氣相色譜法檢測(cè)R-3- 氨基丁醇的研究

劉麗榮，王曉茹，穆玉敏，張浩月，楊夢(mèng)茜，劉 東，任麗梅

（1.美邦美和生物科技有限公司，河北 石家莊 050000；2.石家莊學(xué)院 化工學(xué)院，河北 石家莊 050035；3.河北省高校微生物制藥應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050035）

0 引 言

R-3- 氨基丁醇（R-3-amino-1-butanol） 是一種氨基醇類化合物，在有機(jī)合成和藥物生產(chǎn)過(guò)程中用途廣泛。在1977 年，報(bào)道R-3- 氨基丁醇是4-甲基環(huán)磷酰胺的關(guān)鍵中間體，而后者是抗腫瘤藥物的抑制劑。

Tetrahed. Lett 報(bào)道R-3- 氨基丁醇可以衍生合成β- 內(nèi)酰胺，進(jìn)一步合成具有碳青霉烯類結(jié)構(gòu)的抗生素；Drugs 報(bào)道在抗艾滋病藥物度魯特韋抑制劑的合成過(guò)程中，R-3- 氨基丁醇是其關(guān)鍵的中間體。近年來(lái)，世界艾滋病和腫瘤類疾病的增長(zhǎng)蔓延已經(jīng)引起各國(guó)政府和相關(guān)國(guó)際機(jī)構(gòu)的關(guān)注和重視，相關(guān)防治措施和醫(yī)療方法需求的迫切性也使R-3- 氨基丁醇相關(guān)產(chǎn)品的合成研究和用途開(kāi)發(fā)成為市場(chǎng)前景的課題之一。

作為一種手性氨基醇類，早期的氨基醇類物質(zhì)主要以天然的氨基酸為原料還原得到。目前，合成R-3- 氨基丁醇的方法主要有硼氫化物還原法，以酒石酸為拆分劑的拆分法和以釕碳等為誘導(dǎo)劑的化學(xué)誘導(dǎo)法，以及近年來(lái)興起的以各種酶為核心的生物催化、基因轉(zhuǎn)移等合成方法。

目前，工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)品大多來(lái)源于化學(xué)合成，因資源環(huán)境和持續(xù)發(fā)展等系列問(wèn)題，生物法的相關(guān)產(chǎn)品研究也在逐步走向市場(chǎng)。R-3- 氨基丁醇產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量參差不齊，這對(duì)于合成最終產(chǎn)品的品質(zhì)及生產(chǎn)成本有著很重要的影響，因此，建立一種準(zhǔn)確而高效的氨基丁醇的檢測(cè)方法顯得尤為重要。

目前，氨基醇類的檢測(cè)方法主要有薄層層析法、液相色譜法和氣相色譜法等。早期的薄層色譜層析法，由于手工操作較多，人為因素導(dǎo)致定量和重現(xiàn)性較差。而R-3- 氨基丁醇本身沒(méi)有紫外吸收，應(yīng)用最廣泛的液相紫外檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)通常采用HPLC- 衍生法，衍生過(guò)程通常存在步驟繁瑣、定性困難、定量準(zhǔn)確性差等一系列問(wèn)題。常用的氣相色譜檢測(cè)醇類物質(zhì)成分時(shí)，一般使用揮發(fā)性溶劑，也存在定量誤差。

本文針對(duì)氣相色譜法中揮發(fā)性溶劑等特點(diǎn)，采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法，選用用途廣泛的氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），檢測(cè)時(shí)樣品用量少，定量檢測(cè)時(shí)不需要衍生處理，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度普遍較高，操作簡(jiǎn)單方便。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（1） R-3- 氨基丁醇對(duì)照品：95%，上海麥克林化學(xué)試劑有限公司。

（2） 含R-3- 氨基丁醇的供試樣品：美和生物技術(shù)有限公司。

（3） 正丁醇：色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

（4） 甲醇：色譜純，天津市康科德科技有限公司。

（5） 其他試劑均為分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器設(shè)備

（1） 氣相色譜儀：8860 型，配有氫火焰離子化檢測(cè)器（FID)，美國(guó)Agilent 公司。

（2） 電子分析天平：FA1004A 型，上海精天電子儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 色譜條件

（1） 色譜柱：KB-624 石英毛細(xì)管柱，60 m×0.32 mm×1.8 μm。

（2） FID 檢測(cè)器溫度：280 ℃。

（3） 進(jìn)樣口溫度：250 ℃。

（4） 柱溫條件：初溫50 ℃，保持6 min，以10 ℃/min 的速度升溫至220 ℃，并保持5 min。

（5） 柱流速（N2)：1.0 mL/min。

（6） 氫氣流速：30 mL/min。

（7） 空氣流速：400 mL/min。

（8） 進(jìn)樣量：1 μL。

（9） 分流比：20∶1，分流進(jìn)樣。

2.2 對(duì)照品溶液制備

準(zhǔn)確稱取4.341 6 g R-3- 氨基丁醇對(duì)照品，用無(wú)水甲醇溶解，并定容至25.0 mL，混勻，此對(duì)照品溶液中R-3- 氨基丁醇的濃度為165.0 mg/mL。

2.3 供試樣品測(cè)定

2.3.1 供試樣品配制

根據(jù)供試樣品中含有R-3- 氨基丁醇組分的含量（檢測(cè)濃度在線性范圍內(nèi)），準(zhǔn)確稱取適量樣品試液，加入10 mL 容量瓶中，再加入0.5 mL 正丁醇內(nèi)標(biāo)，用甲醇稀釋并定容，吸取稀釋液，按照2.1 色譜條件，進(jìn)氣相色譜儀檢測(cè)，進(jìn)樣量為1.0 μL。

2.3.2 結(jié)果計(jì)算

供試樣品中R-3- 氨基丁醇含量X 的計(jì)算公式為：

式中：X 為供試樣品中R-3- 氨基丁醇含量，mg/g；C 為對(duì)照品R-3- 氨基丁醇的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為供試樣品的稀釋定容體積，mL；A 為供試樣品中R-3- 氨基丁醇的峰面積，mAu×s；As 為供試樣品中內(nèi)標(biāo)正丁醇的峰面積，mAu×s；m 為供試樣品質(zhì)量，g；f 為供試樣品的稀釋倍數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜柱的選擇

R-3- 氨基丁醇在使用型號(hào)為DB-1、DB-5、KB-624 和DB-1701 等色譜柱檢測(cè)時(shí)，均可出峰，綜合考慮實(shí)驗(yàn)室資源共用情況，選用KB-624（60 m×0.32 mm×1.8 μm） 毛細(xì)柱，能將供試樣品中R-3- 氨基丁醇和其他幾種組分以及內(nèi)標(biāo)物完全分開(kāi)，且峰形對(duì)稱，各組分的分析時(shí)間分布合理。

3.2 分流比的選擇

根據(jù)氣相色譜分析原理特點(diǎn)，進(jìn)樣時(shí)適當(dāng)?shù)姆至鞅瓤筛纳品逍?。本?shí)驗(yàn)依次選擇分流比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1，分別進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)，隨著分流比的增加，色譜峰寬度變窄，峰的分離效果越好，但相應(yīng)檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)降低，峰面積減小。

在分流比20∶1 時(shí)，各組分之間能完全分離，為提高響應(yīng)值，因此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件選定分流比為20∶1。

3.3 溶劑的選擇

供試樣品測(cè)定過(guò)程中，由于對(duì)照品線性范圍的限制及樣品濃度的未知性，需要配制標(biāo)準(zhǔn)溶液或稀釋樣品。

由于測(cè)試樣品中可能含有乙醇、乙酸乙酯及四氫呋喃等成分，故選用性質(zhì)相似、沸點(diǎn)低且成本不高的甲醇來(lái)配制對(duì)照品溶液，稀釋供試樣品，出峰快，且不與產(chǎn)品中的其他溶劑雜質(zhì)混淆，直觀定性供試樣品中溶劑殘留情況。

對(duì)照品和溶劑的氣相色譜圖如圖1 所示。

圖1 對(duì)照品和溶劑的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of reference substance and solvent

3.4 柱溫的探討

R-3- 氨基丁醇化合物的沸點(diǎn)相對(duì)較高，若柱溫太低，汽化可能不完全，且峰型不好；若初始溫太高，則供試樣品中低沸點(diǎn)的成分易隨甲醇溶劑一起流出，不易分離。

因此，選擇初溫為50 ℃，保持6 min，以每分鐘10 ℃的速度升溫至220 ℃，并保持5min。選擇上述色譜柱溫條件，能使供試樣品中R-3- 氨基丁醇和其他各組分完全分離，色譜峰型良好，且分析時(shí)間控制在＜30 min。

3.5 定量方法選擇

由于氣相檢測(cè)物質(zhì)大多屬于揮發(fā)性組分，且氣相色譜儀FID 檢測(cè)器屬于質(zhì)量型檢測(cè)器，在定量檢測(cè)時(shí)，各組分峰面積隨著進(jìn)樣量的不同而變化，為改善因溶劑揮發(fā)，進(jìn)樣量重復(fù)性和儀器穩(wěn)定性變化帶來(lái)的誤差，在供試樣品檢測(cè)過(guò)程中，分別選用外標(biāo)法（ESTD)和內(nèi)標(biāo)法（ISTD） 進(jìn)行比較。

ESTD 和ISTD 比較的結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 ESTD 和ISTD 的比較Table 1 Comparison of ESTD and ISTD

由表1 可以看出，外標(biāo)法測(cè)定供試樣品得到的RSD 值分別為2.75%和2.17%，而內(nèi)標(biāo)法的RSD值分別為0.46%和0.94%，應(yīng)用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算結(jié)果的精密度明顯略勝一籌。

在內(nèi)標(biāo)物的選擇中，比較甲基叔丁基醚、異丙醇和正丁醇等幾種化學(xué)試劑，其中，正丁醇的一些物理化學(xué)性質(zhì)，色譜峰峰型與目標(biāo)物R-3- 氨基丁醇相似，出峰位置靠近，是此檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中的合適內(nèi)標(biāo)物。

3.6 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限

依次吸取R-3- 氨基丁醇對(duì)照品溶液0.30、0.60、1.25、2.00、2.50、3.75 和6.00 mL，移入10 mL 容量瓶中，分別加入0.50 mL 正丁醇內(nèi)標(biāo)，用甲醇稀釋并定容，混勻后分別進(jìn)樣。

以R-3- 氨基丁醇的質(zhì)量與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量比值為橫坐標(biāo)（X），對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值作為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=0.102 6X-0.199 3，R2=0.999 2。

結(jié)果表明，該方法R-3- 氨基丁醇濃度在5.0 ～99.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。分別以3.3 倍和10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差和與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值的響應(yīng)為方法的檢測(cè)限（LOD） 和定量限（LOQ)，得 到LOD 為0.50 mg/mL，LOQ 為1.52 mg/mL。

3.7 專屬性和系統(tǒng)適應(yīng)性

分別精密吸取R-3- 氨基丁醇的空白溶劑、對(duì)照品溶液和供試樣品溶液，按照2.1 色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)得R-3- 氨基丁醇保留時(shí)間為22.5 min，內(nèi)標(biāo)正丁醇保留時(shí)間為17.5 min，分離效果良好，空白樣品在定性保留時(shí)間附近無(wú)雜質(zhì)干擾峰，專屬性和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

空白、對(duì)照品和供試樣品的氣相色譜圖如圖2所示。

圖2 空白、對(duì)照品和供試樣品的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatograms of the blank，reference substance and sample

3.8 穩(wěn)定性和重復(fù)性

準(zhǔn)確稱取同一批次供試樣品6 份，按照2.3 的方法進(jìn)行處理、檢測(cè)，計(jì)算得到R-3- 氨基丁醇的平均值為936.9 mg/g，RSD 值為0.42%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

取另一供試樣品，在0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，樣品每次進(jìn)樣后4 ℃保存，進(jìn)樣前30 min 置于室溫，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 2 Determination result of stability （n=6）

由表2 可以看出，含R-3- 氨基丁醇的供試樣品含量的RSD＜2.0%，表明該測(cè)試樣品在4 ℃的條件存儲(chǔ)下，24 h 內(nèi)主成分含量變化不大，穩(wěn)定性良好。

3.9 精密度和準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確稱取同一供試樣品的前期、中期、后期以及殘液各3 份，置于10 mL 容量瓶中，分別加入1、2 和5 mLR-3- 氨基丁醇對(duì)照品，按照2.3.1 制備不同濃度的供試樣品溶液，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)平行，按照2.1 色譜條件和2.3 供試樣品檢測(cè)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回收率的測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 3 Determination result of recovery rate（n=6）

由表3 可以看出，通過(guò)不同加標(biāo)濃度測(cè)得樣品的回收率為95.2%～99.7%，RSD 值為0.13%～0.97%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，符合藥典中回收率限度和精密度規(guī)定。

3.1 0 供試樣品的檢測(cè)

分別取實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)中初期、中期、后期以及處理殘液的供試樣品，按2.3 方法制備并檢測(cè)R-3- 氨基丁醇的含量，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 供試樣品的測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of the test samples

由表4 可以看出，供試樣品中R-3- 氨基丁醇含量反應(yīng)初期較少，隨著時(shí)間推移，含量增加，而處理殘液中的R-3- 氨基丁醇大部分已提取完成。整個(gè)測(cè)定結(jié)果及時(shí)準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)了反應(yīng)過(guò)程中和成品中R-3- 氨基丁醇的含量。

4 結(jié) 語(yǔ)

本文采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)R-3- 氨基丁醇，供試樣品取樣方便，不需要衍生等復(fù)雜前處理，試樣中目標(biāo)物和幾種溶劑分離完全。測(cè)試方法操作方便，分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度符合藥典相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

本方法對(duì)由化學(xué)法或生物法等制備的樣品均可檢測(cè)分析，可應(yīng)用于制備生產(chǎn)過(guò)程中含R-3- 氨基丁醇樣品的跟蹤分析和成品的測(cè)定。

該方法檢測(cè)實(shí)施過(guò)程中還有一些待改進(jìn)的地方，如由于受色譜柱等實(shí)驗(yàn)條件的限制，R-3- 氨基丁醇和其異構(gòu)體的分離檢測(cè)還需驗(yàn)證和優(yōu)化；生產(chǎn)反應(yīng)過(guò)程中，R-3- 氨基丁酸或羰基醇等底物的剩余量同時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化過(guò)程等。

將通過(guò)更多試驗(yàn)，優(yōu)化更新檢測(cè)條件，能同時(shí)定性定量檢測(cè)反應(yīng)底物的濃度以及分離檢測(cè)手性異構(gòu)體等，讓R-3- 氨基丁醇的過(guò)程監(jiān)測(cè)和成品驗(yàn)收簡(jiǎn)單化、一步化。