shí)，細(xì)胞中的AST 和ALT會(huì)進(jìn)入血液，導(dǎo)致其大量聚集在血清中[32]。從圖3中可以看出，MOD 組的 ALT 和 AST 與 CON 組相比含量極顯著升高（P＜0.01），表明高脂血癥大鼠的肝臟已受到損傷。與MOD 組相比，玉米阿魏酸處理組ALT 和AST 含量均呈現(xiàn)降低趨勢，其中FA-H 組效果最好，ALT 含量下降29.81%（P＜0.01）、AST 含量下降16.63%（P＜0.01），結(jié)果與徐詩雨等[33]使用阿魏酸對急性肝損傷小鼠的ALT、AST 含量影響變化的趨勢研究結(jié)果相似。說明一定劑量的玉米阿魏酸可以降低高脂血癥大鼠的ALT、AST 活性，對高脂血癥大鼠的肝損傷具有一定程度的修復(fù)。

圖3 玉米阿魏酸對大鼠血清中ALT、AST 的影響Fig.3 Effect of corn ferulic acid on serum ALT and AST in rats

2.5 玉米阿魏酸對高脂血癥大鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響

肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇受到阻礙會(huì)導(dǎo)致自由基增加，進(jìn)而破壞抗氧化系統(tǒng)，造成氧化損傷[34]。SOD 是重要的自由基清除酶，在高脂血癥大鼠的實(shí)驗(yàn)中，若SOD 活性降低，則其自由基清除能力也會(huì)相應(yīng)地有所削減[35]。MDA 可以反映人體脂質(zhì)過氧化的程度[36]。GSH-Px 和CAT 能使過氧化氫產(chǎn)生較高的羥基自由基，從而產(chǎn)生一種無毒性的產(chǎn)物[37]。由圖4 可以看出，MOD 組MDA 極顯著高于CON 組（P＜0.01），而SOD、CAT 和GSH-Px 極顯著降低（P＜0.01），可以說明高脂血癥大鼠的過氧化水平升高，自由基清除能力下降，氧化-抗氧化狀態(tài)不平衡。與MOD 組相比，經(jīng)過玉米阿魏酸處理后的大鼠SOD、GSH-Px、CAT、MDA 結(jié)果FA-H 組效果最好，SOD 水平增加了123.54%，GSH-Px 增加了153.89%，CAT 增加了209.9%，MDA 降低了51.95%，均有極顯著的改善（P＜0.01）。試驗(yàn)結(jié)果與唐禎等[38]用阿魏酸結(jié)構(gòu)改造的新化合物對大鼠高脂血癥的SOD、MDA、CAT 含量的影響變化趨勢相似。表明玉米阿魏酸可增強(qiáng)高脂血癥大鼠的抗氧化活性，并對脂質(zhì)代謝異常具有良好的調(diào)節(jié)作用。

圖4 玉米阿魏酸對大鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響Fig.4 Effect of corn ferulic acid on serum antioxidant indexes in rats

2.6 玉米阿魏酸對高脂血癥大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

觀察肝臟的組織切片，可以更直觀地發(fā)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)的變化。由圖5 可以看出，CON 組細(xì)胞整體組織形態(tài)完整，排列整齊，無明顯分界，大小均勻，細(xì)胞質(zhì)豐富；與CON 組相比MOD 組細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)間脂滴液泡大小不同，組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；與MOD 組相比玉米阿魏酸不同劑量組雖脂滴液泡形態(tài)各異，但細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞間隙小。隨著玉米阿魏酸劑量的增加，脂滴空泡逐漸減少，細(xì)胞輪廓逐漸相對清晰，肝臟組織結(jié)構(gòu)有明顯的改善，其中FAH 組改善效果最明顯。表明玉米阿魏酸對高脂血癥大鼠的肝臟結(jié)構(gòu)具有一定的修復(fù)、改善作用。

圖5 大鼠肝組織形態(tài)變化（100×）Fig.5 Morphological changes of rat liver tissue（100×）

3 結(jié)論

通過玉米阿魏酸對高脂膳食誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠體重、肝臟指數(shù)、脂質(zhì)代謝、肝損傷、抗氧化指標(biāo)及肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響發(fā)現(xiàn)。玉米阿魏酸可以使高脂血癥大鼠體重增長率降低0.23%，肝臟指數(shù)降低0.14%，表明一定劑量的玉米阿魏酸可以減輕高脂血癥大鼠的體重和肝臟指數(shù)；玉米阿魏酸還可以使高脂血癥大鼠的TC 降低25.45%、TG 降低52%、LDL-C降低48.28%、ALT 降低29.81%、AST 降低16.63%和MDA 降低51.95%，HDL-C 增加56.76%、SOD 增加123.54%、GSH-Px 增加153.89%、CAT 增加209.9%，表明一定劑量的玉米阿魏酸可以改善血脂代謝、肝損傷、增強(qiáng)抗氧化能力，改善高血脂癥；在高脂血癥大鼠的肝臟切片中可以明顯看出，隨著玉米阿魏酸含量的增加，切片中脂滴空泡減少、細(xì)胞輪廓清晰，表明玉米阿魏酸可以改善高血脂癥大鼠的肝脂肪變形情況。

綜上所述，玉米阿魏酸對高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥具有輔助治療作用，并對肝臟具有良好的保護(hù)作用。本研究提高了玉米皮的附加值，為玉米阿魏酸的保健功效提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，以及未來在功能性食品中的應(yīng)用提供了參考。然而本文主要集中在玉米阿魏酸對高脂血癥大鼠血液指標(biāo)的影響進(jìn)行探討，但沒有進(jìn)一步深究玉米阿魏酸對高脂血癥大鼠的血清代謝組學(xué)和腸道菌群的影響情況，這也是本課題組下一步的研究方向。