液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法優(yōu)化水產(chǎn)養(yǎng)殖底泥中磺胺類抗生素的提取

＊陳玉婷 李桂瀅 宋成 伍仕權(quán) 龍思雨 朱良茂 楊孝容

（樂山師范學(xué)院新能源材料與化學(xué)學(xué)院 四川 614000）

抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于治療和預(yù)防動物的疾病以及促進生長和提高飼料的利用率，使用非常廣泛，但攝入體內(nèi)的抗生素大部分以原藥或初級代謝的方式排出體外進入環(huán)境，部分沉積在底泥，環(huán)境中抗生素殘留以及耐藥細(xì)菌的傳播、擴散等引起環(huán)境污染[1-3]。通過水體和底泥抗生素含量監(jiān)測，可以了解抗生素的使用和殘留情況。底泥的成分復(fù)雜，有很強的吸附性，影響底泥抗生素監(jiān)測準(zhǔn)確度的主要因素是提取方法相關(guān)報道較多[4-6]。

本文以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜為監(jiān)測手段，以加標(biāo)回收率為指標(biāo)，單因素變量法優(yōu)化底泥抗生素的提取方法，為準(zhǔn)確測定底泥磺胺類抗生素提供技術(shù)支持。

1.實驗部分

(1)主要儀器與試劑

LC-20A和LC-MS 8030三重四級桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配電噴霧電離源（ESI），ATY124分析天平，HLB 200mg/6mL小柱，上述購置日本島津；ST 16R冷凍離心機（賽默飛世爾）；固相萃取裝置（美國Supelco公司）；DOA-P504-BN真空泵（GAST公司）；LGJ-12A冷凍干燥機（四環(huán)科儀）；KQ-300GDV超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；NK200-1B氮吹儀（無錫沃信儀器有限公司）；0.22μm濾膜。

磺胺標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司：磺胺二甲異嘧啶（SMO）、磺胺醋酰（SA）、磺胺嘧啶（SD）、磺胺噻唑（ST）、磺胺吡啶（SP）、磺胺甲基嘧啶（SMZ1）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ2）、磺胺甲噻二唑（STZ）、磺胺甲氧噠嗪（SMP）、磺胺對甲氧嘧啶鈉鹽（SME）、磺胺間甲氧嘧啶鈉鹽（SMM）、磺胺氯噠嗪（SCP）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（SDO）、磺胺甲噁唑（SMX）、磺胺二甲異噁唑（SDX）、磺胺間二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺喹噁啉（SQO）。

檸檬酸，磷酸氫二鈉，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA），氫氧化鈉，磷酸，上述試劑均為分析純；甲酸和甲醇為色譜純（r）。實驗用水為怡寶飲用純凈水。

(2)溶液的配制

用甲醇配制200mg/L的單標(biāo)儲備液，儲于4℃冰箱；臨時用甲醇配制4.0mg/L的混標(biāo)工作液；用定容液配制為5～500μg/L混標(biāo)溶液。

0.1mol/L檸檬酸溶液；0.05mol/L EDTA-0.05 mol/L Na2HPO4溶液，用NaOH溶液或H3PO4溶液調(diào)節(jié)至所需pH。

(3)樣品前處理

將采集的養(yǎng)魚池塘底泥，冷凍干燥，研磨過60目的篩子并裝于自封袋放干燥器備用。

條件優(yōu)化：稱取2g（稱至0.0001g）4份樣品于50mL離心管中，兩份加入1.0μg/mL標(biāo)液2.00mL，另外兩份不加標(biāo)樣，每支離心管加入10.0mL提取液（緩沖溶液VmL+甲醇(10-V)mL），20℃超聲10min，5000r/min 20℃離心10min，離心液轉(zhuǎn)入試劑瓶，殘渣再重復(fù)兩次以上操作，合并3次離心液加水至150mL左右，用1.0 mol/L的磷酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH；過HLB小柱凈化富集（小柱用5mL甲醇和5mL水活化），拋棄流出液，再用5～10mL水淋洗小柱；減壓抽15min，用8mL甲醇洗脫，收集洗脫液于15mL離心管中，40℃氮吹至干，用甲醇-0.5%甲酸水溶液（3:7）的定容液2.00mL溶解，過0.22μm濾膜裝于色譜樣品瓶，按“1.4”的色譜和質(zhì)譜條件分析。

(4)色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜條件：用Shim-pack VP-ODS（150mm×2.0 mm，5μm）色譜柱；流速0.3mL/min；進樣量5μL；柱溫35℃；運行時間19min；流動相A 0.2%甲酸水溶液，B甲醇；梯度洗滌程序見表1。

表1 高效液相色譜梯度洗滌程序

質(zhì)譜條件：離子化模式為電噴霧正離子模式；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測；碰撞氣為氬氣；毛細(xì)管電壓4.5kV；霧化氣為氮氣3L/min；干燥氣為氮氣15L/min；加熱模塊溫度400℃；DL溫度250℃。

2.結(jié)果與討論

(1)色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化結(jié)果

配制濃度為500μg/L的17種磺胺溶液的單標(biāo)，選擇Sacn（+）模式，Q3掃描尋找母離子，以母離子作為前體離子m/z，系統(tǒng)軟件自動優(yōu)化產(chǎn)物離子及MRM參數(shù)；然后接上色譜柱優(yōu)化色譜條件，色譜條件見表1；17種抗生素的色譜保留時間和質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 17種磺胺的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)

(2)緩沖溶液的選擇

緩沖溶液：0.1mol/L檸檬酸（含0.1g EDTA），pH6.5的Na2HPO4-EDTA和pH10.0的Na2HPO4-EDTA。緩沖溶液8.0mL+甲醇2.0mL提取，調(diào)節(jié)pH3.0過HLB小柱，其余與“1.3”相同，樣品加標(biāo)回收率見圖1。

圖1 不同pH緩沖液的樣品加標(biāo)回收率

從圖1可知，緩沖溶液與甲醇按8:2提起磺胺類抗生素，檸檬酸緩沖液和pH10緩沖溶液的整體效果較pH6.5緩沖溶液的效果好。但二者的效果懸殊不大。實驗選擇緩沖液0.1mol/L檸檬酸（含0.1g EDTA）溶液進行后續(xù)實驗。

(3)過HLB小組的pH選擇

以0.1mol/L檸檬酸8.0mL與2.0mL甲醇（加0.1g EDTA），其余與“1.3”節(jié)相同，過HLB小柱前調(diào)節(jié)溶液的pH3.0和5.0，考察加標(biāo)回收率，實驗結(jié)果見圖2。圖2表明過柱溶液的pH對磺胺類抗生素的加標(biāo)回收率的影響不明顯。后續(xù)實驗選擇提取液調(diào)節(jié)pH3.0過小柱。

圖2 pH3.0和pH5.0過柱的樣品加標(biāo)回收率

(4)提取液的選擇

以0.1mol/L檸檬酸+甲醇（加0.1g EDTA）8.0mL+2.0mL、7.0mL+3.0mL、6.0mL+4.0mL和5.0mL+5.0mL，選擇提取液，結(jié)果見圖3。

圖3 甲醇與檸檬酸溶液的比例對加標(biāo)回收率的影響

圖3表明，多數(shù)磺胺以0.1mol/L檸檬酸與甲醇8:2～5:5（加0.1g EDTA）作提取液的加標(biāo)回收率差異不大，但SDX和SQO提取液中甲醇40%～50%較理想。后期實驗選擇0.1mol/L檸檬酸（含0.1g EDTA）6.0mL+4.0mL甲醇作提取液。

(5)不同加標(biāo)濃度回收率的測定

在樣品中分別加入0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.25μg/mL的混標(biāo)2.00mL，提取液采用0.1mol/L的檸檬酸6.0mL+4.0mL甲醇，加入0.1g EDTA，其余與“1.3”完全相同，相當(dāng)于加標(biāo)濃度0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.25mg/kg，每種加標(biāo)濃度平行4次。加標(biāo)回收率結(jié)果見圖4。

圖4 三種濃度的加標(biāo)回收率

圖4可知，17種磺胺的三個水平的樣品平均加標(biāo)回收率在61%～97%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在1.1%～8.9%。除SA和SQO的加標(biāo)回收率可能低于70%，其余15種磺胺的樣品加標(biāo)回收率在70%～97%。

本文優(yōu)化的提取水產(chǎn)養(yǎng)殖底泥中磺胺類抗生素的方法，三個加標(biāo)水平的回收率與文獻[3-6]報道的回收率相當(dāng)或約高，但本文的提取溶劑和洗脫劑更簡單，有機溶劑的用量較少。

3.結(jié)論

本文固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法優(yōu)化了水產(chǎn)養(yǎng)殖底泥中17種磺胺類抗生素的提取方法。采用0.1mol/L檸檬酸與甲醇6:4加0.1g EDTA提取3次，合并提取液稀釋至150mL，調(diào)節(jié)pH3.0，用HLB固相萃取小柱富集凈化，甲醇洗脫，氮吹濃縮，甲醇-0.5%甲酸水溶液3:7溶解定容，以0.2%甲酸水溶液-甲醇作流動相色譜梯度洗滌分離，串聯(lián)質(zhì)譜正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測。提取劑簡單、成本較低、底泥樣品的加標(biāo)回收率高，可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖底泥磺胺類抗生素的測定。