腫瘤出芽及腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞對食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值研究

張繼方，陳芳，唐佳雯，李紅亮

食管癌是威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，中國為食管癌高發(fā)國家，發(fā)病和死亡人數(shù)分別占全球的53.7%和55.3%［1-2］。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)和轉(zhuǎn)移的數(shù)量直接決定食管癌N 分期以及患者進(jìn)一步的治療方案，是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素［3-4］。然而食管黏膜下淋巴管網(wǎng)豐富，引流通路復(fù)雜廣泛，涉及頸、胸、腹部等20 余組淋巴結(jié)［5］，當(dāng)早期腫瘤突破黏膜固有層時即可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，具有區(qū)域性、雙向性、連續(xù)性、跳躍性等特點［6］。因此，明確食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素，尋找能夠預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法具有參考意義。

按照組織學(xué)類型，我國以食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）較為常見，而西方國家以食管腺癌多見［7］。雖然現(xiàn)今分子病理學(xué)與免疫治療發(fā)展迅速，但腫瘤組織形態(tài)學(xué)仍是病理診斷的重要基石。腫瘤出芽（TB）是可在多種惡性腫瘤中觀察到的病理組織形態(tài)學(xué)現(xiàn)象，反映了腫瘤具有較強的侵襲或轉(zhuǎn)移能力［8-10］，并提示與早期的結(jié)直腸癌、食管癌及胃癌等發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性［11-13］。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）是存在于腫瘤免疫微環(huán)境中具有抗腫瘤作用的淋巴細(xì)胞群，發(fā)揮免疫應(yīng)答作用［14］。有證據(jù)支持TILs 可用于預(yù)測惡性腫瘤患者免疫治療的療效并提示預(yù)后［15-17］，有研究提示其在早期胃癌中是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測因子［18］。本研究主要分析TB 和TILs 與ESCC 臨床病理特征的相關(guān)性，并評估兩者對食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值，旨在從病理組織形態(tài)學(xué)方面尋找提示臨床治療的依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2013 年1 月—2022 年3 月于寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院行食管癌根治切除并留存石蠟標(biāo)本的124例ESCC 患者為研究對象?；颊吣挲g46～82 歲，中位年齡62 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理診斷證實為ESCC；（2）有完整的臨床病例資料，包括患者性別、年齡、腫瘤長徑、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤層次、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無脈管內(nèi)癌栓；（3）術(shù)前未行新輔助治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）同時患有其他部位原發(fā)腫瘤的患者；（2）既往因其他疾病接受胸或腹部大手術(shù)的患者。本研究已通過寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號為（2021）年倫理審查（科研）第（055）號。

1.2 免疫組化染色 制備切片，厚度約4 μm，二甲苯脫蠟，梯度酒精乙醇（100%、95%、75%）水化，高壓鍋高溫抗原修復(fù)5 min（pH 6.0 檸檬酸鹽修復(fù)液），運用全自動免疫組織化學(xué)染色儀（德國LEICA，LEICA BOND MAX）染色，具體步驟按照儀器操作說明書執(zhí)行。

1.3 判讀TB TB 是在顯微鏡下觀察到的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)［19］，目前食管癌中TB尚無規(guī)范化的評估方法，本研究參考2016 國際TB 共識會議（ITBCC）推薦的結(jié)直腸癌TB 評估方法［20］，選擇TB 最密集的區(qū)域，即“熱點區(qū)”計數(shù)（×20 視野，即0.785 mm2區(qū)域），計數(shù)顯微鏡下所見的腫瘤浸潤前沿間質(zhì)內(nèi)散在的呈未分化形態(tài)的腫瘤細(xì)胞群，細(xì)胞群為單個腫瘤細(xì)胞或<5 個細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞簇。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)將其分為低、中、高級別，出芽數(shù)分別為0～4、5～9、≥10個。本研究通過細(xì)胞角蛋白5/6（CK5/6）免疫組化染色判讀TB 個數(shù)，依據(jù)上述推薦的TB 評估方法，124 例患者的蘇木素-伊紅染色（HE）切片及CK5/6 染色的TB由兩名病理醫(yī)師閱片綜合評估并討論確定TB 分級［13］。本研究將TB 分級中的低級別和中級別合并為低-中級別TB，與高級別TB 行進(jìn)一步的對比分析。

1.4 判讀TILs 本研究采用2014 年國際腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞工作組推薦的乳腺癌中TILs 的評估標(biāo)準(zhǔn)［21］進(jìn)行食管癌TILs 形態(tài)學(xué)評估，TILs 為單核淋巴細(xì)胞總面積占腫瘤間質(zhì)總面積的百分比，并在侵襲性腫瘤的邊界內(nèi)全面評估腫瘤區(qū)域的平均TILs，而不能僅關(guān)注熱點區(qū)域，一般四舍五入到最接近的5%或10%。本研究由兩名病理醫(yī)師共同閱片評估HE 切片中的TILs，TILs<30%為低密度TILs，TILs ≥30%為高密度TILs［22］。

1.5 分期 本研究參照美國癌癥聯(lián)合會與國際抗癌聯(lián)盟聯(lián)合發(fā)布的第八版食管癌分期系統(tǒng)［23］，對食管癌患者進(jìn)行病理TNM（pTNM）分期。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)資料應(yīng)用SPSS 27.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布計量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher's確切概率法；采用多因素Logistic 回歸分析探究ESCC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素，并采用受試者工作特征（ROC）曲線探討TB 和TILs 對ESCC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC 的TB 數(shù)目與分級 鏡下觀察腫瘤浸潤前沿間質(zhì)內(nèi)單個孤立的癌細(xì)胞或小癌細(xì)胞簇。應(yīng)用免疫組化CK5/6 進(jìn)行染色，CK5/6 在患者中均呈強陽性表達(dá)，著色于細(xì)胞膜，參考CK5/6 染色進(jìn)行TB 分級，見圖1。

圖1 ESCC 患者TB 的HE 和CK5/6 染色結(jié)果（×200）Figure 1 Haematoxylin-eosin and CK5/6 immunohistochemical staining results of TB in patients with ESCC

2.2 有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移ESCC 患者臨床病理特征的比較有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者60 例（48.4%），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者64例（51.6%），有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者腫瘤長徑、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤層次、脈管內(nèi)癌栓、TB 分級、TILs 密度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。按病理特征將患者分為低-中級別TB+高密度TILs 者（n=40）、高級別TB+高密度TILs 者（n=17）、低-中級別TB+低密度TILs 者（n=34）、高級別TB+低密度TILs 者（n=33）（圖2），有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者TB 分級+TILs 密度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移ESCC 患者臨床病理特征的比較〔例（%）〕Table 1 Comparison of clinicopathological features between ESCC patients with and without lymph node metastasis

圖2 ESCC 患者TB 和TILs 的HE 染色（×200）Figure 2 Haematoxylin-eosin staining results of TB and TILs in ESCC patients

2.3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與ESCC 患者臨床病理特征的多因素Logistic 回歸分析 以是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為因變量（賦值：無=0；有=1），以腫瘤長徑（賦值：腫瘤長徑≤2.5 cm=0；腫瘤長徑>2.5 cm=1）、腫瘤分化程度（賦值：腫瘤高-中分化=0；腫瘤低分化=1）、腫瘤浸潤層次（賦值：pT1 期=0；pT2+pT3 期=1）、TB 分級（賦值：低-中級別TB=0；高級別TB=1）、有無脈管內(nèi)癌栓（賦值：無=0；有=1）及TILs 密度（賦值：低密度TILs=0；高密度TILs=1）為自變量，進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示：TB 分級（OR=20.078）、脈管內(nèi)癌栓（OR=28.609）、TILs 密度（OR=0.218）是ESCC患者出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素（P<0.05），見表2。

表2 ESCC 患者出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響因素的多因素Logistic 回歸分析Table 2 Multivariate Logistic regression analysis of the influencing factors of lymph node metastasis in ESCC patients

2.4 TB 與TILs 預(yù)測ESCC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價值 采用ROC 曲線評估TB 與TILs 預(yù)測ESCC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價值，結(jié)果顯示，TB 預(yù)測ESCC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC 曲線下面積（AUC）為0.835〔95%CI（0.763，0.907），P<0.001〕，靈敏度為0.700，特異度為0.859；TILs 預(yù)測ESCC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移AUC 為0.656〔95%CI（0.558，0.753），P<0.001〕，靈敏度為0.700，特異度為0.609。表明TB 分級與TILs 密度預(yù)測ESCC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷效能良好（圖3）。

圖3 TB 與TILs 預(yù)測ESCC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC 曲線Figure 3 ROC curves of TB and TILs for predicting lymph node metastasis of ESCC

3 討論

TB 最初在結(jié)直腸癌中被深入研究。一項納入806例pT1 期結(jié)直腸癌的回顧性多研究中心結(jié)果提示，浸潤深度<1 000 μm 的203 例患者中有4 例（2%）發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，低于浸潤深度≥1 000 μm 的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率；高級別TB 病例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例（25%）高于低級別TB（7%）（P<0.001）；黏膜下浸潤深度≥1 000 μm、高級別TB 是pT1 期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素［24］。在進(jìn)展期結(jié)直腸癌，仍有相關(guān)研究證實，高級別TB 是提示腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要組織學(xué)特征［25］。一項納入12 項研究包含1 652 例患者的系統(tǒng)評價表明，高級別TB 與pT2 期結(jié)直腸癌患者更短的5 年生存率相關(guān)［26］。由于TB 對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的重要價值，已將TB 作為結(jié)直腸癌常規(guī)病理報告內(nèi)容。

目前尚未將TB 作為ESCC 病理報告的常規(guī)內(nèi)容。本研究結(jié)果提示高級別TB 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為68.3%，高于 低- 中 級別TB 淋 巴結(jié) 轉(zhuǎn) 移率（31.7%）。FUCHINOUE 等［13］分析了50 例淺表ESCC 患者，結(jié)果證實TB 分級和淺表ESCC 的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，本研究結(jié)果與之一致，高級別TB 病例具有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。在臨床治療中，對于早期內(nèi)鏡下黏膜剝離術(shù)（ESD）及食管癌根治切除患者，均建議在病理報告中加入TB分級。若存在高級別TB，早期ESD 患者建議仍要采取積極的治療手段，如追加手術(shù)或放化療。

在惡性黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌等多個系統(tǒng)惡性腫瘤中均有研究證實TILs 與預(yù)后情況相關(guān)［27］，在TILs 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究中，有結(jié)果提出TILs 與早期胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，低密度TILs 是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)測因素［18］。本研究表明，TILs 與ESCC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，并且多因素分析結(jié)果顯示，TB、TILs 及脈管內(nèi)癌栓是ESCC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素。

本研究將患者分為低-中級別TB+高密度TILs 者、高級別TB+高密度TILs 者、低-中級別TB+低密度TILs 者、高級別TB+低密度TILs 者。結(jié)果顯示，低-中級別TB+高密度TILs 者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較低，高級別TB+低密度TILs 者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高。通過ROC 曲線進(jìn)一步得出，TB 分級與TILs 密度預(yù)測ESCC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷效能良好，該結(jié)果應(yīng)用于臨床，有助于指導(dǎo)患者的后續(xù)治療，改善預(yù)后情況。

本研究存在一定的局限性，本研究為單中心回顧性研究且規(guī)模有限，由于失訪人數(shù)較多，未分析TB 分級與TILs 密度對預(yù)后的影響，后期研究將進(jìn)一步完善。

綜上所述，TB、TILs 與ESCC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并具有較好的預(yù)測價值，對行ESD 切除的早期ESCC 患者以及已接受根治切除術(shù)但淋巴結(jié)清掃不足患者的后續(xù)治療方案具有一定臨床指導(dǎo)意義。

作者貢獻(xiàn)：張繼方提出主要研究目標(biāo)，負(fù)責(zé)研究的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施，統(tǒng)計學(xué)處理，圖、表的繪制與展示，撰寫論文；唐佳雯進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集與整理；張繼方、陳芳負(fù)責(zé)病理形態(tài)學(xué)評估，進(jìn)行論文的修訂；李紅亮負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制與審查，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。