2,4,5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽中氰乙酸甲酯的方法研究

焦銀蕾，張曉燦，何曉晨，賈樹紅，劉立平

（河北冀衡藥業(yè)股份有限公司 河北 衡水 053000）

0 引 言

葉酸是人體細胞生長和繁殖的必需物質(zhì)，對人體的新陳代謝起著重要作用，是人體不可缺少的營養(yǎng)素之一，葉酸對細胞的分裂生長及核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)的合成起著重要的作用。但是由于天然的葉酸極不穩(wěn)定，易受陽光、加熱的影響而發(fā)生氧化，所以真正能從食物中獲得的葉酸并不多，而合成的葉酸在數(shù)月或數(shù)年內(nèi)保持穩(wěn)定，容易吸收且人體利用度高。葉酸合成過程使用到原料為2,4,5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二）、對氨基苯甲酰谷氨酸、三氯丙酮。

2,4,5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽（俗稱氨二），分子式：C4H9N5O5S，相對分子質(zhì)量：239.21，CAS No.為35011-47-3,為生產(chǎn)原料藥葉酸的主要使用原料，其制備過程是將氰乙酸甲酯、甲醇鈉和硝酸胍混合在一起進行縮合反應(yīng),通過添加亞硝酸鈉對混合物進行硝化，然后還原，最后加入硫酸，得到2，4，5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二），在其生產(chǎn)過程中使用氰乙酸甲酯作原料,故在反應(yīng)不完全的情況下會有殘留，從而影響原料藥葉酸的產(chǎn)品質(zhì)量，造成殘留溶劑含量不合格。氰乙酸甲酯為無色至微黃色透明液體，可燃，為極性有機溶劑，不溶于水,可與乙醇、乙醚混溶。具有可燃性，有中等毒性,能經(jīng)皮膚吸收，可引起皮膚炎癥，需對其進行控制，目前各國藥典均無相關(guān)檢測方法，參考工業(yè)用氰乙酸甲酯國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T26606-2011，采用氣相色譜儀進行方法的研究，確定檢測條件，制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，控制葉酸產(chǎn)品質(zhì)量。

1 實 驗

采用氣相色譜儀進行分析的方法稱為氣相色譜法，氣相色譜法是用氣體作為流動相的色譜法，該方法分析速度快、分離效率高。

氣相色譜法的原理是：樣品溶液進樣后，首先進入汽化室，然后在載氣的傳送作用下進入色譜柱（載氣常用氮氣或氦氣），不同組分在色譜柱中被分離，最后依次流出色譜柱，被檢測器檢測，得到其含量。測定樣品中某組分的含量時，需要先分析已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，然后將標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜峰的保留時間和峰面積與待測樣品中改該組分比對，計算待測樣品中目標(biāo)組分含量。由于樣品在氣相中傳遞速度快，因此樣品組分在流動相和固定相之間可以很快達到平衡，氣相色譜法具有分析靈敏度高、檢測時間短、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。

本實驗方法，需要確定檢測方法能夠?qū)⒅鞒煞趾蜌埩綦s質(zhì)及使用的溶劑進行有效分離，獲得預(yù)期峰型，并達到分離度滿足要求，定量限符合控制要求的目的。

1.1 試驗用分析儀器及試劑：

主要儀器：分析天平（賽多利斯，型號QUIN IX124-1CN）、氣相色譜儀（PE 氣相色譜儀型號Clarus 580）、SPN-300 高純度氮氣發(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所）、SPH-300 高純度氫氣發(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所），SPB-3 全自動空氣源（北京中惠普分析技術(shù)研究所）。

試劑：氰乙酸甲酯（上海麥克林生化科技有限公司）、無水甲醇（德國默克）

1.2 試驗條件

1.2.1 確定色譜參數(shù)

2,4,5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 中殘留氰乙酸甲酯能檢測到，并且能夠達到分離要求。初步確定的色譜參數(shù)為：

色譜柱：AE.SE-54 30m*0.32mm*0.25um；柱號：S.N.03111336001；檢測器：FID；載氣：氮氣；載氣流速：2.0 ml/min；進樣量：0.5μl；檢測器溫度：240 ℃；柱箱：150 ℃；量程：1；分流比：20∶1；進樣口溫度：240 ℃。

1.2.2 溶液配制

空白溶劑：無水甲醇

對照品溶液的制備：精密稱取氰乙酸甲酯對照品0.1 ml 于10 ml 容量瓶中，加入無水甲醇溶液至刻度，搖勻。

1.2.3 測定

吸取0.5μl 無水甲醇注入氣相色譜儀中，作為空白溶劑；吸取對照品溶液0.5μl,注入氣相色譜儀中，分別記錄色譜圖。

1.2.4 結(jié)果分析

發(fā)現(xiàn)對照品溶液中氰乙酸甲酯峰保留時間為1.566 min，溶劑峰保留時間為1.194 min，放大圖譜后發(fā)現(xiàn)氰乙酸甲酯峰型出現(xiàn)峰前延現(xiàn)象，峰型不好，可能包含未分離的雜質(zhì)，色譜圖如下所示：圖1 為完整譜圖，圖2 為放大后圖譜。

圖1 氰乙酸甲酯峰型圖（保留時間1.566），完整圖譜Fig.1 Methyl cyanoacetate Sample solution chromatogram(1.566)，Complete map

圖2 氰乙酸甲酯峰型圖（保留時間1.566），放大后圖譜Fig.2 Methyl cyanoacetate Sample solution chromatogram(1.566),Magnification map

1.2.5 條件調(diào)整

其他條件不變，調(diào)整分流比：5∶1，再次進樣。

發(fā)現(xiàn)對照中氰乙酸甲酯雜質(zhì)峰保留時間為1.600 min，溶劑峰保留時間為1.204 min，和溶劑峰較近，放大圖譜后發(fā)現(xiàn)氰乙酸甲酯峰型仍不理想。色譜圖如圖3 所示。

圖3 調(diào)整分流比圖譜（對照保留時間1.600）Fig.3 Chromatogram after adjusting Separation ratio(Retention time of reference solution 1.600)

1.3 優(yōu)化氰乙酸甲酯峰型

1.3.1 調(diào)整色譜條件能夠達到分離要求

文獻表明，氰乙酸甲酯屬于極性有機物質(zhì)，AE.SE-54 柱子屬于弱極性柱子，故可能存在雜質(zhì)峰分離不開的狀況，參照國標(biāo)GB-/T26606-2011工業(yè)用氰乙酸甲酯的要求，我們更換檢驗參數(shù)及色譜柱。

調(diào)整柱溫及程序升溫：柱溫是一個重要的操作變數(shù)，直接影響分離效能和分析速度。選擇柱溫是根據(jù)混合物的沸點范圍，提高柱溫可縮短分析時間；降低柱溫可使色譜柱選擇性增大，有利于組分的分離和色譜柱穩(wěn)定性提高，色譜柱壽命延長。一般采用等于或高于數(shù)十度于樣品的平均沸點的柱溫較為合適，對易揮發(fā)樣用低柱溫，不易揮發(fā)的樣品采用高柱溫。對于沸點分布范圍寬的多組分混合物，使用恒柱溫氣相色譜法分析，其低沸點組分會很快流出，峰形窄且易重疊，而高沸點組分則流出很慢，峰形扁平且拖尾，不利于定量測定還會延長分析時間。若使用程序升溫氣相色譜法，使色譜柱溫度從低溫開始，按一定升溫速率升溫，柱溫呈線性增加直至終止溫度，就會使混合物中的每個組分都在最佳柱溫(保留溫度)下流出。此時低沸物和高沸物都可在較佳分離度下流出，它們的峰寬窄適宜，并縮短總分析時間。

經(jīng)查氰乙酸甲酯沸點204-207 ℃，此次試驗繼續(xù)調(diào)整程序升溫溫度、檢測溫度和速率，更換色譜柱型號。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：PEG-20M 30m*0.32mm*0.25um；檢測器：FID；載氣：氮氣；載氣流：2.0ml/min；進樣量：0.5μl；檢測器溫度：240 ℃；柱箱：240℃；量程：1；分流比：20∶1；進樣口溫度：240℃；柱溫：起始溫度140 ℃保持10 min，再由20℃/min 速率升到240 ℃，保持10 min。

1.3.3 溶液配制

空白溶劑：無水甲醇

對照品的制備：精密稱取氰乙酸甲酯0.1 ml 于10 ml 容量瓶中，加入無水甲醇溶液至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

1.3.4 測定

吸取0.5μl 無水甲醇注入氣相色譜儀中，作為空白溶劑；吸取對照品溶液0.5μl 注入氣相色譜儀中。經(jīng)查看圖譜，發(fā)現(xiàn)對照中氰乙酸甲酯雜質(zhì)峰保留時間為8.214 min，溶劑峰保留時間為1.322 min，峰型較好，能夠有效分離，記錄色譜圖如圖4 所示。

圖4 氰乙酸甲酯峰型圖（保留時間8.214）Fig.4 Methyl cyanoacetate Sample solution chromatogram(8.214)

1.3.5 結(jié)果分析

經(jīng)查看圖譜，發(fā)現(xiàn)對照中氰乙酸甲酯雜質(zhì)峰保留時間為8.214 min，溶劑峰保留時間為1.322 min，放大圖譜后發(fā)現(xiàn)氰乙酸甲酯峰型良好，無雜峰現(xiàn)象，色譜條件調(diào)整達到預(yù)期效果。

1.4 確定方法檢測限、定量限

1.4.1 檢測限定量限研究

為使雜質(zhì)峰型更理想化，其他條件不變，我們再次調(diào)節(jié)色譜參數(shù)：起始溫度160 ℃。

根據(jù)2,4,5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 檢驗需要，須對其進行GC 氰乙酸甲酯的殘留量檢測，此方案主要研究2,4,5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 中是否能檢測出氰乙酸甲酯，并且能夠達到分離要求。為確定檢驗最小濃度我們將其對照液稀釋100 倍。

1.4.2 色譜條件

色譜柱：PEG-20M 30m*0.32mm*0.25um；檢測器：FID；載氣：氮氣；載氣流速：2.0 ml/min；進樣量：0.5μl；檢測器溫度：240 ℃；柱箱：240℃；量程：1；分流比：20∶1；進樣口溫度：240℃；柱溫：起始溫度160 ℃保持10 min，再由20℃/min 速率升到220 ℃，保持10 min。

1.4.3 溶液配制

空白溶劑：無水甲醇

對照品溶液的制備：精密稱取氰乙酸甲酯0.1 ml 于10 ml 容量瓶中，加入無水甲醇溶液至刻度，再次吸取0.1ml 于10ml 容量瓶中，加入無水甲醇溶液至刻度，搖勻。

1.4.4 測定

吸取0.5μl 無水甲醇注入氣相色譜儀中，作為空白溶劑；吸取氰乙酸甲酯對照品溶液0.5μl，記錄色譜圖。

1.4.5 結(jié)果分析

經(jīng)查看圖譜，發(fā)現(xiàn)對照中氰乙酸甲酯雜質(zhì)峰保留時間為4.540 min，溶劑峰保留時間為1.256 min，放大圖譜后發(fā)現(xiàn)氰乙酸甲酯峰型理想，無雜峰、前延、包峰等現(xiàn)象。計算分離度為37.5，信噪比為4，符合檢測要求，色譜如圖5 所示。

圖5 氰乙酸甲酯峰型圖（保留時間4.540）Fig.5 Methyl cyanoacetate Sample solution chromatogram(4.540)

1.4.6 專屬性研究

按照以上色譜條件進行專屬性研究，將對照品氰乙酸甲酯和2,4，5 三氨基-6 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 樣品混合后，是否仍能檢測到氰乙酸甲酯對照品、得到預(yù)期峰型和分離效果。

對照溶液：吸取氰乙酸甲酯0.5 ml 于10 ml 容量瓶中，加入無水甲醇溶液至刻度,搖勻。供試品混合溶液：精密稱取2,4，5 三氨基-6 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 1.0 g 于10 ml 容量瓶中，吸取0.1 ml對照溶液于同一個10 ml 容量瓶中，加入無水甲醇溶液至刻度,搖勻。

測定時分別吸取空白溶劑甲醇、氰乙酸甲酯對照品溶液和過濾后供試品混合溶液的上清液，各0.5μl 分別注入氣相色譜儀,記錄所得色譜如圖6 所示，對照品保留時間4.523 min；按面積歸一法計算，混合溶液2,4，5 三氨基-6 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 中氰乙酸甲酯≤0.5%范圍內(nèi)對照品和溶劑峰分離較好，保留時間穩(wěn)定，方法參數(shù)確定。

圖6 特異性色譜圖（對照溶液保留時間4.523 min）Fig.6 Specificity chromatogram(Retention time of reference solution 4.523 min)

2 驗證方法的有效性

為驗證方法的有效性，連續(xù)進樣三批，2,4，5三氨基-6 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 進行測定。檢測條件如下。

色譜柱：PEG-20M 30m*0.32mm*0.25um；檢測器：FID；載氣：氮氣；載氣流速：2.0 ml/min；進樣量：0.5μl；檢測器溫度：240 ℃；柱箱：240℃；量程：1；分流比：20:1；進樣口溫度：240℃；柱溫：起始溫度160 ℃保持10min，再由20℃/min 速率升到220 ℃，保持10 min。

2.1 試劑：無水甲醇。

2.2 對照品溶液的制備

精密吸取氰乙酸甲酯0.1 ml 于10 ml 容量瓶中，加入無水甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液的制備：精密稱取0.5 g 樣品于10 ml 容量瓶中，用無水甲醇溶解并稀釋至刻度；取上清液作為供試品溶液。

2.3 測 定

分別吸取空白溶劑（無水甲醇）、對照品溶液和供試品溶液各0.5μl 分別注入氣相色譜儀,記錄色譜圖，圖7 為對照溶液圖，4.435min 為對照品峰，色譜圖8 為樣品圖譜。因為樣品中氰乙酸甲酯殘留較少故樣品圖譜中只有溶劑峰未檢測到氰乙酸甲酯。

圖7 對照溶液圖譜Fig.7 Chromatogram of reference solution

圖8 供試品溶液圖譜Fig.8 Chromatogram of testing sample

2.4 計 算

按面積歸一法計算，樣品中殘留溶劑氰乙酸甲酯≤0.5%。

3 結(jié) 語

經(jīng)過調(diào)整參數(shù)，最終確定檢測條件：以PEG-20M（30m*0.32mm*0.25um） 為色譜柱，F(xiàn)ID檢測器，載氣流速：2.0 ml/min，進樣量：0.5μl，檢測器溫度：240 ℃，量程：1，分流比：20∶1；在樣品檢測圖譜中，對照品溶液中氰乙酸甲酯雜質(zhì)峰保留時間為4.5 min 左右,溶劑峰保留時間為1.2 min 左右,分離度為37.5，信噪比為4，符合要求，初步確定2,4，5 三氨基-6 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 中氰乙酸甲酯殘留限度為不得超過0.5%。

以上分析方法分離度、信噪比、峰型均能滿足檢測要求，分析方法及檢測條件初步確定，該方法能準(zhǔn)確可靠的測定2,4，5 三氨基-6 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 中殘留氰乙酸甲酯的含量，為提高葉酸產(chǎn)品的質(zhì)量提供了有效保障。