BMSCs對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折模型大鼠的影響及作用機(jī)制

李楊 陳勇 白亮 李偉 孟勇 曾慶亮 趙耀偉 張雷 王葉密 莊全魁

(阜陽(yáng)市第二人民醫(yī)院骨外科,安徽 阜陽(yáng) 236000)

骨質(zhì)疏松多發(fā)生于老年人群,因成骨與破骨代謝平衡紊亂導(dǎo)致骨脆性增加,骨折風(fēng)險(xiǎn)明顯提升,對(duì)患者生存質(zhì)量造成嚴(yán)重不良影響〔1〕。對(duì)于老年骨質(zhì)疏松患者臨床多采取藥物治療,包括骨吸收抑制劑、促進(jìn)骨形成的藥物等,但僅能起到一定的減緩作用,治療效果不理想〔2〕。近年研究發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分化與凋亡參與骨質(zhì)疏松的病理機(jī)制〔3〕。BMSCs是一種具備多向分化潛能的成體干細(xì)胞群,便于獲取且體外培養(yǎng)難度不高〔4〕。目前BMSCs以體外細(xì)胞學(xué)研究為主〔5〕,在骨質(zhì)疏松性骨折大鼠中的作用效果及可能機(jī)制的研究仍十分少見(jiàn)。本研究分析BMSCs對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折模型大鼠的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與主要試劑 雌性Wistar大鼠48只,體質(zhì)量(270±10)g,購(gòu)于安徽省盛鵬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào):SCXK(皖)2020-002,自由進(jìn)食、進(jìn)水,每日12 h光照。胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)于北京科美圖生物科技有限公司;骨堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海研謹(jǐn)生物科技有限公司。

1.2大鼠BMSCs原代提取及培養(yǎng) 將大鼠斷髓處死,放入乙醇溶液中浸泡后取下股骨、脛骨,轉(zhuǎn)入磷酸緩沖液中浸泡。使用手術(shù)刀將股骨、脛骨表面的軟組織去除,同時(shí)切除干骺端,暴露髓腔。無(wú)菌注射器吸取細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗髓腔,觀察髓腔顏色變白后停止沖洗。2 000 r/min 4 ℃恒溫離心15 min。棄去上層脂肪,向沉淀細(xì)胞中加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液,吹打后得到單細(xì)胞懸液。接種至培養(yǎng)瓶中,再加入細(xì)胞培養(yǎng)液,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中,條件設(shè)置為37 ℃、5%CO2,培養(yǎng)3 d后半量更換細(xì)胞培養(yǎng)液,之后每2 d全量更換細(xì)胞培養(yǎng)液。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,當(dāng)BMSCs融合度超過(guò)90%時(shí),棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,磷酸緩沖液洗滌,0.25%的胰蛋白酶消化3 min,顯微鏡下觀察BMSCs脫壁情況,加入細(xì)胞培養(yǎng)液消化后,轉(zhuǎn)移到離心管中,2 000 r/min 4 ℃恒溫離心15 min,棄去上清液。將BMSCs接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng),培養(yǎng)至第3代,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物。

1.3大鼠骨質(zhì)疏松性骨折模型構(gòu)建 大鼠禁食6h后麻醉,仰臥位固定到手術(shù)臺(tái)上。使用手術(shù)刀將大鼠下腹部皮膚切開(kāi),分離淺筋膜、深筋膜至肌層,分離輸卵管并定位卵巢。隨機(jī)選取16只大鼠為假手術(shù)組,開(kāi)腹后立即進(jìn)行皮膚縫合;另外的32只大鼠隨機(jī)分為骨質(zhì)疏松性骨折組、BMSCs處理的骨質(zhì)疏松性骨折組,每組16只,兩組結(jié)扎輸卵管峽部,切除雙側(cè)卵巢后縫合。常規(guī)喂養(yǎng)60 d后測(cè)定各組的骨密度,當(dāng)骨密度<1.05 g/cm2時(shí)提示骨質(zhì)疏松模型成功構(gòu)建。再次麻醉大鼠,仰臥位固定到手術(shù)臺(tái)上,將腰椎1～5椎體皮膚切開(kāi),暴露腹膜后間隙,分離背闊肌、棘間肌、背最長(zhǎng)肌、韌帶,腰椎1～5椎間盤(pán)暴露后于錐體側(cè)前端剪斷椎體,分層縫合。

1.4大鼠分組處理及標(biāo)本采集 建模成功后滿2月,骨質(zhì)疏松性骨折組、假手術(shù)組向兩側(cè)股骨髓腔中注射生理鹽水,注射體積為20 μl;BMSCs處理的骨質(zhì)疏松性骨折組向兩側(cè)股骨髓腔中注射BMSCs,注射體積為20 μl;將股骨鉆孔區(qū)使用骨蠟密封,縫合股骨遠(yuǎn)端肌肉和皮膚。繼續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)2 w,采集各組大鼠的腹主動(dòng)脈血3 ml,麻醉后處死,取骨折端組織、腰椎1～5椎體,保存待用。

1.5骨生物力學(xué)變化情況 取各組組織標(biāo)本,對(duì)右側(cè)股骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn),測(cè)定生物力學(xué)性能,具體為:兩端跨距20 mm,下壓速度5 mm/min,觀察骨組織標(biāo)本斷裂后停止。同時(shí)對(duì)大鼠腰椎1～5椎體進(jìn)行壓縮試驗(yàn),測(cè)量彈性模量、最大載荷。

1.6骨密度和骨超聲振幅衰減測(cè)定 將各組大鼠固定在掃描臺(tái)上,掃描大鼠的脊柱,根據(jù)測(cè)量得到的圖像長(zhǎng)度平均分為4個(gè)區(qū)域,測(cè)定各區(qū)域的骨密度值;同時(shí)對(duì)各組進(jìn)行骨超聲振幅衰減測(cè)定,記錄超聲衰減幅度。

1.7椎體骨組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)量 取各組大鼠的L5椎體,進(jìn)行標(biāo)本制備,使用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量骨組織形態(tài),包括:骨小梁體積百分比=骨髓腔體積/骨小梁體積×100%;骨小梁表面百分比:骨小梁總表面不規(guī)則、凹凸骨小梁表面占比;骨小梁平均寬度;礦化沉積率=單位時(shí)間內(nèi)新礦化的骨厚度。

1.8血清骨堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽水平檢測(cè) 取各組血液標(biāo)本,3 000 r/min 4 ℃恒溫離心10 min,收集血清,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清骨堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽水平,使用酶標(biāo)儀讀取450 nm處的吸光度值,以標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各樣本濃度。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件,多組間比較進(jìn)行方差分析,兩組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs的培養(yǎng)與鑒定 BMSCs接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶后連續(xù)培養(yǎng)2 d,待完成全量換液(舊培養(yǎng)液完全棄去,加入新的培養(yǎng)液),顯微鏡下觀察BMSCs貼壁生長(zhǎng),呈多角形,間充質(zhì)干細(xì)胞多數(shù)呈纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng),形態(tài)為不規(guī)則三角形或棱形,細(xì)胞核為卵圓形,細(xì)胞質(zhì)常向外延伸出數(shù)個(gè)長(zhǎng)短不同的突起。BMSCs傳代培養(yǎng)后均勻排列,幾乎所有間充質(zhì)干細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng),觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞鋪滿率達(dá)到80%以上時(shí),開(kāi)始傳代培養(yǎng)至第3代,保存待用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)果顯示,白細(xì)胞分化抗原(CD)34陽(yáng)性率≤5%,CD44、CD29、CD105陽(yáng)性率均≥90%,與間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)相符合。見(jiàn)圖1。

2.2各組骨生物力學(xué)改變情況分析 右側(cè)股骨和L5椎體的彈性模量、最大載荷在各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);骨質(zhì)疏松性骨折組上述指標(biāo)明顯低于假手術(shù)組,BMSCs處理的骨質(zhì)疏松性骨折組上述指標(biāo)明顯高于骨質(zhì)疏松組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組骨生物力學(xué)改變及血清骨堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽水平比較

2.3各組血清骨堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽水平比較 血清骨堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽水平在各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);骨質(zhì)疏松性骨折組血清骨堿性磷酸酶明顯低于假手術(shù)組,Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.01);BMSCs處理的骨質(zhì)疏松性骨折組血清骨堿性磷酸酶明顯高于假手術(shù)組,Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽水平明顯低于假手術(shù)組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.4各組椎體骨組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)量結(jié)果比較 骨小梁體積百分比、骨小梁表面百分比、骨小梁平均寬度、礦化沉積率在各組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);骨質(zhì)疏松性骨折組骨小梁體積百分比、骨小梁平均寬度明顯低于假手術(shù)組,骨小梁表面百分比、礦化沉積率明顯高于假手術(shù)組;BMSCs處理的骨質(zhì)疏松性骨折組骨小梁體積百分比、骨小梁平均寬度明顯高于骨質(zhì)疏松性骨折組,骨小梁表面百分比、礦化沉積率明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組骨密度、超聲衰減情況、椎體骨組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)量結(jié)果比較

2.5各組骨密度和超聲衰減情況比較 骨密度、超聲衰減程度在各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);骨質(zhì)疏松性骨折組上述指標(biāo)明顯低于假手術(shù)組,BMSCs處理的骨質(zhì)疏松性骨折組上述指標(biāo)明顯高于骨質(zhì)疏松性骨折組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討 論

老年人群身體器官處于衰退階段,會(huì)影響骨代謝、骨形成、骨吸收過(guò)程,鈣、磷等元素代謝紊亂,骨組織質(zhì)量和骨密度降低,骨脆性增加,出現(xiàn)老年性骨質(zhì)疏松〔6,7〕。同時(shí)骨質(zhì)疏松患者的骨密度下降,骨吸收增強(qiáng),導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低,骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加,臨床多表現(xiàn)為駝背、疼痛等,嚴(yán)重降低患者的生存質(zhì)量〔8〕。研究顯示,骨質(zhì)疏松會(huì)降低BMSCs的生長(zhǎng)、增殖及成骨分化活性,使自成骨細(xì)胞的成骨活性減弱〔9〕.使用正常狀態(tài)的BMSCs對(duì)骨質(zhì)疏松患者進(jìn)行局部注射時(shí)能夠明顯改善骨質(zhì)疏松部位的骨結(jié)構(gòu),觀察發(fā)現(xiàn)BMSCs具有增殖速度快、多向分化潛能大的優(yōu)勢(shì),因此在免疫調(diào)節(jié)組織修復(fù)、細(xì)胞療法等方面的應(yīng)用潛力較大〔10〕。本研究說(shuō)明,骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨生物力學(xué)下降明顯,給予BMSCs處理能夠有效提升骨生物力學(xué)指標(biāo),進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合。

目前臨床主要通過(guò)骨密度和超聲衰減情況檢測(cè)來(lái)診斷和預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松,同時(shí)作為藥物療效評(píng)估的定量參數(shù)用于治療方案的制定。本研究提示,BMSCs對(duì)骨質(zhì)疏松性椎體骨折的骨密度具有較好的治療作用。椎體骨組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)骨小梁體積百分比、骨小梁平均寬度可用于對(duì)骨量的評(píng)估,全面反映骨形成情況〔11〕,骨小梁表面百分比、礦化沉積率是骨吸收的關(guān)鍵指標(biāo)〔12〕。本研究結(jié)果提示,BMSCs能夠糾正骨吸收大于骨形成的狀態(tài),促使骨質(zhì)疏松性骨折組織變緊密,骨小梁變粗大,明顯提升骨折愈合的水平。成骨細(xì)胞分泌的骨堿性磷酸酶能夠水解無(wú)機(jī)磷酸鹽,減弱無(wú)機(jī)磷酸鹽對(duì)骨鹽的抑制作用,加速骨形成,血清骨堿性磷酸酶水平越低,骨質(zhì)疏松的發(fā)生率越高〔13〕。Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽水平變化能夠敏感的反映骨吸收情況,且具有較高的特異性〔14〕。相關(guān)研究顯示,骨質(zhì)疏松患者血清Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽水平明顯升高,對(duì)骨質(zhì)疏松病情進(jìn)展具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值〔15〕。本研究說(shuō)明,BMSCs具有提高骨質(zhì)疏松大鼠骨形成速率,降低骨吸收速率的作用,可能與提高骨堿性磷酸酶表達(dá),降低Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽表達(dá)有關(guān)。