鹽堿脅迫下產(chǎn)ACC 脫氨酶促生菌對綠豆插條生根的作用

李 鑫，張美珍，鄭翹楚，劉 權(quán)，黃玉蘭，殷奎德

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

土壤鹽堿化是目前農(nóng)業(yè)面臨的主要問題之一。到2050年，預(yù)計(jì)超過50%的耕地將受到土壤鹽堿化的影響[1]。鹽堿脅迫是導(dǎo)致作物減產(chǎn)的主要原因之一[2]。土壤中的高濃度鹽和高pH 值會引發(fā)滲透脅迫、離子脅迫和氧化脅迫，從而影響植物生產(chǎn)力。由于土壤的高滲條件，植物細(xì)胞內(nèi)會積累有毒離子，影響水分平衡和離子穩(wěn)態(tài)[3]。鹽堿脅迫的另一個后果是產(chǎn)生活性氧（ROS），活性氧會導(dǎo)致二次DNA 損傷，如堿基缺失、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)和雙鏈DNA 斷裂[4]。除此之外，鹽堿脅迫還可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過量的乙烯，抑制葉片生長、細(xì)胞分裂和根伸長，導(dǎo)致植物提前衰老或死亡[5]。

近年來，通過接種植物根際促生菌（PGPR）來幫助植物抵御鹽堿脅迫逐漸成為研究熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究表明，PGPR 可以參與誘導(dǎo)植物提高抗氧化水平、調(diào)節(jié)Na+流出、提高光合效率等多種植物生理活動來緩解鹽堿脅迫給植物帶來的傷害[6-8]。PGPR 通常具有多種促生功能，如固氮、產(chǎn)鐵載體、溶磷、產(chǎn)植物激素[如吲哚乙酸（IAA）]和合成1-氨基環(huán)丙烷1-羧酸（ACC）脫氨酶等[9]。ACC 脫氨酶產(chǎn)生菌可以將乙烯前體ACC 分解成α-酮丁酸鹽和氨，降低植物根內(nèi)的乙烯濃度，從而緩解脅迫乙烯對植物生長的不利影響[10-11]。另外，有研究表明，接種產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPR也可以通過調(diào)節(jié)植物根中ACC合成酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）的活性降低乙烯對植物的傷害[12]。ACS 和ACO 在植物乙烯的合成過程中起重要作用，ACS 是植物內(nèi)源乙烯合成的限速酶，ACO 則是組成型的，不構(gòu)成乙烯生物合成的限速酶[13]。

目前，關(guān)于產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPR 促進(jìn)鹽堿脅迫下綠豆生長的研究已有報道[14-15]，其主要關(guān)注的是綠豆植株地上部分的變化，對根系的研究較少，特別是接種產(chǎn)ACC 脫氨酶的促生菌后綠豆生根與乙烯合成相關(guān)酶的研究還未見報道。鑒于此，將產(chǎn)ACC 脫氨酶的促生菌接種到綠豆插條基部，通過檢測綠豆插條在鹽堿脅迫條件下的生根數(shù)及根中ACC含量以及ACC合成酶和ACC氧化酶活性，明確產(chǎn)ACC脫氨酶的PGPR對鹽堿脅迫條件下綠豆插條生根的作用機(jī)制，為PGPR 促進(jìn)植物生根、提高植物耐鹽堿能力的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試土壤樣品采自大慶市鹽堿草原堿草根際，用以篩選產(chǎn)ACC 脫氨酶促生菌；綠豆種子為國家雜糧工程技術(shù)中心贈送，品種為小明綠。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株的篩選及其產(chǎn)ACC 脫氨酶能力檢測 產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株篩選參照PENROSE 等[16]和張國壯等[17]的方法。產(chǎn)ACC 脫氨酶能力檢測具體步驟參考黃天姿等[18]的方法。蛋白質(zhì)含量測定選用考馬斯亮藍(lán)法。酶活的計(jì)算方式以每分鐘產(chǎn)出1 μmol α-丁酮酸的量為1 個酶活力單位（U），計(jì)算方式參考姬文秀等[19]的方法。

1.2.2 菌株耐鹽堿范圍測定 耐堿試驗(yàn)：將篩選出的菌株按1%的接種量分別接種到pH 值為8、9、10、11的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、170 r∕min振蕩培養(yǎng)24 h，檢測OD600值。耐鹽堿試驗(yàn)：根據(jù)耐堿試驗(yàn)中測定的OD600值選擇菌株生長較好的最高pH 值，按1%的接種量分別接種到NaCl 含量為0、2%、4%、6%、8%、10%、12%的LB 液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、170 r∕min振蕩培養(yǎng)24 h，測定OD600值。

1.2.3 菌株生理生化鑒定和分子鑒定 菌株的生理生化鑒定參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[20]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[21]上有關(guān)細(xì)菌的生理生化鑒定部分，主要包括甲基紅試驗(yàn)、唯一碳源試驗(yàn)、唯一氮源試驗(yàn)、革蘭氏染色、需氧性試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)。同時檢測菌株產(chǎn)植物激素IAA 功能，參照?；燮嫉萚22]與王西祥等[23]的方法進(jìn)行。

將菌株樣品送至吉林美吉生物公司進(jìn)行16S rDNA 測序，測序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對，并從NCBI 上找到相應(yīng)模式菌株的16S rDNA 序列，之后利用MEGA 7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其種屬關(guān)系。

菌株acdS基因鑒定參考秦媛等[24]的方法，用引物acdSf3∕acdSr4 擴(kuò)增菌株acdS基因片段，acdSf3 和acdSr4的序列分別為ATCGGCGGCATCCAGWSNAAYCANAC 和GGCACGCCGCCCARRTGNRCRTA，片段大小為760 bp，退火溫度為58 ℃。

1.2.4 綠豆插條下胚軸不定根促生試驗(yàn) 插條培養(yǎng)：參考龔月樺等[25]的方法培養(yǎng)綠豆插條，綠豆種子用無菌水清洗3 次后37 ℃催芽，發(fā)芽后種植于已滅菌的蛭石中，待幼苗長至7～9 cm 時，切除子葉以下5 cm部位，得扦插條。

最適鹽堿脅迫濃度篩選：將綠豆插條分別置于0、10、14、16、18 mmol∕L NaHCO3溶液中，7 d 后統(tǒng)計(jì)不定根數(shù)目。最適菌液處理濃度篩選：將3 株促生菌接種在TSB 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r∕min 培養(yǎng)24 h，4 ℃、18 000 r∕min 離心5 min，去上清后用ADF 培養(yǎng)基重懸，再培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)菌株產(chǎn)ACC 脫氨酶活性，18 000 r∕min 離心5 min，去上清后用無菌水重懸，將重懸后的菌液分別稀釋到106、107、108cfu∕L。將3種不同濃度的菌液置于10 mL 滅菌離心管中，將綠豆插條下胚軸部分分別置于3 種濃度的菌液中，每個離心管放5 根綠豆插條，24 h 后轉(zhuǎn)入無菌水中，7 d后統(tǒng)計(jì)不定根數(shù)目。

插條處理及生根統(tǒng)計(jì)：將綠豆插條的下胚軸分別置于無菌水（CK）或菌懸液中浸泡24 h，浸沒插條底部2 cm。處理24 h 后，將綠豆插條分別轉(zhuǎn)移至無菌水（正常條件）或NaHCO3溶液（鹽堿脅迫）中，每個處理5 株插條，3 次重復(fù)，每隔24 h 更換無菌水或NaHCO3溶液，7 d后統(tǒng)計(jì)扦插條大于1 mm的不定根數(shù)目，并稱量根鮮質(zhì)量，采用SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.5 作圖。將新生根剪下來用液氮速凍，轉(zhuǎn)至-80 ℃保存，用于檢測ACC含量、ACC合成酶活性和ACC氧化酶活性。

插條根中ACC 含量、ACC 合成酶、ACC 氧化酶檢測：利用氣相色譜法檢測ACC 含量、ACC 合成酶活性、ACC 氧化酶活性。氣相色譜儀型號為北分瑞利3420A，進(jìn)樣口溫度60 ℃，檢測器溫度150 ℃，柱溫箱溫度60 ℃，待儀器3 個溫度都達(dá)到設(shè)定值，進(jìn)行儀器點(diǎn)火，開始監(jiān)控基線，待基線平穩(wěn)30 min 后，開始進(jìn)樣。根據(jù)公式計(jì)算ACC 含量、ACC 成合酶活性、ACC 氧化酶活性，ACC 含量計(jì)算公式為N∕S×C×n×V×1∕22.4W，單位nmol∕g；ACC 合成酶活性和ACC氧化酶活性在不同前處理下計(jì)算公式均為N∕S×n×V×1∕t×1∕22.4W，單位為nmol∕（h·g）。式中，N為樣本乙烯的峰面積；S為標(biāo)準(zhǔn)乙烯的峰面積；n為提取液的稀釋倍數(shù)；C為標(biāo)準(zhǔn)乙烯的濃度；V為反應(yīng)容器體積；W為測試樣本的鮮質(zhì)量；t為密閉時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)ACC脫氨酶促生菌的篩選及鑒定

用ADF 固體培養(yǎng)基從大慶堿草植物根際土中定性分離出了30 株具有產(chǎn)ACC 脫氨酶能力的促生菌，編號DQJC1—DQJC30，從中選取3 株產(chǎn)ACC 脫氨酶能力較強(qiáng)的菌株DQJC1、DQJC5、DQJC6作為后續(xù)試驗(yàn)的供試菌株，3 株菌產(chǎn)ACC 脫氨酶能力分別為8.147、7.282、7.906 U∕mg。對3 株菌進(jìn)行耐鹽堿能力鑒定，發(fā)現(xiàn)3 株菌均能在pH 值11 且NaCl 含量10%的LB 培養(yǎng)基中生長，均具有較強(qiáng)的耐鹽堿能力。定量檢測了DQJC1、DQJC5、DQJC6 的產(chǎn)IAA 能力，分別為64.33、10.45、12.05 mg∕mL。

對3 株產(chǎn)ACC 脫氨酶的促生菌進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果表明，3 株促生菌均為革蘭氏陰性菌，都可以利用唯一碳源（葡萄糖、蔗糖），都是需氧性菌；接觸酶、氧化酶、硝酸鹽還原均為陽性，DQJC1 和DQJC6 甲基紅試驗(yàn)呈陽性，DQJC5 甲基紅試驗(yàn)呈陰性。

acdS基因是產(chǎn)生ACC 脫氨酶的特有基因。提取DQJC1、DQJC5、DQJC6 三個菌株的DNA，用引物acdSf3∕acdSr4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，3 株菌在片段大小為760 bp 處皆有條帶，說明3 株菌均具有acdS基因，進(jìn)一步驗(yàn)證了3株菌均具有產(chǎn)ACC 脫氨酶能力。將DQJC1、DQJC5、DQJC6 的16S rDNA 測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果見表1，綜合菌株的生理生化鑒定和分子鑒定結(jié)果，確定3 株菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）的不同菌種，3 株促生菌的系統(tǒng)發(fā)育分析情況見圖1。

圖1 菌株DQJC1、DQJC5、DQJC6基于16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed from strains DQJC1，DQJC5，and DQJC6 based on 16S rDNA

表1 DQJC1、DQJC5、DQJC6的16S rDNA 基本信息與核酸序列比對（BLASTn）結(jié)果Tab.1 The 16S rDNA basic information and results nucleic acid sequence alignment（BLASTn）of DQJC1，DQJC5，and DQJC6

2.2 篩選菌株對綠豆插條下胚軸不定根的促生作用

2.2.1 最適鹽堿脅迫濃度篩選 為了篩選綠豆插條在鹽堿條件下能夠生長的最高脅迫濃度，將綠豆插條分別置于0、10、12、14、16、18 mmol∕L NaHCO3溶液中生長，7 d 后統(tǒng)計(jì)不定根數(shù)目。結(jié)果表明，綠豆插條在無菌水中可以正常生根，在10～16 mmol∕L NaHCO3溶液中生根受到明顯抑制，其中14 mmol∕L NaHCO3溶液抑制生根效果較強(qiáng)，插條平均生根數(shù)為4.10 條，在16 mmol∕L NaHCO3溶液中綠豆插條幾乎不再生根，因此選擇14 mmol∕L 的NaHCO3溶液作為綠豆插條生根的鹽堿脅迫濃度。

2.2.2 最適菌液處理濃度篩選 將不同濃度的DQJC1、DQJC5、DQJC6 接種到綠豆插條基部，處理后發(fā)現(xiàn)，3 株促生菌皆在107cfu∕mL 時促生效果最好，當(dāng)接種菌液濃度為108cfu∕mL 時，綠豆插條新生根根長有所增加，但發(fā)根數(shù)明顯減少，因此，后續(xù)試驗(yàn)菌液處理濃度選擇107cfu∕mL。

2.2.3 鹽堿脅迫下接種3株菌對綠豆插條生根的影響 將接種促生菌后的綠豆插條分別經(jīng)無菌水（正常條件）和14 mmol∕L NaHCO3溶液（鹽堿脅迫）處理7 d，綠豆插條發(fā)根情況分別見圖2、圖3及表2，鹽堿脅迫條件下接種3株促生菌顯著增加了綠豆插條根的鮮質(zhì)量。統(tǒng)計(jì)2 種處理?xiàng)l件下綠豆插條的發(fā)根數(shù)，結(jié)果見圖4，正常條件下接種DQJC1、DQJC5、DQJC6 后，綠豆插條發(fā)根數(shù)分別增加了50.00%、26.32%、44.73%；鹽堿脅迫條件下接種DQJC1、DQJC5、DQJC6 后，綠豆插條發(fā)根數(shù)分別增加了125.81%、106.45%、112.90%，說明在鹽堿脅迫條件下，3 株促生菌具有明顯的促進(jìn)綠豆插條生根的能力，其中DQJC1促生效果最好。2.2.4 綠豆插條根中ACC 含量、ACC 合成酶活性、ACC 氧化酶活性 鹽堿脅迫條件下接種DQJC1、DQJC5、DQJC6 后，綠豆插條新生根中的ACC 含量、ACC 合成酶活性、ACC 氧化酶活性檢測結(jié)果如圖5所示，DQJC1、DQJC6可以顯著下調(diào)綠豆插條根中的ACC 含量，分別下調(diào)了136.15%、65.66%；DQJC1、DQJC5、DQJC6 可以顯著下調(diào)綠豆插條根中ACC 合成酶、ACC 氧化酶活性，其中ACC 合成酶活性分別下調(diào)了204.83%、156.31%、160.79%，ACC 氧化酶活性分別下調(diào)了51.97%、47.60%、40.56%，3 株菌均表現(xiàn)出抑制ACC 合成酶和ACC 氧化酶活性。綜合來看，接種菌株DQJC1 緩解鹽堿脅迫對綠豆插條生根的抑制效果最好。

圖2 正常條件下接種3株促生菌對綠豆插條生根的影響Fig.2 Effect of inoculation of three promoting strains on rooting of mung bean cuttings under normal conditions

圖3 NaHCO3處理下接種3株促生菌對綠豆插條生根的影響Fig.3 Effect of inoculation of three promoting strains on rooting of mung bean cuttings under NaHCO3 treatment

圖4 鹽堿脅迫及正常條件下接種促生菌對綠豆插條生根的影響Fig.4 Effect of inoculation with promoting strains on mungbean cuttings rooting under saline stress and normal conditions

圖5 接種3株促生菌對綠豆插條根中ACC含量、ACC合成酶活性和ACC氧化酶活性的影響Fig.5 Effect of inoculation with three promoting strains on the ACC content，ACC synthase activity and ACC oxidase activity in the roots of mung bean cuttings

表2 正常條件和鹽堿脅迫條件下接種3株促生菌對綠豆插條根長及鮮質(zhì)量的影響Tab.2 Effects of inoculation with three promoting strains on root length and fresh weight of mung bean cuttings under normal and saline stress conditions

3 結(jié)論與討論

鹽堿脅迫是導(dǎo)致植物減產(chǎn)的主要非生物脅迫之一，鹽堿脅迫下植物產(chǎn)生的過量脅迫乙烯會阻礙植物葉片生長、根系伸長，導(dǎo)致植物衰老或死亡[26]。植物根際促生菌通常具有多種促生功能，可以幫助植物抵御鹽堿脅迫，產(chǎn)ACC 脫氨酶是促生菌最重要的促生功能之一。研究表明，產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPR 可以調(diào)節(jié)鹽堿脅迫下植物體內(nèi)Na+、K+的流出，提高K+∕Na+和Ca+2∕Na+的比例[27]；還可以通過觸發(fā)植物細(xì)胞的抗氧化水平來誘導(dǎo)植物的抗鹽能力[28]。目前已報道的產(chǎn)ACC 脫氨酶能力強(qiáng)同時也具備較強(qiáng)耐鹽堿能力的菌株較少，如費(fèi)詩萱等[29]從紅棗根際土中篩出的產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株，酶活性在0.500～7.218 U∕mg；梁翔宇等[30]從寧夏銀北地區(qū)鹽生植物根際土中篩選出3 株耐鹽堿促生菌，可以在NaCl 含量為8%和pH 值為9 的培養(yǎng)基中生長。在試驗(yàn)方法相同的前提下，本研究篩選出的菌株DQJC1、DQJC5、DQJC6產(chǎn)ACC 脫氨酶能力分別達(dá)到8.147、7.282、7.906 U∕mg，在產(chǎn)ACC 脫氨酶能力較強(qiáng)的同時，也具有較強(qiáng)的耐鹽堿能力，可以在pH 值11、NaCl含量10%的環(huán)境下生長。

前人研究表明，PGPR 可以通過產(chǎn)生植物激素IAA 和ACC 脫氨酶增強(qiáng)植物對逆境的抵抗能力，促進(jìn)植物生長。鹽堿脅迫下，植物生根組織對乙烯含量的響應(yīng)有一個閾值，植物體內(nèi)乙烯含量高于或低于這個閾值范圍，生根則受到抑制[31-32]。除了乙烯外，植物激素IAA 在不定根起始和發(fā)生過程中也有著重要的作用。有研究表明，IAA 可以和乙烯協(xié)同作用促進(jìn)植物初生根和次生根的生長[33]；LIU等[34]研究表明，生長素能夠通過增加未成熟桃子果實(shí)中的ACC合成酶含量來刺激乙烯的合成。供試的3株促生菌同時兼具產(chǎn)IAA 和產(chǎn)ACC 脫氨酶功能，其促進(jìn)插條生根的機(jī)制可能是IAA 和ACC 脫氨酶的協(xié)同作用。一方面，促生菌產(chǎn)生的低濃度IAA 刺激生根部位細(xì)胞分裂，形成不定根，這與王金祥等[35]的研究結(jié)果一致，本試驗(yàn)在非鹽堿脅迫條件下接種促生菌也可以顯著增加綠豆插條的發(fā)根數(shù)，印證了這一點(diǎn)。另外，QIN 等[36]研究表明，IAA 可以通過激活植物ACC 合成酶的轉(zhuǎn)錄來影響促生菌ACC 脫氨酶的合成。另一方面，鹽堿脅迫促使插條產(chǎn)生大量乙烯并在體內(nèi)積累，插條體內(nèi)乙烯積累量越來越多，當(dāng)內(nèi)源乙烯含量超過閾值，生根就會受到抑制。

本研究中，接種促生菌后顯著下調(diào)了綠豆插條根中的乙烯前體ACC 含量，從而降低了乙烯的含量。ACC 含量的降低可能是促生菌分解了根系向外釋放出的ACC。另外一個原因可能是促生菌降低了ACC合成酶和ACC氧化酶活性，ACC合成酶是調(diào)節(jié)植物體內(nèi)乙烯濃度的中心限速酶，是植物合成ACC 的必經(jīng)通路，隨著ACC 合成酶活性的降低，ACC 的合成得到控制。ACC 氧化酶是乙烯生物合成的最后一步，接種促生菌后ACC 氧化酶活性下調(diào)，加上ACC 合成被抑制，乙烯合成的速率逐漸降低，產(chǎn)ACC 脫氨酶的促生菌通過抑制乙烯合成有效地緩解了鹽堿脅迫對綠豆插條生根的抑制作用。

綜上，本研究從堿草植物根際土中篩選出了3株產(chǎn)ACC 脫氨酶能力較強(qiáng)的促生菌，命名為DQJC1、DQJC5、DQJC6，其具有較強(qiáng)的耐鹽堿能力，經(jīng)生理生化和分子鑒定，3 株促生菌均為假單胞菌屬。將3 株促生菌接種到綠豆插條基部后，在非鹽堿和鹽堿脅迫條件下均可顯著增加綠豆插條的發(fā)根數(shù)，其中DQJC1促生效果最好；3株促生菌顯著下調(diào)了鹽堿脅迫條件下綠豆插條根中的ACC 合成酶活性和ACC 氧化酶活性，DQJC1和DQJC6顯著下調(diào)了綠豆插條根中的ACC 含量，有效地緩解了鹽堿脅迫對綠豆插條生根的抑制作用。