基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接探討中藥何首烏改善阿爾茨海默病的作用機制

曾春暉 曹子茵 池鑫宇 段云天 周觀琳 劉舒凌 楊柯

(廣西中醫(yī)藥大學,廣西 南寧 530200)

阿爾茨海默病(AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)為記憶力減退、認知功能障礙、行為異常等〔1〕。中國占世界人口的五分之一,是地球上大部分老年人居住的地區(qū),中國患有癡呆癥的人數(shù)約占全世界25%〔2〕。目前治療AD的藥物多以乙酰膽堿酯酶抑制劑和非競爭性N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑為主,在一定程度上能改善AD部分癥狀,但存在耐受性差、不良反應多、療效不確切等問題〔3〕。中藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學中的瑰寶,在疾病防治中凸顯其安全有效及“多成分、多靶點、多途徑”整體治療的獨特優(yōu)勢〔4〕。因此,從中藥中尋找有效防治AD的藥物具有重要意義。中藥何首烏為蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb的干燥塊根,味苦、甘、澀,性微溫,歸肝、心、腎經(jīng)〔5〕。何首烏在我國藥用歷史悠久,《開寶本草》中記載其可用于“益氣血,黑髭鬢,悅顏色,久服長筋骨,益精髓,延年不老”〔6〕。近年來,不斷從何首烏中分離了大量二苯乙烯苷類、蒽醌類、黃酮類等成分,且藥理研究表明何首烏具有延緩衰老及神經(jīng)保護〔7,8〕、抗炎〔9〕、免疫調(diào)節(jié)〔10〕等作用,提示何首烏用于改善AD具有研究價值和開發(fā)潛力。

中藥相關(guān)研究存在一定復雜性,如果直接對其進行實驗性研究可能會出現(xiàn)針對性不強的問題。網(wǎng)絡(luò)藥理學是一門基于系統(tǒng)生物學理論、多學科融合形成的新興學科,其通過構(gòu)建多層次網(wǎng)絡(luò)全面闡述藥物與疾病之間的相關(guān)性〔11〕。分子對接是根據(jù)配體與受體之間的相互作用方式來預測其結(jié)合模式和親和力的一種方法〔12〕。故本研究根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合分子對接技術(shù)探討中藥何首烏對AD的潛在作用機制,為今后實驗研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1何首烏活性成分的篩選 通過知網(wǎng)、萬方、PubMed等數(shù)據(jù)庫檢索獲得何首烏化學成分,利用ChemDraw19.0軟件繪制其化學結(jié)構(gòu),并結(jié)合PubChem(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov),中藥與化學成分數(shù)據(jù)庫(www.chemcpd.csdb.cn/cmpref/main/tcm_introduce.asp)及化源網(wǎng)(www.chemsrc.com)進行驗證。利用SwissADME數(shù)據(jù)庫(www.swissadme.ch)以生物利用度與Christopher A.Lipinski提出篩選類藥分子基本法則〔13〕為條件,對化學成分進行篩選,滿足條件的成分作為何首烏候選活性成分。

1.2何首烏作用靶點與AD靶點的預測 采用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(www.swisst-argetprediction.ch)對何首烏候選活性成分進行靶點匹配和預測,且選擇排名前100的靶點作為成分作用靶點。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(www.genecards.org)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(www.disgenet.org)及OMIM數(shù)據(jù)庫(www.omim.org)以“Alzheimer′s disease”為關(guān)鍵詞挖掘與AD相關(guān)的靶點,以“homo sapiens”為物種篩選出靶點并整合。使用Uniport數(shù)據(jù)庫(www.uniprot.org/uploadlists)將何首烏作用靶點與AD疾病靶點進行蛋白和基因信息校正。利用微生信(www.bioinformatics.com.cn)在線工具對何首烏成分靶點與AD疾病靶點進行映射,篩選出交集靶點,即何首烏改善AD的潛在作用靶點。

1.3蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(www.string-db.org)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),將其數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.1軟件中進行可視化處理。利用CytoNCA插件分析其PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù),以節(jié)點度值(degree)的2倍中位數(shù)初步篩選,再以節(jié)點度值、介度中心性、緊密度中心性的平均值篩選得到核心靶點。

淀粉樣前體蛋白(APP)、早老蛋白(PSEN)1與腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白(Aβ)淀粉樣沉積存在密切聯(lián)系,目前研究影響Aβ水平的有效評價模型主要是APP/PSEN1雙轉(zhuǎn)基因小鼠,其廣泛運用于治療AD的藥物與方式相關(guān)科學研究〔14〕。在APP/PSEN1雙轉(zhuǎn)基因AD模型中,與野生型小鼠相比,轉(zhuǎn)入過度表達的人類基因APP和PSEN1的小鼠出現(xiàn)淀粉樣斑塊沉積〔15〕、神經(jīng)炎性改變〔16〕、突觸損傷及神經(jīng)元丟失〔17〕等。因此,將APP、PSEN1蛋白與何首烏改善AD篩選得到的核心靶點共同導入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),分析核心靶點與APP、PSEN1蛋白的相互作用。

1.4GO生物功能與KEGG通路富集分析 采用Metascape數(shù)據(jù)庫(metascape.org)對何首烏改善AD潛在靶點進行GO生物功能富集分析及KEGG通路富集分析,分別選取排名前20的GO生物功能和KEEG通路富集結(jié)果,保存其數(shù)據(jù)并利用微生信在線工具對結(jié)果進行可視化。

1.5構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò) 運用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建何首烏改善AD的“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò),并對其進行拓撲屬性分析,以節(jié)點度值大小篩選何首烏改善AD的核心成分并對其進行化學成分歸類分析。

1.6分子對接 分別在PDB數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)、PubChem數(shù)據(jù)庫(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載核心靶點的蛋白晶體結(jié)構(gòu)和核心成分的3D結(jié)構(gòu),并通過Chem3D 19.0軟件獲得核心成分的低能構(gòu)象。利用Pymol軟件將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中水分子和小分子配體去除,將蛋白結(jié)構(gòu)和核心成分小分子分別導入AutoDock1.5.6軟件進行分析處理,并使用Pymol軟件進行可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1何首烏活性成分的篩選 通過文獻檢索獲得何首烏化學成分131個,其中二苯乙烯苷類成分39個,蒽醌類成分33個,黃酮類成分27個,磷脂與苯丙素類成分9個,其他類成分(包括:多酚類、甾醇類、木脂素類等)23個。以生物利用度(OB)高與類藥物五原則為篩選條件共得出何首烏化學成分共37個,其中1個沒有預測與AD疾病相關(guān)的靶點信息,故剔除。最終共獲得36個潛在活性成分,其中二苯乙烯苷類成分4個,蒽醌類成分13個,黃酮類成分7個,其他類成分12個,見表1。

表1 何首烏潛在活性成分信息

2.2何首烏改善AD的潛在靶點 通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫對何首烏活性成分進行檢索,得到相關(guān)成分靶點494個。檢索GeneCards、DisGeNET和OMIM 3個疾病數(shù)據(jù)庫分別得到靶點個數(shù)為1 197、973和144,將得到靶點匯總?cè)ブ?最終得到1 785個疾病靶點。由AD疾病相關(guān)靶點與何首烏成分靶點映射篩選出交集靶點206個。

2.3何首烏改善AD潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將交集靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫得到PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù),將其導入Cytoscape3.7.1軟件進行可視化處理,見圖1。通過CytoNCA插件進行拓撲屬性分析,篩選出degree≥84,BC≥0.025,CC≥0.624的8個核心靶點,將其與APP、PSEN1蛋白共同導入STRING數(shù)據(jù)庫后得到PPI網(wǎng)絡(luò)如圖2所示,表明篩選得到的核心靶點與APP、PSEN1蛋白關(guān)系密切。

圓形節(jié)點代表靶點,節(jié)點大小和顏色深淺代表靶點度值大小,粗細代表度值的大小,邊的粗細代表邊介數(shù)圖1 何首烏改善AD潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4GO生物功能與KEGG通路富集分析 應用Metascape數(shù)據(jù)庫對206個潛在作用靶點進行富集分析,包括GO的生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)及KEGG通路富集分析。

在GO生物功能富集分析得到2 906個GO條目,其中BP 2471個,主要涉及激酶活性的正調(diào)控66個、細胞對氮化合物的反應60個、化學突觸55個、對無機物的反應53個、細胞死亡的正調(diào)控53個、細胞遷移的正調(diào)控47個、對有毒物質(zhì)的反應45個、跨膜轉(zhuǎn)運的調(diào)控43個、趨化性43個、肽基絲氨酸修飾42個、氧化應激反應42個、對創(chuàng)傷的反應42個、神經(jīng)元死亡39個、循環(huán)系統(tǒng)過程39個、神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)37個、蛋白質(zhì)自磷酸化35個、節(jié)律過程33個、老化33個、含氧量的反應33個、對銨離子的反應26個等;CC 165個,主要涉及枝晶44個、細胞質(zhì)核周區(qū)38個、突觸后膜36個、膜筏31個、溶解液泡29個、突觸前27個、受體復合體26個、囊泡腔21、薄膜側(cè)面21個、核膜20個、局灶性粘連19個、早期內(nèi)核體17個、細胞前沿16個、細胞頂端16個、轉(zhuǎn)移酶復合物/轉(zhuǎn)移含磷基團15個、細胞器外膜14個、突觸前膜的組成部分11個、細胞質(zhì)10個、神經(jīng)肌肉接頭8個、γ分泌酶復合體6個等;MF 270個,主要涉及蛋白激酶活性56個、激酶結(jié)合47個、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合39個、內(nèi)肽酶活性31個、蛋白質(zhì)同源二聚活性28個、蛋白酪氨酸激酶活性27個、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合26個、輔因子結(jié)合25個、磷酸酶結(jié)合19個、泛素蛋白連接酶結(jié)合17個、生長因子受體結(jié)合13個、銨離子結(jié)合12個、激素結(jié)合12個、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性10個、tau蛋白結(jié)合9個、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性9個、支架蛋白結(jié)合9個、胰島素受體底物結(jié)合7個、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性6個、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細胞凋亡的執(zhí)行階段6個等。

KEGG通路富集分析得到339條通路,主要涉及表皮生長因子受體(EGFR)信號通路、AD、5-羥色胺能突觸通路、促性腺素釋放激素(GnRH)信號通路、多巴胺能突觸通路、鈣信號通路、酪氨酸代謝通路、p53信號通路等,見圖3。表明何首烏主要活性成分的作用靶點分布于不同的代謝通路,它們可能是何首烏改善AD的作用機制。

圖3 何首烏改善AD的KEGG富集分析

2.5“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將何首烏改善AD的36個活性成分(其中二苯乙烯苷類成分4個、蒽醌類成分13個、黃酮類成分7個,其他類成分12個)、206個潛在作用靶點和20條相關(guān)通路的數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.1軟件進行可視化處理,見圖4。通過CytoNCA插件進行拓撲屬性分析,篩選出“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖中degree≥42的11個核心成分,其中HSW5、HSW8、HSW11、HSW13和HSW15是蒽醌類成分;HSW21、HSW22、HSW23和HSW24是黃酮類成分;HSW35和HSW36屬于其他類成分,見圖5。結(jié)果表明,何首烏中蒽醌類成分可能是主要改善AD的活性成分。

綠色六邊形代表活性成分,藍色菱形代表靶點,黃色倒三角代表通路圖4 何首烏“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)

圖5 何首烏改善AD核心成分的篩選

2.6分子對接驗證 在“1.2項”下,通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫對何首烏有效成分作用靶點的預測,結(jié)果表明經(jīng)篩選得的核心成分與核心靶點中,HSW5、HSW8、HSW15可影響EGFR和SRC,HSW11可影響蛋白激酶B(AKT)1、半胱天冬酶(CASP)3、EGFR、SRC,HSW13、HSW35可影響EGFR,HSW21、HSW22、HSW23、HSW24可影響AKT1、EGFR、SRC;HSW36可影響絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)3、MAPK1、EGFR,對小分子成分與大分子蛋白進行分子對接。其中,HSW5、HSW8、HSW13、HSW15與EGFR,HSW8、HSW22與SRC的結(jié)合能均小于-7.0 kcal/mol,展現(xiàn)出良好的結(jié)合力,對其進行結(jié)合模式分析,見圖6。

圖6 何首烏改善AD的核心成分-靶蛋白分子對接模式

3 討 論

目前AD發(fā)病機制尚不明確,其發(fā)病機制假說有基于淀粉樣斑塊的Aβ假說、基于神經(jīng)元纖維纏結(jié)的tau假說、基于長期炎癥反應造成腦損傷的炎癥假說和基于突觸功能失調(diào)及神經(jīng)元死亡的神經(jīng)保護假說等〔18〕。因此,本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學方法與分子對接技術(shù)對中藥何首烏改善AD的作用機制進行挖掘,以期為尋找AD藥物治療的新靶標,提高藥物的臨床有效性和安全性提供參考。

中藥何首烏為蓼科植物何首烏的干燥塊根,在我國用藥歷史悠久。在評價何首烏不同提取物及有效成分的保護神經(jīng)相關(guān)實驗中,研究者們發(fā)現(xiàn)何首烏的正己烷提取物具有發(fā)揮神經(jīng)保護作用,可能是通過抑制死亡受體和上調(diào)抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-2等,并抑制半胱氨酸蛋白酶活化來減弱谷氨酸誘導的原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元的細胞凋亡〔19〕。何首烏的水提取物對海馬神經(jīng)元的保護作用主要通過抑制活性氧(ROS)積累、成熟腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達和上調(diào)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應元件結(jié)合蛋白磷酸化〔20〕。何首烏中二苯乙烯苷類成分在果蠅和人類細胞中顯示出對抗Aβ42細胞毒性的類似保護活性,對神經(jīng)退行性疾病具有治療潛力〔21〕;蒽醌類成分能夠通過生長素釋放肽受體的激活來刺激分泌生長激素,是何首烏延緩衰老作用的關(guān)鍵成分〔22〕。因此,近年來何首烏改善神經(jīng)退行性疾病AD的作用也逐漸引起關(guān)注。

藥理研究表明,二苯乙烯苷類成分白藜蘆醇可以減弱黑質(zhì)紋狀體通路損傷誘導的神經(jīng)細胞凋亡和改善炎癥反應〔23〕。蒽醌類成分大黃素能夠改善HT22細胞的氧化毒性和光致血栓性缺血的缺陷,對谷氨酸誘導的細胞凋亡具有顯著的神經(jīng)保護作用〔24〕。蒽醌類成分大黃酚在D-半乳糖腹腔注射聯(lián)合腦內(nèi)注射淀粉樣多肽建立的AD大鼠模型中具有改善AD大鼠認知功能障礙的作用,通過抑制海馬組織鈣調(diào)蛋白-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM-CaMK)Ⅳ信號通路明顯下調(diào)海馬組織CaM、CaMKK、p-CaMKⅣ和p-tau蛋白水平,防止海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變,減輕海馬神經(jīng)元損傷〔25〕;而且,大黃酚還能夠改善糖尿病所致的學習記憶障礙,通過逆轉(zhuǎn)鏈脲佐菌素誘導糖尿病小鼠的高血糖,降低海馬CA3區(qū)神經(jīng)元死亡率,下調(diào)海馬區(qū)促炎因子水平,抑制海馬CA3區(qū)星形膠質(zhì)細胞的過度激活而發(fā)揮抗炎作用〔26〕。以上研究結(jié)果表明,何首烏主要活性成分具有明顯的保護神經(jīng)作用,結(jié)合本研究中何首烏改善AD核心成分的篩選結(jié)果,推測何首烏口服給藥時,其蒽醌類成分可能是改善AD的主要活性成分。

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學拓撲屬性篩選得到的核心靶點EGFR、SRC、AKT1等與AD密切相關(guān)。其中EGFR是上皮生長因子細胞增殖和信號傳導的受體,與其配體轉(zhuǎn)化生長因子或表皮生長因子結(jié)合后,可激活其內(nèi)在酪氨酸激酶活性,進而啟動下游的磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT通路、MAPK通路、蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號轉(zhuǎn)導通路等對細胞生長、增殖、分化等過程產(chǎn)生關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用〔27〕。SRC為Src家族激酶成員,SRC是EGFR途徑下游的重要介質(zhì),EGFR的活性伴隨著SRC激酶的活性升高而升高,同時SRC還可以激活MAPK通路、STATs通路等〔28〕。近年來SRC激酶在大腦損傷中的作用越來越被重視,SRC激酶抑制劑可減輕海馬區(qū)神經(jīng)元損傷,有效減輕腦神經(jīng)功能損傷〔29〕。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其可通過通路傳導調(diào)節(jié)細胞代謝、促進細胞生長和增殖等,同時還具有抑制細胞凋亡作用〔30〕。有研究表明,AKT1的表達與膠質(zhì)細胞病變的發(fā)生和惡性發(fā)展正相關(guān)〔31〕。目前大部分研究表明,APP、PSEN1蛋白是影響Aβ水平的關(guān)鍵蛋白,也是研究治療AD的關(guān)鍵靶點,本研究將8個何首烏改善AD的核心靶點與APP、PSEN1蛋白作PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn),8個核心蛋白與APP、PSEN1蛋白關(guān)系密切,說明中藥何首烏可間接影響AD的關(guān)鍵蛋白APP、PSEN1,從而發(fā)揮改善AD的作用。

取交集靶點進行KEGG通路富集分析,得到何首烏改善AD密切相關(guān)的基因信號通路,主要通過干預EGFR信號通路、AD、5-羥色胺能突觸通路等改善AD。EGFR信號通路主要包括三條通路,分別為PI3K/AKT/哺乳動物雷帕霉素蛋白(mTOR)通路、Ras/Raf/MEK/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路、JAK/STAT通路。在有關(guān)哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn),EGFR可通過上述3條信號通路分別參與調(diào)節(jié)突觸的形成與可塑性〔32〕。其中,PI3K/AKT/mTOR信號通路可以抑制神經(jīng)細胞自噬,促進炎性因子釋放,進而可以通過促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增殖與分化過程影響AD的發(fā)生。研究表明,阻斷PI3K/AKT/mTOR信號通路后,能發(fā)揮良好的腦保護作用,有效改善AD大鼠的病理狀態(tài)及神經(jīng)癥狀〔33〕。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路則主要負責調(diào)節(jié)細胞的增殖和凋亡,由于MEK/ERK復合體是環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子的高效激動劑,且在MEK/ERK途徑下星形膠質(zhì)細胞的增殖與分化過程顯著增強,因此它還參與神經(jīng)敏化等過程〔34〕;JAK/STAT信號通路不僅調(diào)控細胞的增殖、分化與凋亡,還可以引起衰老相關(guān)分泌表型(SASP)的分泌、ROS誘導DNA損傷的發(fā)生及組織微環(huán)境的炎癥,進而導致個體衰老及衰老相關(guān)的功能障礙〔35〕。AD在何首烏改善AD的通路分析中排名前3,而且何首烏改善AD的8個核心靶點與AD關(guān)鍵蛋白APP、PSEN1有著直接的作用,說明何首烏與該通路有密切關(guān)系。5-羥色胺能突觸通路由5-羥色胺和分布于腦部不同部位的突觸前后膜上的各類5-羥色胺受體組成,可以影響γ-氨基丁酸(GABA)、多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,介導大腦高級活動(記憶、學習、行為、感情等),其功能改變可能導致老年性癡呆、抑郁癥和焦慮癥等疾病的發(fā)生〔36〕。

綜上所述,基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接的研究方法,通過篩選何首烏與AD的共同靶點,構(gòu)建PPI和“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò),結(jié)合GO生物功能、KEGG通路富集和分子對接結(jié)合能計算等一系列分析,從系統(tǒng)層面揭示中藥何首烏改善AD多靶點、多途徑的分子作用機制。然而,在實際臨床用藥上多使用制何首烏,可以在今后研究嘗試何首烏的炮制品,使何首烏更好地發(fā)揮藥效,本研究可為后續(xù)實驗提供思路與基礎(chǔ)。