陳年武夷巖茶對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的緩解作用及腸道菌群的影響

曾鴻哲，方雯雯，周 方，唐靜怡，岳 林，歐陽(yáng)建，陳金華，王英姿，黃建安，劉仲華

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物基因資源評(píng)價(jià)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一類常見(jiàn)的慢性胃腸道疾病，包括克羅恩病（Crohn’s disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）[1-2]，其中UC最為常見(jiàn)。在過(guò)去的30 年內(nèi)，IBD發(fā)病率在全球呈上升趨勢(shì)，尤其在發(fā)達(dá)國(guó)家表現(xiàn)明顯[3-4]。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠是一個(gè)被廣泛使用的模型，其主要特征是小鼠體質(zhì)量減輕、腹瀉、便血、結(jié)腸長(zhǎng)度縮短、炎癥標(biāo)志物表達(dá)水平增加和腸道菌群紊亂等[5-7]。IBD復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制和多種環(huán)境因素的干擾[8]對(duì)于設(shè)計(jì)有效的IBD治療方法是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)，考慮到目前治療IBD中存在的困難，通過(guò)飲食干預(yù)等措施降低IBD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)變得尤為重要。目前的研究表明，腸道菌群紊亂包括某些保護(hù)性細(xì)菌（如Akkermansia）數(shù)量的減少或致病細(xì)菌（如Escherichia）數(shù)量的增加等，從而導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生[9-10]。近年來(lái)，有研究進(jìn)一步證明IBD特征腸道菌群的出現(xiàn)先于IBD的發(fā)病[11]，因此，腸道菌群可作為預(yù)測(cè)IBD發(fā)生以及評(píng)價(jià)IBD治療效果的重要指標(biāo)。

武夷巖茶是中國(guó)傳統(tǒng)名茶，因其獨(dú)特的“巖骨花香”而聞名于世，屬于半發(fā)酵的烏龍茶類。長(zhǎng)期的民間飲用實(shí)踐表明，武夷巖茶具有調(diào)理腸胃不適、緩解腹瀉等作用[12]，但目前還鮮見(jiàn)武夷巖茶對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎影響的相關(guān)研究報(bào)道。近年來(lái)，隨著我國(guó)茶葉產(chǎn)量不斷提高，茶產(chǎn)業(yè)供過(guò)于求的趨勢(shì)不斷加劇，大量茶葉因未能及時(shí)銷售而被存放，成為陳茶。在貯藏過(guò)程中[13]，茶葉中的茶多酚等功能成分的含量發(fā)生了變化。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了2 種不同年份（2001年、2011年）的陳年武夷巖茶和1 種非陳年武夷巖茶（2020年），通過(guò)建立DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型，評(píng)估陳年武夷巖茶對(duì)小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)特征、結(jié)腸炎性細(xì)胞水平、血清炎癥因子水平和腸道菌群的影響，以期為通過(guò)健康屬性驅(qū)動(dòng)陳年武夷巖茶的科學(xué)消費(fèi)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

50 只SPF級(jí)6～7 周齡雌性C57BL/6JGpt小鼠購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0008。

武夷巖茶（2001年大紅袍、2011年大紅袍和2020年大紅袍）由福建武夷山市茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心提供，為同一茶樹(shù)品種、同一級(jí)別的鮮葉原料加工精制而成，包裝后貯存于干燥、無(wú)異味、清潔、陰涼的茶葉貯存室中，環(huán)境溫度常年控制在25 ℃以內(nèi)，相對(duì)濕度控制在50%以內(nèi)。

白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等酶聯(lián)免疫分析試劑盒（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司；DSS購(gòu)于美國(guó)MP Biomedicals公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)分析儀 深圳市匯松科技發(fā)展有限公司；ECLIPSE Ci正置顯微鏡 日本尼康公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（polymerase chain reaction，PCR） 美國(guó)賽默飛公司；NovaSeq6000測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 武夷巖茶提取物的制備及灌胃劑量的選擇

武夷巖茶提取物制備：稱取25 g茶樣，加入500 mL的沸水，在100 ℃水浴中提取45 min，過(guò)濾后，重復(fù)提取茶樣30 min，將濾液合并后冷凍干燥。將制備的武夷巖茶提取物按照每天450 mg/kgmb的劑量灌胃小鼠，根據(jù)體表面積歸一化方法按式（1）推算[14-15]，灌胃劑量相當(dāng)于人體每日約飲茶7.8 g，一般而言，武夷巖茶每泡茶為8 g，這相當(dāng)于每人每天喝1 泡茶，在合理范圍內(nèi)。

式中：D為灌胃劑量（0.45 g/kgmb）；m為人體質(zhì)量（60 kg）；C為換算系數(shù)（12.33）；R為浸提率（28%）。

1.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：[倫審科2021第（2138）號(hào)]，動(dòng)物房溫度24～26 ℃，12 h/12 h明暗循環(huán)，小鼠自由飲水進(jìn)食。

50 只雌性C57BL/6JGpt小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，以每組10 只隨機(jī)均分為5 組：正常對(duì)照組（Control）；DSS模型組；DSS+OT01組（灌胃20 年陳茶即2001年武夷巖茶提取物）；DSS+OT11組（灌胃10 年陳茶即2011年武夷巖茶提取物）；DSS+OT20組（灌胃非陳茶即2020年武夷巖茶提取物）。除對(duì)照組之外，其他組通過(guò)連續(xù)7 d采用在飲水中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% DSS的方法構(gòu)建小鼠建立腸炎模型[7,16]，所有小鼠在處死前的最后2 d飲用蒸餾水。DSS+OT01組、DSS+OT11組和DSS+OT20組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中接受劑量為450 mg/kgmb武夷巖茶的干預(yù)，共持續(xù)9 d。每天監(jiān)測(cè)小鼠結(jié)腸炎癥狀，包括糞便特征、出血狀況和體質(zhì)量情況。解剖后，收集結(jié)腸組織、盲腸內(nèi)容物和血清并貯存以便后續(xù)分析。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 武夷巖茶提取物的化學(xué)成分分析

武夷巖茶提取物的成分測(cè)定：依據(jù)GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》進(jìn)行茶多酚總質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，采用高效液相色譜法[17]檢測(cè)6 種兒茶素組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)；根據(jù)系統(tǒng)分析法測(cè)定茶三素（茶黃素類（theaflavins，TFs）、茶紅素類（thearubigins，TRs）和茶褐素（theabrownine，TB））質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3.2 實(shí)驗(yàn)小鼠日常指標(biāo)觀測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)[18-19]描述的方法觀測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠的日常指標(biāo)，按動(dòng)物體質(zhì)量下降率（大于15%為4 分，10%～15%為3 分，5%～10%為2 分，1%～5%為1 分，體質(zhì)量不變?yōu)? 分）、糞便黏稠度（腹瀉為4 分，糞便松散為2 分，正常為0 分）和糞便出血（顯性出血為4 分，隱性出血陽(yáng)性為2 分，正常為0 分）情況進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。以上述各項(xiàng)評(píng)分為相應(yīng)指數(shù)，按式（2）計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）。

1.3.3.3 實(shí)驗(yàn)小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)分析

首先取小鼠結(jié)腸組織并固定在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定液中，包埋之后做切片，使用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色。根據(jù)文獻(xiàn)[7,20]描述的方法進(jìn)行組織病理學(xué)分析及結(jié)腸炎癥相關(guān)組織學(xué)評(píng)分（表1）。

表1 結(jié)腸炎癥相關(guān)組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for evaluation of inflammation-associated cecal histological changes

1.3.3.4 實(shí)驗(yàn)小鼠血清和結(jié)腸炎癥因子檢測(cè)

小鼠眼珠取血后，室溫靜止2 h后，4 ℃離心1 次（3 500 r/min、15 min），收集血清，置于－80 ℃冰箱保存。取50 mg結(jié)腸組織，用1×磷酸鹽緩沖液洗去血污。剪成小塊放入組織研磨器（勻漿管）中，加入0.5 mL 1×磷酸鹽緩沖液，制成勻漿，然后置于－20 ℃過(guò)夜。經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融2 次處理破壞細(xì)胞膜后，將組織勻漿于2～8 ℃、5 000×g條件下離心5 min并取上清液。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組小鼠血清和結(jié)腸炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。

1.3.3.5 小鼠盲腸內(nèi)容物菌群分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，取適量樣品用無(wú)菌水稀釋至1 ng/μL，選擇V3～V4高變區(qū)作為目標(biāo)測(cè)序區(qū)，正向引物為341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’），反向引物為806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）。構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)，合格后使用NovaSeq6000測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，序列分析通過(guò)QIIME2軟件包進(jìn)行[21]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組比較應(yīng)用方差分析法，運(yùn)用Tukey檢驗(yàn)兩兩比較，當(dāng)P＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 陳年武夷巖茶水提物主要成分含量分析結(jié)果

陳年武夷巖茶水提物的主要成分含量如表2所示。茶多酚、兒茶素總量、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表沒(méi)食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表兒茶素（epicatechin，EC）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）和兒茶素（catechin，DL-C）質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)整體呈下降趨勢(shì)；TB質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)整體上升趨勢(shì)；此外，TFs和TRs質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢(shì)。

表2 陳年武夷巖茶提取物主要成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Contents of phenolic components in infusion of aged Wuyi rock tea

2.2 小鼠的體質(zhì)量、腹瀉評(píng)分和DAI變化

小鼠的體質(zhì)量變化情況如圖1A所示，實(shí)驗(yàn)前期，小鼠的體質(zhì)量變化較為穩(wěn)定。從第5天開(kāi)始，經(jīng)過(guò)DSS處理的4 組小鼠體質(zhì)量開(kāi)始下降，其中DSS組體質(zhì)量下降最為明顯；經(jīng)過(guò)9 d的武夷巖茶干預(yù)后，DSS+OT11組和DSS+OT20組小鼠體質(zhì)量均與DSS組出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第9天）各組小鼠的腹瀉程度如圖1B所示，Control組小鼠均未出現(xiàn)腹瀉情況，與經(jīng)過(guò)DSS處理的4 組小鼠有顯著差異（P＜0.05）；DSS組小鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉情況，與經(jīng)過(guò)陳年武夷巖茶干預(yù)的2 組小鼠有顯著差異（P＜0.05）。小鼠的疾病嚴(yán)重程度變化如圖1C所示，由于DSS引發(fā)的腸道炎癥反應(yīng)，小鼠糞便從第3天開(kāi)始呈松散狀；到第4天，糞便開(kāi)始隱性出血，并隨著DSS處理時(shí)間的延長(zhǎng)；到第6天糞便已無(wú)具體形態(tài)，并且部分小鼠有明顯糞便帶血和輕微的脫肛現(xiàn)象；小鼠經(jīng)過(guò)DSS處理和陳年武夷巖茶干預(yù)后，腹瀉情況和便血情況得到顯著緩解（P＜0.05）。雖然陳年武夷巖茶干預(yù)能夠一定程度緩解DSS帶來(lái)的不良反應(yīng)，但是綜合來(lái)看，緩解效果DSS+OT11組≈DSS+OT20組＞DSS+OT01組。

圖1 陳年武夷巖茶對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量、腹瀉評(píng)分及DAI的影響Fig.1 Effect of aged Wuyi rock tea on body mass,diarrhea score and DAI of mice with DSS-induced colitis

2.3 陳年武夷巖茶對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸的影響

如圖2A和圖2B所示，DSS組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度較Control組顯著縮短（P＜0.05）；陳年武夷巖茶干預(yù)的2 組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度有所恢復(fù)，并與模型組相比差異顯著（P＜0.05），但DSS+OT20組結(jié)腸長(zhǎng)度恢復(fù)情況最好，與Control組相比基本恢復(fù)正常。圖2C的H&E染色結(jié)果表明，陳年武夷巖茶干預(yù)能夠緩解DSS引起的腸道黏膜、隱窩損壞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；基于H&E染色的結(jié)腸炎癥組織學(xué)評(píng)分進(jìn)一步顯示，陳年武夷巖茶干預(yù)的效果有所不同，其中DSS+OT20組與DSS+OT11組效果接近，且優(yōu)于DSS+OT01組（圖2D）。

圖2 陳年武夷巖茶對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度、結(jié)腸組織學(xué)和炎癥相關(guān)組織學(xué)評(píng)分的影響Fig.2 Effect of aged Wuyi rock tea on colon length,colon histology and inflammation-associated histological score of mice with DSS-induced colitis

2.4 陳年武夷巖茶對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠炎癥因子的影響

由圖3可知，與Control組相比，DSS組血清和結(jié)腸中的IL-6、TNF-α和IL-1β水平都顯著提高（P＜0.05）；與DSS組相比，經(jīng)過(guò)武夷巖茶干預(yù)的3 組小鼠血清和結(jié)腸中的IL-6、TNF-α和IL-1β水平都呈不同程度地顯著下降（P＜0.05），其中DSS+OT01組血清中的TNF-α水平，DSS+OT11組血清中的TNF-α、IL-1β水平，DSS+OT20組血清中的TNF-α、IL-1β水平，DSS+OTs結(jié)腸中的IL-6、TNF-α水平均恢復(fù)正常。綜合來(lái)看，對(duì)炎癥因子影響效果DSS+OT11組≈DSS+OT20組＞DSS+OT01組。

2.5 陳年武夷巖茶對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠腸道菌群的影響

2.5.1 陳年武夷巖茶對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

微生物對(duì)于結(jié)腸炎的發(fā)展至關(guān)重要，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群改善結(jié)腸炎是目前的研究熱點(diǎn)[22]。因此，本研究利用實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集的盲腸內(nèi)容物進(jìn)行了16S rDNA的V3～V4區(qū)PCR擴(kuò)增后測(cè)序，以檢測(cè)腸道微生物的變化。由圖4A和圖4B可知，與DSS組相比，陳年武夷巖茶干預(yù)組的Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如圖4C所示，主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示不同組間微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯差異，陳年武夷巖茶干預(yù)使DSS誘導(dǎo)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)向Control組變化。

圖4 陳年武夷巖茶對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠腸道微生物區(qū)系組成的影響Fig.4 Effect of aged Wuyi rock tea on gut microbiota composition of mice with DSS-induced colitis

圖5A～C反映了腸道微生物在門、科、屬3 個(gè)層面的相對(duì)豐度，以區(qū)分微生物類群。如圖5A所示，小鼠腸道微生物主要由5 個(gè)門組成，包括Firmicutes、Bacteroidetes、Verrucomicrobia、Proteobacteria和Deferribacteres。與Control組相比，DSS組的Proteobacteria和Deferribacteres的相對(duì)豐度增加，而Firmicutes、Bacteroidetes和Verrucomicrobia的相對(duì)豐度降低。在科水平上，與Control組相比，DSS組的Enterobacteriaceae、Rikenellaceae和Deferribacteraceae的相對(duì)豐度增加，而Verrucomicrobiaceae、Odoribacteraceae和Coriobacteriaceae的相對(duì)豐度降低（圖5B）。在屬水平上，與Control組相比，DSS組的Unspecified_Enterobacteriaceae、Oscillospira、Unspecified_Rikenellaceae、Unspecified_Bacteroidales、Mucispirillum、Unspecified_Desulfovibrionaceae、Escherichia、Parabacteroides、Enterococcus和Alistipes的相對(duì)豐度增加，而Akkermansia、Odoribacter、Desulfovibrio和Adlercreutzia的相對(duì)豐度降低（圖5C），陳年武夷巖茶干預(yù)明顯影響了腸道菌群的構(gòu)成，特別是逆轉(zhuǎn)了DSS導(dǎo)致的Verrucomicrobia、Proteobacteria、Enterobacteriaceae、Verrucomicrobiaceae、Odoribacteraceae、Unspecified_Enterobacteriaceae、Oscillospira、Unspecified_Bacteroidales、Escherichia、Enterococcus、Akkermansia和Odoribacter相對(duì)豐度變化。新型的元基因組學(xué)分析方法線性判別分析效應(yīng)大?。╨inear discriminate analysis size effect，LefSe）分析（圖5D）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）（圖5E）顯示了各組中的優(yōu)勢(shì)菌群，F(xiàn)irmicutes、Lachnospiraceae、Desulfovibrionaceae、Ruminococcus、Coprococcus、Desulfovibrio和Roseburia是Control組的優(yōu)勢(shì)菌群；Deferribacteres、Proteobacteria、Ruminococcaceae、Deferribacteraceae、Lactobacillaceae、Enterobacteriaceae、Escherichia、Oscillospira、Mucispirillum、Lactobacillus和Enterococcus是DSS組的優(yōu)勢(shì)菌群；Bacteroidetes、Odoribacteraceae和Odoribacter是DSS+OT01組的優(yōu)勢(shì)菌群；Turicibacteraceae、Turicibacter和AF12是DSS+OT11組的優(yōu)勢(shì)菌群；Verrucomicrobia、Verrucomicrobiaceae和Akkermansia是DSS+OT20組的優(yōu)勢(shì)菌群。

圖5 陳年武夷巖茶對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠腸道微生物相對(duì)豐度及LEfSe分析的影響Fig.5 Effect of aged Wuyi rock tea on the relative abundance of gut microbiota and LEfSe analysis of mice with DSS-induced colitis

2.5.2 特定類群微生物變化與結(jié)腸長(zhǎng)度相關(guān)性分析結(jié)果

在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度往往明顯縮短，結(jié)腸長(zhǎng)度與腹瀉、炎癥因子過(guò)表達(dá)和腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)，而通過(guò)特定的菌株灌胃干預(yù)可以有效地增加結(jié)腸長(zhǎng)度，緩解體質(zhì)量減輕，降低炎癥水平[23-25]。為了進(jìn)一步分析武夷巖茶和DSS對(duì)不同菌的影響，本實(shí)驗(yàn)評(píng)估了武夷巖茶干預(yù)后小鼠腸道菌群的變化。通過(guò)斯皮爾曼相關(guān)性分析進(jìn)一步研究了特定細(xì)菌群相對(duì)豐度與結(jié)腸長(zhǎng)度之間的相關(guān)性。如圖6所示，結(jié)腸長(zhǎng)度與Actinobacteria（r＝0.523 5；P＝0.003 6）（圖6C）、S24_7（r＝0.571 7；P＝0.001 0）（圖6E）、Coriobacteriaceae（r＝0.603 0；P＝0.000 5）（圖6G）、Desulfovibrio（r＝0.496 4；P＝0.005 3）（圖6J）和Adlercreutzia（r＝0.613 8；P＝0.000 4）（圖6K）的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)；結(jié)腸長(zhǎng)度與Proteobacteria（r＝－0.535 6；P＝0.002 3）（圖6A）、Deferribacteres（r＝－0.475 1；P＝0.008 0）（圖6B）、Enterobacteriaceae（r＝－0.530 8；P＝0.002 5）（圖6D）、Deferribacteraceae（r＝－0.475 1；P＝0.008 0）（圖6F）、Mucispirillum（r＝－0.475 1；P＝0.008 0）（圖6H）和Escherichia（r＝－0.566 5；P＝0.001 1）（圖6I）的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖6 特定菌群與結(jié)腸長(zhǎng)度的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between specific gut microbiota and colon length

2.6 陳年武夷巖茶多酚類物質(zhì)含量與結(jié)腸炎小鼠炎癥水平的相關(guān)性分析

如圖7所示，茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)、兒茶素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)及6 種兒茶素組分（EGCG、EGC、ECG、EC、GCG、DL-C）質(zhì)量分?jǐn)?shù)均與結(jié)腸中IL-6含量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與血清中TNF-α、IL-1β質(zhì)量濃度以及結(jié)腸中IL-1β含量呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；TFs質(zhì)量分?jǐn)?shù)與血清中IL-6質(zhì)量濃度、結(jié)腸中IL-1β含量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與結(jié)腸中IL-6、TNF-α含量以及血清中IL-1β質(zhì)量濃度呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；TRs質(zhì)量分?jǐn)?shù)與血清中IL-6質(zhì)量濃度呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與結(jié)腸中IL-6含量、血清TNF-α質(zhì)量濃度、血清IL-1β質(zhì)量濃度、結(jié)腸IL-1β含量呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；TB質(zhì)量分?jǐn)?shù)與結(jié)腸中IL-6、TNF-α含量呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。綜上，TRs是與結(jié)腸炎小鼠炎癥水平相關(guān)性最明顯的功能成分。

圖7 陳年武夷巖茶多酚類物質(zhì)含量與結(jié)腸炎小鼠炎癥水平的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis between polyphenol contents of aged Wuyi rock tea and serum and colonic inflammation in mice with DSS-induced colitis

3 討論

UC因其在世界范圍內(nèi)的高流行率而廣為人知。本研究采用DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型模擬臨床UC，在3% DSS造模7 d后，DSS組小鼠糞便呈水樣并便血，表明造模成功[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然陳年武夷巖茶（2001年、2011年）干預(yù)無(wú)法直接阻止結(jié)腸炎的發(fā)生，但是能夠不同程度減輕相關(guān)損傷，表明武夷巖茶可以作為一種有效的飲食策略緩解結(jié)腸炎。

近年來(lái)，關(guān)于茶葉中的多酚物質(zhì)在消炎、抗氧化等方面已有大量文獻(xiàn)報(bào)道[26]。有研究表明，茶葉中的活性成分EGCG對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎有明顯改善作用，而臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了EGCG可以緩解結(jié)腸炎患者的癥狀[27-28]，因此，EGCG被認(rèn)為是茶葉緩解DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的主要功能成分。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)，兒茶素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)及6 種兒茶素組分（EGCG、EGC、ECG、EC、GCG、DL-C）質(zhì)量分?jǐn)?shù)均明顯降低，TB質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加。傳統(tǒng)觀點(diǎn)將茶葉的抗氧化消炎等作用主要?dú)w因于以EGCG為代表的多酚類物質(zhì)[29]，而茶葉隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，EGCG等多酚物質(zhì)含量及多酚總量會(huì)發(fā)生明顯下降，從理論上分析，其抗氧化消炎活性也會(huì)發(fā)生明顯下降。但從本研究各個(gè)指標(biāo)結(jié)果綜合來(lái)看，陳年武夷巖茶（2011年）和非陳年武夷巖茶（2020年）對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的緩解作用無(wú)明顯差別，即經(jīng)過(guò)10 年的貯存，其抗氧化消炎能力無(wú)明顯變化，出現(xiàn)這種矛盾的原因可能是EGCG等兒茶素的適當(dāng)氧化聚合產(chǎn)物也具有很好的消炎抗氧化功能。Wu Ximing等[30]也得到了與本實(shí)驗(yàn)相似的結(jié)果，其發(fā)現(xiàn)在緩解胰島素敏感性方面，EGCG部分氧化聚合產(chǎn)物的效果甚至優(yōu)于EGCG。這也提示，由EGCG等兒茶素適當(dāng)氧化聚合而成的多酚物質(zhì)可能在陳茶抗氧化消炎功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。與此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)陳年武夷巖茶（2001年）在緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的體質(zhì)量減輕、腹瀉、結(jié)腸損傷以及炎癥因子水平增加方面，與陳年武夷巖茶（2001年）和非陳年武夷巖茶（2020年）有一些差距。這可能是因?yàn)镋GCG等兒茶素的適當(dāng)氧化聚合產(chǎn)物雖然具有很好的消炎抗氧化功能，但隨著其進(jìn)一步的氧化聚合，其抗氧化性會(huì)逐步減弱乃至消失，因而無(wú)法彌補(bǔ)由EGCG等功能成分含量減少導(dǎo)致的消炎抗氧化活性減弱。研究表明，EGCG等小分子質(zhì)量多酚會(huì)發(fā)生氧化聚合先轉(zhuǎn)變?yōu)門Fs，而TFs再進(jìn)一步氧化得到TRs乃至TB[31]。本實(shí)驗(yàn)中陳年武夷巖茶（2011年）組的TFs含量和TRs含量均高于另外一種年份的陳年武夷巖茶（2001年）和非陳年武夷巖茶（2020年）。陳年武夷巖茶多酚類物質(zhì)含量與結(jié)腸炎小鼠炎癥水平的相關(guān)性分析表明，TRs是與結(jié)腸炎小鼠炎癥水平相關(guān)性最明顯的功能成分，因而推測(cè)這種潛在功能成分可能屬于TRs。下一步將分離純化武夷巖茶中的TRs，并將其按分子質(zhì)量分成不同組分，在同一標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行EGCG、中等分子質(zhì)量TRs及高分子質(zhì)量TRs的抗氧化消炎活性研究。

腹瀉情況、疾病活動(dòng)指數(shù)以及結(jié)腸病理切片是評(píng)估DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的典型指標(biāo)，能客觀準(zhǔn)確地反映疾病的發(fā)展情況[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陳年武夷巖茶干預(yù)可以顯著緩解腹瀉、便血以及疾病活動(dòng)情況（圖1），這表明陳年武夷巖茶有助于維護(hù)腸道的正常功能。結(jié)腸病理學(xué)切片及組織學(xué)評(píng)分表明DSS會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸的正常結(jié)構(gòu)受到破壞，而陳年武夷巖茶干預(yù)能夠明顯緩解結(jié)腸腸道黏膜損壞、隱窩損壞以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，維持正常結(jié)腸形態(tài)（圖2）。Huang Yina等[32]采用3% DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎，并利用茶葉提取物進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶葉提取物顯著降低了結(jié)腸炎小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)，抑制了結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)陳年武夷巖茶也具有相同的效果。在正常的機(jī)體中，血清中的促炎因子和抗炎因子處于平衡狀態(tài)，而DSS處理小鼠的血清中促炎因子往往過(guò)表達(dá)，破壞了正常機(jī)體的平衡[33]。因此，降低血清中促炎因子水平是緩解結(jié)腸炎的重要途徑。最近的研究表明，降低IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)可以明顯緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥狀[34]。在本研究中，DSS造模后小鼠結(jié)腸的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加（圖2B），血清中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平增加（圖3），而陳年武夷巖茶干預(yù)顯著改善了這一現(xiàn)象。

據(jù)研究，人類腸道中的微生物數(shù)量大約為1014個(gè)，是人體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的10 倍左右，包括共生菌、益生菌和病原菌，它們發(fā)揮著營(yíng)養(yǎng)吸收、宿主防御和免疫發(fā)育等功能[35-36]。腸道菌群的平衡可以被生物體內(nèi)的侵入性抗原、免疫系統(tǒng)的激活和炎癥因子的產(chǎn)生破壞[37]。在門水平上，陳年武夷巖茶干預(yù)逆轉(zhuǎn)了DSS誘導(dǎo)的Proteobacteria、Verrucomicrobia相對(duì)豐度的變化（圖5A）。大多數(shù)Proteobacteria被認(rèn)為是有害細(xì)菌，在結(jié)腸炎患者體內(nèi)富集[38]。到目前為止，Akkermansia是已知存在于人類腸道中唯一的Verrucommicrobia細(xì)菌屬，約占人體主要微生物群落總數(shù)的3%～5%[39-40]。雖然Akkermansia的發(fā)現(xiàn)只有短短十多年，但它已成為學(xué)術(shù)界的“明星菌”，在IBD、癌癥、糖尿病等多種疾病的發(fā)展中扮演著重要角色[41]。在本研究中，陳年武夷巖茶干預(yù)逆轉(zhuǎn)了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中Akkermansia相對(duì)豐度的降低（圖5C），因此，Akkermansia可能是陳年武夷巖茶緩解DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的關(guān)鍵。

結(jié)腸屬于大腸，其主要功能是吸收水分、貯存和輔助排便[42]。有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)結(jié)腸過(guò)短時(shí)，易引起腸道功能紊亂、菌群失調(diào)及免疫失調(diào)，影響腸道正常吸收以及產(chǎn)生炎癥因子，從而引發(fā)腹瀉、腹脹及產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[43]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，經(jīng)手術(shù)切除部分結(jié)腸的患者中約有25%～50%的人群會(huì)出現(xiàn)不同程度的腹瀉。因此，結(jié)腸長(zhǎng)度與腹瀉、炎癥因子過(guò)表達(dá)和腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)[44]。本實(shí)驗(yàn)利用了斯皮爾曼相關(guān)性分析進(jìn)一步研究了特定細(xì)菌群相對(duì)豐度與結(jié)腸長(zhǎng)度之間的相關(guān)性，研究表明結(jié)腸長(zhǎng)度與Proteobacteria（r＝－0.535 6；P＝0.002 3）、Enterobacteriaceae（r＝－0.530 8；P＝0.002 5）和Escherichia（r＝－0.566 5；P＝0.001 1）的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。Escherichia是變形菌門（Proteobacteria）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）中的典型菌屬，它能夠通過(guò)產(chǎn)生脂多糖從而在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[45]。在科、屬水平上，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中的Enterobacteriaceae、Escherichia的相對(duì)豐度較Control組明顯增加，而陳年武夷巖茶干預(yù)組小鼠中的相對(duì)豐度明顯低于Control組（圖5B、C）。因此，陳年武夷巖茶對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的緩解作用可能是通過(guò)降低Escherichia的相對(duì)豐度來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，陳年武夷巖茶均具有緩解DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的作用，其中陳年武夷巖茶（2011年）干預(yù)效果優(yōu)于陳年武夷巖茶（2001年），這可能是因?yàn)镋GCG等兒茶素適當(dāng)氧化產(chǎn)生了消炎抗氧化性更好的TRs。此外，陳年武夷巖茶能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腸道中Escherichia和Akkermansia等微生物的相對(duì)豐度，維護(hù)腸道穩(wěn)態(tài)，對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的體質(zhì)量減輕、腹瀉、結(jié)腸長(zhǎng)度縮短、黏膜損壞及隱窩損壞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血清炎癥因子過(guò)表達(dá)等狀況起到緩解作用。