超聲波提取卵孢小奧德蘑多糖的工藝優(yōu)化

林俊銘 謝 靜 曾 榮 白永亮 郭艷峰

（1佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528200；2中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康產(chǎn)業(yè)學(xué)院，廣東中山 528436）

卵孢小奧德蘑Oudemansiella raphanipies，別名長根菇，屬傘菌綱、小奧德蘑屬，因菌菇上半部分為暗褐色，且形似雞菌，故只有商品名黑皮雞菌[1-2]之稱。該菌在中國主要分布于四川、福建、云南等省[3-4]，近幾年人工栽培量逐漸上升。卵孢小奧德蘑肉質(zhì)鮮嫩、口感爽脆、營養(yǎng)價(jià)值高[5]，富含氨基酸及生物活性物質(zhì)等，有調(diào)節(jié)人體機(jī)能、增強(qiáng)免疫等作用[6-7]，具有較高營養(yǎng)、藥用價(jià)值以及廣闊的市場(chǎng)前景。

目前，食用菌多糖提取的方法有水提醇沉法[8]、超聲波提取法[9]、微波提取法[10]、酶提取法[11]、酸堿提取法[12]、超臨界萃取技術(shù)提取法[13]等，然而上述提取方法仍有一些不足，如：水提醇沉法耗時(shí)長，提取率低；微波提取法因?yàn)闊釕?yīng)力導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞；酶提取法成本較高，多糖結(jié)構(gòu)容易破壞；酸堿提取法中強(qiáng)酸強(qiáng)堿容易導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)破壞；超臨界萃取技術(shù)對(duì)設(shè)備要求較高，工藝操作復(fù)雜。而超聲波提取法主要是利用超聲波的機(jī)械作用，破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等生物組織，并提高細(xì)胞內(nèi)的傳質(zhì)效率，可促進(jìn)多糖成分的釋放。馬曉寧等[14]通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)確定杏鮑菇多糖超聲提取的最佳工藝條件，提取率達(dá)14.71%。周理紅等[15]、吳昊等[16]通過超聲波輔助提取法有效提高了綠菇、紅菇多糖的提取率。焦迎春等[17]采用超聲提取最佳工藝獲得的柴達(dá)木大肥菇（柴達(dá)木雙層環(huán)傘菌）多糖具有較強(qiáng)的抗缺氧化效果。王榮琨等[18]比較竹蓀多糖提取方法，結(jié)果超聲波提取法可提高多糖提取率，且提取的多糖抗氧化性最強(qiáng)。

基于超聲波提取法操作簡(jiǎn)單、提取率高的特點(diǎn)，研究以卵孢小奧德蘑為原料，經(jīng)真空冷凍干燥粉碎后，采用超聲波提取法提取多糖。試驗(yàn)通過單因素、正交試驗(yàn)比較不同的超聲條件（溫度、時(shí)間、功率）以及料液比的多糖提取率，最終篩選出最適合卵孢小奧德蘑多糖提取的工藝及條件。研究可為卵孢小奧德蘑精深加工和功能產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原材料及試劑

新鮮卵孢小奧德蘑來源于廣東省肇慶市廣寧縣食用菌種植基地。

試驗(yàn)所用主要試劑：無水葡萄糖，天津市大茂化學(xué)試劑廠；苯酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙醇，天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸，廣東廣試試劑科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

試驗(yàn)所用主要儀器設(shè)備：BSA124S 電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SB-5200DTD 超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；V6 旋渦混勻器，廣東安勝儀器有限公司；DZKW 電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；3-20R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司；WZJ6-A 振動(dòng)式藥物超微粉碎機(jī)，濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 卵孢小奧德蘑多糖的提取及測(cè)定

1.3.1.1 卵孢小奧德蘑多糖提取

（1）預(yù)處理：挑選新鮮、無損傷腐爛的卵孢小奧德蘑，清洗干凈后于通風(fēng)室內(nèi)晾干表面水分，備用。

（2）真空冷凍干燥及粉碎：取適量預(yù)處理后的卵孢小奧德蘑，于-20 ℃的冷藏室中預(yù)凍24 h；于冷凍溫度為-42 ℃，真空度為7.9 Pa 的條件下，將預(yù)凍卵孢小奧德蘑放入料盤內(nèi)凍干，待料盤內(nèi)卵孢小奧德蘑溫度與冷凍溫度一致時(shí)停止凍干。冷凍后卵孢小奧德蘑用超微粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，用干燥器密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）提取多糖：參考徐瀾等[19]的方法稍做修改。稱取適量粉碎后的卵孢小奧德蘑粉末于燒杯中，加入一定比例的去離子水，混合均勻，在超聲清洗機(jī)的最佳條件下超聲提取粗多糖。超聲提取結(jié)束后于5 000 r/min 離心20 min，收集上清液，棄沉淀。將收集的上清液置于2 000 mL 燒杯中，加入等量的無水乙醇，攪拌均勻置冰箱中，于4 ℃下醇沉24 h。醇沉后的溶液于5 000 r/min 離心10 min，棄上清液，收集沉淀物。

（4）多糖凍干：將收集的沉淀物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)殘留的無水乙醇，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，最終獲得卵孢小奧德蘑粗多糖。

1.3.1.2 卵孢小奧德蘑多糖測(cè)定

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取0.1 g經(jīng)105 ℃恒溫烘干至恒重的葡萄糖于100 mL 燒杯中，加去離子水溶解，定容至1 000 mL。分別吸取不同體積（0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL）的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，用去離子水補(bǔ)至1.0 mL。向試管液中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后立即加入5.0 mL 硫酸，靜置10 min 后，用旋渦振蕩儀振蕩30 s，充分混勻反應(yīng)液，于30 ℃水浴中靜置20 min。用雙光束紫外分光光度計(jì)于490 nm 處測(cè)定吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：y=0.0109x-0.0085，R2=0.9988。

（2）卵孢小奧德蘑多糖的測(cè)定

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用苯酚硫酸法進(jìn)行多糖含量的測(cè)定，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出多糖含量，最后根據(jù)方程計(jì)算得出多糖提取率。

式中：ω—樣品中多糖含量（g/100 g）；C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測(cè)定液中多糖含量（mg/L）；V—樣品定容體積（mL）；M—樣品質(zhì)量（g）；0.9—葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 卵孢小奧德蘑多糖提取率與超聲溫度的關(guān)系

準(zhǔn)確稱取0.5 g 卵孢小奧德蘑粉末，按照料液比1∶40加入去離子水，攪拌均勻。超聲功率240 W，于40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的條件下，分別超聲20 min。

1.3.2.2 卵孢小奧德蘑多糖提取率與超聲時(shí)間的關(guān)系

準(zhǔn)確稱取0.5 g 卵孢小奧德蘑粉末，按照料液比1∶40 加入去離子水，攪拌均勻。于超聲溫度70 ℃，超聲功率240 W 的條件下，分別超聲10 min、20 min、30 min、40 min、50 min。

1.3.2.3 卵孢小奧德蘑多糖提取率與超聲功率的關(guān)系

準(zhǔn)確稱取0.5 g 卵孢小奧德蘑粉末，按照料液比1∶40 加入去離子水，攪拌均勻。于超聲溫度70 ℃，超聲功率180 W、210 W、240 W、270 W、300 W 的條件下，超聲20 min。

1.3.2.4 卵孢小奧德蘑多糖提取率與料液比的關(guān)系

準(zhǔn)確稱取0.5 g 卵孢小奧德蘑粉末，按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 加入去離子水，攪拌均勻。于超聲溫度70 ℃，超聲功率240 W 的條件下，超聲20 min。

1.3.3 正交試驗(yàn)

基于上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4 因素3 水平的正交試驗(yàn)，并通過正交試驗(yàn)確定卵孢小奧德蘑多糖提取的最佳工藝條件。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Microsoft Office、Excel 2010、正交試驗(yàn)助手軟件，標(biāo)準(zhǔn)偏差分析采用Spss 26.0 軟件，試驗(yàn)結(jié)果作圖采用Origin 2021軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲溫度對(duì)卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

由圖2 可知，卵孢小奧德蘑多糖提取率隨著超聲溫度的上升呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。超聲溫度50 ℃多糖提取率最高，為4.46%，超聲溫度超過50 ℃，提取率逐漸降低。超聲溫度從30 ℃升至50 ℃，溶液黏度逐漸下降，傳質(zhì)速率逐漸加快，導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞的破壞力不斷增大，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)變得更加疏松多孔，因而多糖更容易溶出[20-21]。超聲溫度過高會(huì)破壞多糖的分子結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致提取率低[22]。因此，選取超聲溫度為40 ℃、50 ℃、60 ℃作為后續(xù)的正交試驗(yàn)超聲溫度水平。

圖2 超聲溫度對(duì)卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

研究表明，適度延長超聲的時(shí)間，可以提高多糖的提取率[9-23]。由圖3 可知，試驗(yàn)超聲時(shí)間內(nèi)卵孢小奧德蘑多糖提取率先逐漸升高后迅速下降，超聲30 min 多糖提取率最高，為5.45%，顯著高于其他超聲時(shí)間處理的提取率（P＜0.05）。超聲時(shí)間10 min、20 min、30 min 時(shí)，多糖提取率逐漸上升，原因?yàn)槌暡ㄗ饔脤?dǎo)致的多糖不斷析出，提取率上升。但當(dāng)超聲時(shí)間超過30 min 后，部分多糖因長時(shí)間受到超聲波的影響，其結(jié)構(gòu)開始遭到破壞，發(fā)生水解現(xiàn)象，導(dǎo)致多糖損失，造成提取率出現(xiàn)快速下降現(xiàn)象[24]。綜上，選取超聲時(shí)間為20 min、30 min、40 min 作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的三個(gè)超聲時(shí)間水平。

圖3 超聲時(shí)間（min）對(duì)卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

2.1.3 超聲功率對(duì)卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

由圖4 可知，卵孢小奧德蘑多糖提取率隨超聲功率的不斷增大，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。其中180 W、210 W、240 W 超聲功率下的多糖提取率顯著高于其他處理。超聲功率為210 W 時(shí)，多糖提取率達(dá)最高，為4.32%。當(dāng)超聲功率從180 W 升高至210 W 時(shí)，多糖提取率提高，原因?yàn)槌暡铀倨茐募?xì)胞壁，加快多糖物質(zhì)的傳遞[25]；但是當(dāng)超聲功率大于210 W，由于高頻的功率導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞，造成損失，同時(shí)開始析出其他雜質(zhì)[26]，多糖提取率反而降低。因此選取180 W、210 W、240 W 為正交試驗(yàn)的三個(gè)超聲功率水平。

圖4 超聲功率（W）對(duì)卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

2.1.4 料液比對(duì)卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

由圖5 可知，試驗(yàn)料（g）液（mL）比之間多糖提取率均存在顯著性差異（P＜0.05）；多糖的提取率隨料液比的上升而提高，并于料液比為1∶40時(shí)達(dá)峰值（5.50%），料液比大于1∶40時(shí)，提取率開始下降。當(dāng)料液比在1∶10～1∶30時(shí)，多糖提取率緩慢上升，是由于粉末相對(duì)質(zhì)量多，不能均勻分散在溶劑中，導(dǎo)致多糖提取率不高[27]。隨著料液比的上升，多糖的提取率逐漸提高，因?yàn)槿軇┑脑黾樱軇┡c粉末間接觸面積增大，以及超聲的空化及振動(dòng)作用，使多糖溶出量增加[28]。料液比超過1∶40 后，多糖提取率下降，這可能是因?yàn)檫^多的溶劑反而使得提取不完全，導(dǎo)致多糖提取率的下降[29]。正交試驗(yàn)選取料液比1∶30、1∶40、1∶50水平。

圖5 料（g）液（mL）比對(duì)卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計(jì)了4 因素3 水平的正交試驗(yàn)（表1）。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果中，R值越大則該因素對(duì)多糖的提取率影響越大。由表2 可得，對(duì)卵孢小奧德蘑多糖提取率影響次序?yàn)镈（料液比）＞A（超聲溫度）＞C（超聲功率）＞B（超聲時(shí)間），料液比對(duì)多糖提取率影響最大，超聲時(shí)間最小。由正交試驗(yàn)結(jié)果中的三組均值K1、K2、K3可知，多糖提取率的4因素3水平正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合是A1B1C1D2，即當(dāng)超聲溫度40 ℃、超聲時(shí)間20 min、超聲功率180 W 以及料液比1∶40時(shí)，提取卵孢小奧德蘑多糖的效果最佳。

最優(yōu)組合進(jìn)行多糖驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)三次，多糖提取率為5.64%。因此正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合A1B1C1D2可以確定為卵孢小奧德蘑多糖提取率的最佳工藝條件。

3 小結(jié)

研究采用超聲波提取法提取多糖，利用其機(jī)械作用破壞卵孢小奧德蘑的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，提高細(xì)胞內(nèi)的傳質(zhì)效率，促進(jìn)多糖成分的釋放。通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)確定超聲波提取卵孢小奧德蘑多糖的最佳工藝條件為超聲溫度40 ℃，超聲時(shí)間20 min，超聲功率180 W，料液比1∶40，在此工藝條件下，卵孢小奧德蘑多糖的提取率達(dá)5.64%。研究為卵孢小奧德蘑多糖的進(jìn)一步提取純化和生物活性研究打下了基礎(chǔ)。