新型電物理加工對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響研究進(jìn)展

叢海花，崔保威，張紫薇，周 倩，宋京城，高 岳,*，逯曉燕,*，黎茉可

（1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品科技學(xué)院，江蘇 蘇州 215008；2.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；3.江南大學(xué)設(shè)計(jì)學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

新型電物理加工技術(shù)主要包括電場(chǎng)技術(shù)和電磁場(chǎng)技術(shù)（圖1），電場(chǎng)技術(shù)是將產(chǎn)品置于通電電場(chǎng)中，并將其作為一段導(dǎo)體進(jìn)行加工的技術(shù)；電磁場(chǎng)是由電荷流動(dòng)產(chǎn)生的，該加工技術(shù)是通過外加電場(chǎng)與食品中的偶極分子相互感應(yīng)來進(jìn)行食品加工[7]。電物理加工技術(shù)因其適用性廣、成本低等特點(diǎn)最早應(yīng)用在疾病治療方面，之后逐漸進(jìn)入食品領(lǐng)域，成為食品加工的一種新技術(shù)。電物理加工可以使蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)（巰基）吸收能量產(chǎn)生自由基，或使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集和解折疊反應(yīng)，破壞蛋白質(zhì)分子之間的各種相互作用力，包括范德華力、靜電和疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵和鹽橋等，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，進(jìn)而影響食品品質(zhì)和風(fēng)味[3,8]。許多研究詳細(xì)介紹了高壓[9]、超聲波[10]和常規(guī)加熱[11]等物理方法對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能特性的影響。然而，目前缺乏針對(duì)電物理加工技術(shù)對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響的匯總。因此，本綜述介紹新型電物理加工技術(shù)（主要包括歐姆加熱、靜電場(chǎng)、微波、射頻和磁場(chǎng)）對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的影響，并結(jié)合不同電物理加工技術(shù)中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能變化的研究結(jié)果進(jìn)行分析，為進(jìn)一步開展相關(guān)電物理加工技術(shù)應(yīng)用提供理論支持。

圖1 新型電物理加工技術(shù)對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響示意圖Fig.1 Schematic diagram showing the effect of new electrophysical processing technology on multiscale protein structure

1 歐姆加熱對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

歐姆加熱也稱為焦耳加熱、電阻加熱或?qū)щ娂訜?，是指待加熱材料（例如反?yīng)混合物）作為歐姆加熱器，通過交流電流加熱的一種點(diǎn)加熱技術(shù)。該反應(yīng)器用于食品加熱時(shí)，通過食品物料自身的電導(dǎo)特性來加熱食品，在食品兩端施加電場(chǎng)后，電流會(huì)流進(jìn)食品內(nèi)部。此時(shí)，食品的自身阻抗可產(chǎn)生熱量，從而達(dá)到加熱物料的目的[12]。歐姆加熱可以消除通過溫度梯度或熱表面或從周圍環(huán)境到介質(zhì)的傳熱步驟，實(shí)現(xiàn)快速均勻加熱[13]，同時(shí)也由于其通電的原因會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

由于熱和電場(chǎng)的共同作用，歐姆加熱可以干擾蛋白質(zhì)構(gòu)象及其相互作用，改變其展開機(jī)制和聚集模式，從而誘導(dǎo)大分子（如蛋白質(zhì)）發(fā)生特異性變化[14-16]。在不同的處理?xiàng)l件下，歐姆加熱對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有明顯的影響（表1）。有研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)經(jīng)歐姆加熱后，隨著溫度的進(jìn)一步升高，伴隨著靜電相互作用的產(chǎn)生，蛋白質(zhì)分子發(fā)生拉伸、修飾，使得溶解度、發(fā)泡性能和ESI降低，EAI和濁度增加[17]。同時(shí)，歐姆加熱也使嵌在分子內(nèi)部的巰基暴露在分子表面，導(dǎo)致電流傳導(dǎo)時(shí)巰基發(fā)生氧化生成二硫鍵，極大地干擾了蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象[17-18]，也使得蛋白質(zhì)解折疊，發(fā)生不可逆的聚集反應(yīng)，如經(jīng)歐姆加熱（50 ℃）處理后的蝦殼內(nèi)膠原蛋白的部分α-螺旋缺失，酰胺I帶峰藍(lán)移，使得蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定[19]；大豆蛋白組分發(fā)生熒光猝滅且最大發(fā)射波長發(fā)生紅移，改變了蛋白質(zhì)的三級(jí)構(gòu)象[20]；歐姆加熱處理乳鐵蛋白，更高的溫度導(dǎo)致反應(yīng)性（未折疊）球狀蛋白質(zhì)分子數(shù)量增加，分子結(jié)構(gòu)局部展開，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度升高，三級(jí)構(gòu)象發(fā)生變化，從而提高蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)碰撞頻率，有利于蛋白質(zhì)聚集[21]；在相對(duì)較高的溫度（60 ℃）下，β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-lg）分子經(jīng)歷變性和構(gòu)象轉(zhuǎn)換，暴露出疏水基團(tuán)和游離巰基基團(tuán)，而游離巰基可與共價(jià)二硫鍵發(fā)生交換反應(yīng)，并在非共價(jià)相互作用下產(chǎn)生較大的β-lg聚集體，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降和濁度上升[22]；利用TEM進(jìn)行的研究也證實(shí)了歐姆加熱（90 ℃，5 min）和中等電場(chǎng)處理（3 V/cm）可使蛋白質(zhì)以更無序的方式發(fā)生聚集，并使凝膠產(chǎn)生了更均勻和緊湊的結(jié)構(gòu)，這說明凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成與歐姆加熱和中等電場(chǎng)強(qiáng)度的大小有關(guān)[23]。綜上所述，歐姆加熱過程中產(chǎn)生的電流可干擾蛋白質(zhì)的靜電相互作用[24]，使蛋白質(zhì)拉伸；或者是電場(chǎng)以一種非常獨(dú)特的方式影響疏水核或局部蛋白質(zhì)的疏水性基團(tuán)，使疏水基團(tuán)暴露，干擾蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象，導(dǎo)致分子之間不同形式的聚合或展開[22]，從而形成較大的聚集體，使得溶解度等功能特性發(fā)生變化。

表1 歐姆加熱對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effect of ohmic heating on multiscale protein structure

歐姆加熱是一種較成熟的加工方式，應(yīng)用于食品加工過程中還存在一些問題：1）加熱速度難以控制；2）對(duì)于不導(dǎo)電、水分極低干燥的物料無法加工；3）加熱時(shí)容易時(shí)使物料黏附在電極表面，影響加熱效率。因此，后續(xù)應(yīng)擴(kuò)大歐姆加熱的使用范圍并且實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控溫；避免物料接觸電極表面，對(duì)設(shè)備造成影響。目前已有研究使用歐姆加熱技術(shù)對(duì)冷凍食品（金槍魚）進(jìn)行解凍，探究其解凍過程中品質(zhì)的變化[25]，未來可進(jìn)一步探究其在解凍時(shí)蛋白質(zhì)的變化（變性和氧化）及作用機(jī)制。

2 靜電場(chǎng)對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

靜電場(chǎng)技術(shù)是一種新型的食品加工技術(shù)，其可根據(jù)輸出電壓可將靜電場(chǎng)分為高壓靜電場(chǎng)（high-voltage electrostatic field，HVEF）（＞2.5 kV）和低壓靜電場(chǎng)（low voltage electrostatic field，LVEF）（≤2.5 kV）[26]。HVEF的輸出電壓很高，可以通過非熱力系統(tǒng)避免熱量對(duì)食品風(fēng)味、顏色和營養(yǎng)價(jià)值的不利影響[27]。與傳統(tǒng)解凍相比，在質(zhì)量變化最小且能耗較低的情況下，可以縮短冷凍食品的解凍時(shí)間，但其存在安全隱患，難以應(yīng)用于大規(guī)模肉類加工[28]；LVEF技術(shù)通過靜電板產(chǎn)生靜電場(chǎng)再經(jīng)變壓器升壓產(chǎn)生直流電壓，避免了物料與放電板的直接接觸，提升了安全性能[26]。

靜電場(chǎng)技術(shù)對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化影響如表2所示。Jia Guoliang等先后利用不同電壓的HVEF對(duì)豬肉和兔肉進(jìn)行解凍處理，發(fā)現(xiàn)HVEF可使蛋白質(zhì)發(fā)生降解或聚集，使得溶解度和α-螺旋含量下降，而在－20 kV時(shí)變化較小，并保持了良好的持水能力（water holding capacity，WHC）[29]；且HVEF解凍豬肉對(duì)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量和β-折疊的移位影響較小[30]。有研究認(rèn)為在電暈放電和帶電離子流的影響下，針電極數(shù)量較少時(shí)，MP中的非共價(jià)相互作用發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)鏈展開，比表面積增加，粒徑減小[31]；且HVEF解凍后的牛肉樣品表面更光滑，纖維之間的間隙更小，凝膠強(qiáng)度更高，并認(rèn)為這與凈表面電荷和蛋白質(zhì)鏈之間的靜電排斥力有關(guān)[32]。而對(duì)于LVEF來說，LVEF能促進(jìn)MP在解凍過程中的復(fù)性，使得表面疏水性降低，溶解度隨時(shí)間延長顯著增加，并且觀察到纖維束之間的間隙更窄，肌肉微觀結(jié)構(gòu)更完整[28]。此外有研究認(rèn)為由于LVEF在冷凍過程中誘導(dǎo)形成了小冰晶，有利于形成更緊密的肌纖維束，能夠減輕冷凍過程中牛肉橫切面的微觀結(jié)構(gòu)損傷[33]；李俠等利用LVEF輔助凍結(jié)-解凍牛肉MP，研究樣品與靜電場(chǎng)發(fā)生裝置間距離對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-轉(zhuǎn)角含量顯著下降，并向α-螺旋和β-折疊轉(zhuǎn)變，而距離靜電場(chǎng)發(fā)生裝置30 cm處，更有利于維持牛肉MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[34]。

表2 靜電場(chǎng)對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of electrostatic field on multiscale protein structure

靜電場(chǎng)技術(shù)主要集中在對(duì)肉制品冷凍-解凍方面，而HVEF技術(shù)存在電壓高、缺乏安全性、對(duì)貯藏環(huán)境要求高、操作復(fù)雜等問題，很難大規(guī)模應(yīng)用，而LVEF技術(shù)則不存在實(shí)際操作中的安全性問題。因此，應(yīng)通過調(diào)整靜電場(chǎng)設(shè)備的加工強(qiáng)度和針電極數(shù)量以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用。近幾年研究的DENBA+靜電波技術(shù)可將電壓控制在3 500 V以下，提升了安全性，目前已初步應(yīng)用于冰箱等冷凍/冷藏設(shè)備，但還需對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入探究。

1.3療效判斷標(biāo)準(zhǔn) 顯效:各項(xiàng)生理指標(biāo)降至正常范圍,臨床癥狀消失;有效:各項(xiàng)生理指標(biāo)降至治療前的50%以下,臨床癥狀有所改善;無效:各項(xiàng)生理指標(biāo)降低幅度<50%,臨床癥狀改善不明顯甚至無改善。

3 微波對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

3.1 微波加熱

微波加熱已成為現(xiàn)代工業(yè)食品加工中的常用方法。微波是一種頻率在300 MHz～300 GHz之間變化的電磁波。微波加熱的原理是由材料吸收微波能量并將其轉(zhuǎn)化為熱。食品材料的微波加熱主要是通過雙極化和離子傳導(dǎo)，與傳統(tǒng)加熱相比，微波加熱速度更快、作用更均勻、能耗更少、效率更高、整體更環(huán)保[35]。

不同的微波加熱條件對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有明顯的影響。研究表明，經(jīng)微波加熱處理的蛋白質(zhì)溶解度隨著微波功率的升高呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，但隨著微波功率的增加，發(fā)泡性和乳化性能略有增加[36-37]。微波加熱可以通過斷裂蛋白質(zhì)的非共價(jià)鍵（氫鍵、離子鍵等），使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的疏水基團(tuán)，從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[38-39]。如：微波加熱使雞肉肌球蛋白的二硫鍵與蛋白質(zhì)分子間巰基互相結(jié)合，導(dǎo)致二硫鍵含量升高，并發(fā)生解折疊，使分子內(nèi)部基團(tuán)暴露，發(fā)生交聯(lián)，引起溶液濁度增加[40]；大米蛋白的二硫鍵因微波加熱而斷裂，導(dǎo)致游離巰基含量增加[41]；微波加熱處理米糠蛋白降低了α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)含量，并使蛋白質(zhì)分子之間相互吸引，重新形成聚集體，增強(qiáng)水合作用，從而提高蛋白質(zhì)的溶解度[42]。且微波加熱產(chǎn)生的交變電場(chǎng)會(huì)產(chǎn)生撕裂效應(yīng)，這利于肌球蛋白分子在較高溫度下展開，有助于肌球蛋白聚集，從而改善凝膠化過程，原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）下觀察到的圖像證實(shí)了這一點(diǎn)[43]；凝膠電泳圖譜和SEM分析表明，經(jīng)微波加熱處理后的MP凝膠具有良好的凝膠性能和緊密的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，這是由于在微波加熱過程中可以通過控制二硫鍵和疏水氨基酸的生成，抑制組織蛋白酶在MP凝膠上的降解[44]。微波加熱預(yù)處理（700 W、1 min）可以降低游離巰基含量，進(jìn)而影響二硫鍵的形成，并且暴露出更多的疏水基團(tuán)，使得溶解度降低，凝膠強(qiáng)度升高[45]；并且溫和的微波加熱預(yù)處理可以提升肌球蛋白的拉伸性，穩(wěn)定有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并增強(qiáng)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)疏水相互作用和蛋白質(zhì)-水氫鍵結(jié)構(gòu)，防止嚴(yán)重變性和聚集，且隨著處理強(qiáng)度的增加和溫度的升高，肌球蛋白的平均粒徑顯著增加，用300～400 W微波處理加熱至80 ℃后，粒徑分布的第一峰消失，表明可溶性蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象輕度改變有助于形成更規(guī)則的間隔排列，使所有小結(jié)構(gòu)都聚集成高分子質(zhì)量化合物[46]。SEM和CLSM觀察結(jié)果也表明，經(jīng)過微波加熱協(xié)同常規(guī)加熱進(jìn)行處理得到的魚糜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊湊[47]；使用微波（2 450 MHz）對(duì)厚度為2.0 cm的魚糜進(jìn)行加熱，發(fā)現(xiàn)可形成有序且致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并且具有更高的凝膠性能（16.42 MPa）和保水性（73.59%）[48]。

而且微波加熱的非熱效應(yīng)也可能對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響最終會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能特性的改變。如微波加熱后磨碎牛肉樣品的溫度低于常規(guī)加熱組，并且由于聚集β-折疊結(jié)構(gòu)含量較高，過渡偶極耦合增加，這一結(jié)果反映出微波加熱對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的非熱效應(yīng)[49]；使用微波加熱至50 ℃以上，β-乳球蛋白的α-螺旋和β-折疊含量都比常規(guī)加熱降低得更快，此外，熒光光譜峰值波長的紅移表明β-乳球蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化[50]；因此說明除了熱效應(yīng)外，微波加熱的非熱效應(yīng)也可能破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響其功能特性。然而，到目前為止，微波加熱非熱效應(yīng)與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)演變的相關(guān)性并不明確，主要原因是缺乏能夠精確控制加熱速率或模擬加工過程的設(shè)備和方法；并且現(xiàn)在行業(yè)主流認(rèn)為，工業(yè)生產(chǎn)使用的微波加熱技術(shù)并不考慮非熱效應(yīng)。

3.2 微波解凍

目前冷凍保藏是肉及肉制品貯運(yùn)保鮮最重要的方式，肉制品品質(zhì)的優(yōu)劣不僅取決于冷凍保鮮技術(shù)，還取決于解凍技術(shù)[51]，而微波解凍就是常用的解凍技術(shù)之一。微波解凍是利用微波能將冷凍品進(jìn)行穿透性迅速加熱，使原料肉內(nèi)外同步解凍并升溫至不滴水的狀態(tài)[52]。微波解凍具有速度快、均勻度高且對(duì)肌肉組織損傷少等優(yōu)點(diǎn)[53]，同時(shí)也伴隨著原料肉局部過熱的現(xiàn)象[52]。

微波解凍對(duì)蛋白質(zhì)變化的影響如表3所示。Wang Bo等[54-55]先后報(bào)道了使用微波解凍后豬背最長肌結(jié)構(gòu)和功能的變化，蛋白質(zhì)分子發(fā)生解折疊，產(chǎn)生聚集反應(yīng)，使得濁度增加，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，凝膠粗糙度增加，并認(rèn)為蛋白質(zhì)的聚集性與凝膠表面粗糙度呈正相關(guān)，一方面是微波加熱的瞬時(shí)高溫導(dǎo)致豬背最長肌局部過熱，削弱了分子間的氫鍵，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，熒光紅移與局部過熱或固有的不均勻解凍有關(guān)，這表明解凍樣本中的蛋白質(zhì)氧化程度相對(duì)較高，并促進(jìn)了蛋白質(zhì)的展開；另一方面是由于解凍通過異構(gòu)化和烯化促進(jìn)了酪氨酸自由基的交聯(lián)使得蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基變化，二酪氨酸含量的增加證實(shí)了這一點(diǎn)。微波會(huì)引起蛋白質(zhì)氧化和次級(jí)鍵斷裂，使內(nèi)部的極性基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)原有結(jié)構(gòu)被破壞[55]，如：500 W微波解凍魷魚后其總巰基含量下降程度較小，氧化程度降低[56]；使用微波對(duì)鯉魚進(jìn)行凍融實(shí)驗(yàn)，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，總巰基含量呈下降趨勢(shì)，說明由于二硫鍵的形成或降解，導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞[57]。微波解凍會(huì)使蛋白質(zhì)通過共價(jià)作用和疏水相互作用形成膠束，最終形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)[58]。如：微波解凍冰蛋黃后α-螺旋相對(duì)含量減少并向其他結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，使二級(jí)結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，且β-轉(zhuǎn)角含量越高，溶解性越強(qiáng)；且解凍過程中粒徑的增加是由于聚集體的形成，主要是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中氫鍵或靜電鍵的熱損傷所造成的[58]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，單一的微波解凍效果較差，而使用微波聯(lián)合遠(yuǎn)紅外解凍可以維持鱸魚MP的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[59]，并且經(jīng)微波和超聲協(xié)同微波解凍處理的魚類樣品利用SEM觀察可見組織幾乎沒有裂紋和氣孔，并且肌肉膜結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，與新鮮樣品沒有顯著差異[60]。微波解凍會(huì)使物料迅速融化，使得物料的表面溫度迅速降低，出現(xiàn)局部過熱的現(xiàn)象，微波場(chǎng)中食品的溫度難以測(cè)定，不利于把握解凍時(shí)間、控制食品品質(zhì)[52]。因此，后續(xù)的設(shè)備應(yīng)注重物料解凍時(shí)的均勻加熱和對(duì)過程中溫度的精準(zhǔn)把控。

表3 微波處理對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effect of microwave treatment on multiscale protein structure

4 射頻對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

射頻（1～300 MHz）是非電離電磁波，原理是由于偶極子分子旋轉(zhuǎn)的極化機(jī)制和直接傳導(dǎo)效應(yīng)，在介電材料中產(chǎn)生體積熱，從而形成快速均勻的加熱過程[65]。與傳統(tǒng)加熱相比，其設(shè)備成本高，但能耗低[66]；與歐姆加熱不同，射頻能量可以穿透?jìng)鹘y(tǒng)的紙板或塑料包裝，且產(chǎn)品和電極之間沒有任何接觸；與微波相比，射頻能量可以深入到樣品中，更適合處理大尺寸和大塊材料[67]。

在不同的處理?xiàng)l件下，射頻對(duì)蛋白質(zhì)有明顯的影響（表4）。有研究表明，射頻加熱時(shí)由于高頻電場(chǎng)引起物料分子內(nèi)和原子間的摩擦，二硫鍵、氫鍵以及靜電相互作用遭到破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的疏水性氨基酸，并增強(qiáng)水合作用，最終導(dǎo)致溶解度、乳化性、起泡能力以及熱穩(wěn)定性提高[68]。經(jīng)射頻加熱后，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)之間發(fā)生了相互轉(zhuǎn)換，如：射頻加熱誘導(dǎo)了大豆分離蛋白從無規(guī)卷曲到β-折疊的自組裝[69]；射頻處理（100 mm）豬肉MP誘導(dǎo)了其從β-折疊到α-螺旋的自組裝[70]；射頻處理后（140 mm），草魚MP凝膠的部分α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲，使蛋白質(zhì)完全展開，內(nèi)部基團(tuán)通過疏水相互作用和二硫鍵交聯(lián)，形成清晰光滑的凝膠[71]。蛋白質(zhì)的不同類型和狀態(tài)以及不同的射頻加熱方法都會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其功能特性，而主要的影響因素是最終溫度和電極間隙。無論電極間隙如何，隨著處理溫度的升高，米糠分離蛋白的熒光強(qiáng)度降低，大豆分離蛋白紫外吸收強(qiáng)度降低，表面疏水性的增加，證實(shí)了射頻處理可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子部分展開，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集和交聯(lián)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化[67,69]。在相同的最終溫度（90 ℃）下，隨著射頻電極間隙的增大，其功能特性以及熱穩(wěn)定性逐漸增加，并在200 mm時(shí)達(dá)到最高值，此時(shí)巰基含量和表面疏水性最大[68]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，無論是二級(jí)結(jié)構(gòu)還是三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，磁納米協(xié)同射頻處理樣品都更接近于新鮮樣品，使樣品均勻解凍，縮短解凍時(shí)間，可減少對(duì)樣品結(jié)構(gòu)的損傷，提高解凍后魚蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[72]。

表4 射頻對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響Table 4 Effect of RF on multiscale protein structure

目前射頻技術(shù)的應(yīng)用主要集中在熱處理、滅菌及解凍等領(lǐng)域，其雖然具有一定的優(yōu)勢(shì)，但還具有一定程度的加熱不均勻問題，且由于設(shè)備投資費(fèi)用高等原因還未進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用。若能從設(shè)備著手調(diào)整適合的電極間隙以提升溫度分布的均勻性，射頻技術(shù)將更能適應(yīng)目前的加工環(huán)境。射頻與其他技術(shù)協(xié)同對(duì)食品進(jìn)行加工也是一個(gè)新的研究方向，如磁性納米協(xié)同微波或射頻、射頻加熱聯(lián)合鹽水解凍和射頻加熱協(xié)同磁場(chǎng)等。

5 磁場(chǎng)對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

磁場(chǎng)是一種看不見、摸不著但真實(shí)存在的一種物理場(chǎng)，分為時(shí)變磁場(chǎng)和穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)兩種[73]。低頻磁場(chǎng)（low frequency magnetic field，LF-MF）（＜300 Hz）屬于時(shí)變磁場(chǎng)也屬于感應(yīng)磁場(chǎng)，其不依靠空間傳遞能量，由電壓和電流產(chǎn)生感應(yīng)電場(chǎng)和感應(yīng)電流來形成磁場(chǎng)[74]；直流磁場(chǎng)（direct current magnetic field，DC-MF）（＜400 mT）屬于穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)，是向磁場(chǎng)發(fā)生器提供穩(wěn)定的直流電形成磁場(chǎng)[75]。在這類磁場(chǎng)作用過程中食品中水分子會(huì)發(fā)生磁偶極矩，使得氫鍵含量增加，水分子之間的鍵聯(lián)更緊密，形成的網(wǎng)絡(luò)更穩(wěn)定，從而導(dǎo)致熱導(dǎo)率升高和冰點(diǎn)凍結(jié)[76]，達(dá)到加熱或冷凍目的。與常規(guī)方式相比，磁場(chǎng)具有方便、高效、安全、無殘留等特點(diǎn)[77]。磁場(chǎng)在加熱過程中可以實(shí)現(xiàn)快速升溫，在冷凍過程可以形成均勻細(xì)小的冰晶，以此來保護(hù)食品的品質(zhì)屬性（抑制蛋白質(zhì)變性、保持良好的持水力和延緩汁液流失等）[73]。

5.1 低頻磁場(chǎng)

LF-MF可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用，為水分子提供更多的結(jié)合點(diǎn)，并促進(jìn)蛋白質(zhì)展開，促使發(fā)生聚集反應(yīng)，改變凝膠強(qiáng)度和WHC[78]，不同的磁場(chǎng)處理?xiàng)l件對(duì)食品加工中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開有明顯的影響。磁場(chǎng)可以增加肌紅蛋白總游離巰基的暴露量，且磁場(chǎng)強(qiáng)度越高，暴露的總游離巰基越多，這可能是肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的展開或巰基還原為游離巰基造成的[77]；并有研究發(fā)現(xiàn)，隨著LF-MF強(qiáng)度的增加，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，疏水基團(tuán)暴露，氫鍵減弱，導(dǎo)致α-螺旋斷裂，形成β-折疊、無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角[79]。在熱誘導(dǎo)MP變性形成凝膠的過程中，利用LF-MF（9.5 mT、2 ℃/min）進(jìn)行加熱處理，豬肉MP的α-螺旋含量降低，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量增加，使得MP顯示出均勻的微觀結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致WHC增加，且適當(dāng)提高加熱速率有利于縮短MP的加工時(shí)間[80]；采用二段式加熱（9.5 mT）對(duì)草魚MP加熱，發(fā)現(xiàn)在第一階段（40 ℃）的24 h內(nèi)，LF-MF誘導(dǎo)不利于草魚MP的展開，相反，在第二階段（85 ℃），α-螺旋展開和無規(guī)卷曲的形成導(dǎo)致更多內(nèi)部基團(tuán)的暴露，導(dǎo)致離子鍵含量的減少和氫鍵含量的增加[78]；還有研究采用射頻（140 mm、40 ℃、10 min）和磁場(chǎng)（9.5 mT、80 ℃、40 min）代替二段式水浴加熱，發(fā)現(xiàn)在第二階段磁場(chǎng)輔助加熱可能會(huì)增強(qiáng)草魚MP之間的靜電斥力和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，減少α-螺旋含量，為水分子提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，形成結(jié)構(gòu)良好的草魚MP凝膠[81]。pH值也會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)解折疊從而改變二級(jí)結(jié)構(gòu)，在相同pH值（pH 6.0和7.0）下，LF-MF加熱處理（從20 ℃加熱至72 ℃）的凝膠α-螺旋含量更少，β-折疊含量更多，蛋白質(zhì)分子發(fā)生重排，暴露出更多參與氫鍵的水結(jié)合位點(diǎn)，最終使得WHC升高[82]。

綜上所述，在一定的LF-MF下，加熱速率、加熱方式、pH值等均會(huì)影響蛋白質(zhì)分子間的靜電相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子重新有序排列，并提供更多的水分子結(jié)合位點(diǎn)；隨著強(qiáng)度的增加，蛋白質(zhì)分子逐漸展開，暴露出更多的基團(tuán)，且減弱了分子內(nèi)的氫鍵，導(dǎo)致α-螺旋斷裂，使得蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，最終影響蛋白質(zhì)的多尺度結(jié)構(gòu)。

5.2 直流磁場(chǎng)

近幾年的研究表明，使用DC-MF進(jìn)行冷藏/冷凍處理會(huì)使MP發(fā)生去折疊，引起巰基含量和表面疏水性的變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，增強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而改善凝膠的WHC，增加濁度。如Yang Kun等[83-84]先后報(bào)道了磁場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間對(duì)豬肉MP的影響，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)強(qiáng)度磁場(chǎng)處理（3.8 mT）有助于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開，導(dǎo)致更多內(nèi)部酪氨酸基團(tuán)和脂肪族基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)表面，以及一些二硫鍵被破壞，DC-MF處理顯著改善了WHC，在3.8 mT時(shí)達(dá)到了最大值（50.36%），形成更致密、更均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)；并且適度的DC-MF處理（3 h）也可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-水之間的疏水相互作用和水合作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)和聚集，使得濁度增加，并形成牢固的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Wu Di等[85]使用DC-MF在22 ℃下處理低鹽MP，所有處理組的α-螺旋和β-折疊含量均無顯著變化，低鹽溶液抑制MP的展開，進(jìn)一步導(dǎo)致熱誘導(dǎo)的凝膠結(jié)構(gòu)變差、WHC降低；而在低溫（4 ℃）下，DC-MF可以提高低鹽MP凝膠的WHC。綜上所述，DC-MF的磁場(chǎng)強(qiáng)度及處理時(shí)間均會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，都可以使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，使得一些疏水基團(tuán)暴露，增強(qiáng)疏水相互作用和水合作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)和聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，而使用DC-MF在22 ℃下處理低鹽MP，二級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有明顯的變化，說明在低鹽溶液可以抑制蛋白質(zhì)的展開聚集，維持一定的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

5.3 其他

目前，有研究使用2 mT的靜磁場(chǎng)對(duì)冷凍面團(tuán)進(jìn)行凍融處理，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，谷蛋白結(jié)構(gòu)由無序向有序轉(zhuǎn)變，說明磁場(chǎng)處理可以保持貯藏過程中谷蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[86]；使用振蕩均勻磁場(chǎng)（應(yīng)屬交變磁場(chǎng)）對(duì)魚糜進(jìn)行凍融實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在磁場(chǎng)作用下，含鐵離子的凍融魚糜具有較高的熱穩(wěn)定性，且具有較高的持水能力，而變性焓值較低的原因可能是亞鐵離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合導(dǎo)致了魚糜中蛋白質(zhì)的變性，并說明熱穩(wěn)定性與小冰晶的形成有關(guān)[87]。Calabrò等[88]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高頻磁場(chǎng)處理（180 mT、1 750 MHz、20 ℃、4 h）后，牛血清白蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。這種變化是由于磁場(chǎng)引起α-螺旋C＝O和N—H配體的彎曲排列、振動(dòng)和彎曲，導(dǎo)致酰胺I帶含量顯著增加。

磁場(chǎng)對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響匯總?cè)绫?所示。

表5 磁場(chǎng)對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響Table 5 Effect of magnetic field on multiscale protein structure

綜上所述，磁場(chǎng)的作用效果與pH值、場(chǎng)強(qiáng)和作用時(shí)間等條件相關(guān)，合適的條件對(duì)食品的加工效果有明顯的影響，與LF-MF不同的是，DC-MF處理低鹽MP，其二級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有明顯變化，且仍具有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。因此，需要對(duì)磁場(chǎng)的條件進(jìn)行更系統(tǒng)的研究，并探索其作用機(jī)制。目前關(guān)于磁場(chǎng)與食品加工的研究還處在初期階段，因食品的千變?nèi)f化，其磁場(chǎng)的具體參數(shù)也并不穩(wěn)定，因此，還需要更多的研究確定一個(gè)合適的磁場(chǎng)參數(shù)。目前所擁有的磁場(chǎng)設(shè)備還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，需進(jìn)一步研發(fā)適合工業(yè)化生產(chǎn)的設(shè)備。

6 結(jié)語

電物理加工（歐姆加熱、靜電場(chǎng)、微波、射頻、磁場(chǎng)）作為一類新型的食品加工技術(shù)，與傳統(tǒng)加工方式相比，不僅能縮短加工時(shí)間、節(jié)能環(huán)保，還能在一定程度上減少蛋白質(zhì)損傷，改善食品品質(zhì)，具有良好的應(yīng)用前景。不同的電物理加工技術(shù)都會(huì)使多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如MP纖維間隙更為緊湊；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)象α-螺旋在加工過程中被破壞，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降；色氨酸等殘基暴露，蛋白質(zhì)分子之間產(chǎn)生靜電相互作用，蛋白質(zhì)分子拉伸、修飾或解折疊，從而發(fā)生不可逆的聚集反應(yīng)和交聯(lián)形成聚集體，而聚集體大小、形態(tài)等因素最終影響功能特性。本研究綜述了新型電物理加工技術(shù)對(duì)多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的影響，以期為新一代電物理加工的戰(zhàn)略構(gòu)想和進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化提供理論參考。

然而，電物理加工過程中，多尺度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化還受很多因素影響，如鹽分、pH值、電極間隙、升溫速率、溫度和作用時(shí)間等，值得更深入研究，尤其是不同加工技術(shù)的具體作用機(jī)制。電物理加工技術(shù)也顯現(xiàn)出一些不足，如適用性低、加熱不均勻和設(shè)備費(fèi)用高、無法大規(guī)模生產(chǎn)等，需要進(jìn)一步優(yōu)化電物理加工的設(shè)備和工藝參數(shù)等，以達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的適當(dāng)控制，提高產(chǎn)品品質(zhì)。此外，盡管最近的研究趨勢(shì)偏向于各種電物理加工技術(shù)和各種非熱加工技術(shù)，但是也不能忽略傳統(tǒng)的加熱、冷凍、解凍等方法的可能性和固有優(yōu)勢(shì)，同時(shí)在工業(yè)化應(yīng)用過程中，也不能排除電物理加工技術(shù)產(chǎn)生有害副產(chǎn)物的可能性。