環(huán)氧大豆油酸-寡聚乳酸修飾納米羥基磷灰石的制備及其聚乳酸復(fù)合材料性能研究

＊易文君 陳云 李立軍 沈奕 張躍飛 晁自勝*

（1.長沙理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院 湖南 410082 2.湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院 湖南 414006 3.中南大學(xué)湘雅第二醫(yī)院骨科 湖南 410011）

骨組織的再生能力有限，在骨固定和修復(fù)應(yīng)用中，生物可吸收材料被認(rèn)為是一種理想的生物材料，其中聚合物可以被人體吸收代謝，避免二次手術(shù)來移除金屬植入物[1]。聚（L-乳酸）是目前骨再生植入物應(yīng)用最廣泛的物質(zhì)之一，可降解為無毒可代謝乳酸，在組織工程、縫合、植入和藥物輸送等方面顯示出潛在的應(yīng)用前景[2]。但其骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性較差，不能直接應(yīng)用于骨修復(fù)工程。將羥基磷灰石（HA）與聚乳酸（PLLA）混合制備陶瓷/聚合物復(fù)合材料，可提高聚乳酸骨的誘導(dǎo)性。

環(huán)氧大豆油（ESBO）來源廣泛、無毒、易被人體代謝、具有良好的生物相容性，可應(yīng)用于生物材料[3]。ESBO曾被用于塑料及橡膠等聚合物的增塑，可提高其柔韌性。在HA/PLLA復(fù)合材料體系中，ESBO可作為偶聯(lián)劑及增塑劑，增強(qiáng)其界面相容性[4]。有望提升其力學(xué)性能及生物性能。

1.實(shí)驗(yàn)部分

(1)實(shí)驗(yàn)試劑

CaCl2，Na3PO4·12H2O，NaOH，環(huán)氧大豆油。實(shí)驗(yàn)室條件下制備寡聚乳酸（OPLA，粘均分子量約為6000）。聚（L-乳酸）（PLLA），型號為4032D（分子量約為1.67×105g/mol）。

(2)材料合成

①n-HA及ESBO-HA合成

500ml CaCl2（0.4M）為溶液A，用NaOH（0.1M）溶液緩慢滴加，調(diào)節(jié)其pH一直保持在9～10，并在水浴鍋中將其加熱至60℃。取適量Na3PO4加入去離子水中配置為300ml溶液B（0.3mol），將溶液B緩慢滴加至溶液A中，不停攪拌，用NaOH維持其pH一直處于9.0～10.0范圍內(nèi)，持續(xù)30min。30min后停止攪拌，溶液靜置24h后進(jìn)行過濾，并用去離子水沖洗殘余濾渣5次，將其放入冷凍干燥箱中，在-20℃下干燥24h，隨后取出研磨得到粉末，命名為n-HA。

通過計(jì)算適當(dāng)配比，取0.6g環(huán)氧大豆油，將其滴入50ml NaOH（1mol/L）溶液中水解，得到產(chǎn)物環(huán)氧大豆油酸（ESBO），隨后按照上述相同步驟進(jìn)行處理，得到產(chǎn)物為ESBO-HA。

②ESBO-OPLA-HA和OPLA-HA合成

先取1.0g n-HA加入至schlenk瓶中，再取質(zhì)量比為HA兩倍的OPLA 2.0g置于其中。取0.02g三乙胺作為催化劑，20ml二甲苯作為溶劑加入瓶中。在氮?dú)猸h(huán)境下于130℃下反應(yīng)24h，隨后冷卻離心得到沉淀物，用二氯甲烷重復(fù)洗滌5次，放入真空干燥箱中，設(shè)置溫度為40℃，靜置干燥24h，所得產(chǎn)物命名為OPLA-HA。

ESBO-HA按照上述相同步驟進(jìn)行處理，所得產(chǎn)物命名為ESBO-OPLA-HA。

③含聚乳酸的HA或改性HA共混物的制備

配置8ml CHCl3和丙酮的混合溶液（CHCl3和丙酮的體積比為5:1），取定量HA，ESBO-HA或ESBO-OPLA-HA分散至其中，超聲1h。然后按照計(jì)算比例取一定量的PLLA加入到該混合物溶液中，高速攪拌4h。隨后將混合物溶液倒入培養(yǎng)皿中，置于真空干燥箱中，50℃下干燥6h，等待溶劑揮發(fā)。將所得薄片用平板熱壓機(jī)熱壓1min，溫度為140℃，壓力為10MPa，得到薄片狀復(fù)合材料分別命名為HA/PLLA，ESBO-HA/PLLA及ESBO-OPLA-HA/PLLA。將所得薄片進(jìn)行機(jī)械切割，獲得長方形薄片（50mm×10mm×0.1mm），將其置于酒精中超聲，清洗表面雜質(zhì)，干燥后測量其拉伸性能。

(3)材料表征及測試方法

XRD：采用德國Bruker D8 ADVANCE型X射線衍射儀對其進(jìn)行物相分析。掃描速度5°/min，步長為0.02°，范圍為5°～80°。

FT-IR：掃描范圍為400～4000cm-1，掃描次數(shù)為64次，采用美國Varian 3100型紅外光譜儀進(jìn)行測試。

熱重分析：測試范圍為30～800℃，升溫速率為10℃/min，在空氣氛圍中進(jìn)行，采用TA SDT Q500熱重測試儀器進(jìn)行測試。

SEM：將粉末樣品加入乙醇中，超聲分散，滴在硅片上，隨后置于真空干燥箱中，干燥10h，進(jìn)行測試。將復(fù)合薄膜材料置于液氮中浸泡，隨后迅速撕成小碎片狀，對其截面進(jìn)行噴金2min，進(jìn)行測試。測試儀器為Philips XL30E-SEM-FEG掃描電子顯微鏡。

(4)生物性能測試

①細(xì)胞與材料共培養(yǎng)。材料制備與細(xì)胞培養(yǎng)和文獻(xiàn)[5]一致。

②細(xì)胞增殖測試。取一定量的樣品配成相應(yīng)濃度置于培養(yǎng)樣板上，樣板為96孔，將MSCs細(xì)胞（1×104細(xì)胞/孔）接種到樣品上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為24h、48h和72h。隨后用混合溶液替換原來的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3h，溫度為37℃。轉(zhuǎn)移一定量細(xì)胞混合培養(yǎng)基置于新的樣板中，測試吸光度。MSCs細(xì)胞數(shù)量通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法Kit-8（CCK-8，Dojindo）測試得到。

(5)機(jī)械性能測試

將薄膜樣品在室溫下以拉伸速度為1mm/min的條件用萬能試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行測試，萬能試驗(yàn)機(jī)型號為CMT6000，Sans，China。每組樣品測試3次，取其平均值。拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率通過公式（1）和公式（2）計(jì)算。

拉伸強(qiáng)度(MPa)=拉伸力(F)/截面面積(S)（1）

斷裂伸長率(%)=ΔL(mm)/L(mm)×100% （2）

2.結(jié)果與討論

(1)改性填料表征結(jié)果

n-HA，ESBO-HA，OPLA-HA和ESBO-OPLA-HA的XRD圖譜如圖1(A)所示。圖1(A)中a、b、c、d為合成的四種樣品的X射線衍射譜圖，均具備羥基磷灰石的衍射峰，主要衍射峰與PDF卡片（JCDPS:090432）對應(yīng)。改性前后，衍射峰無明顯變化，說明改性不會改變其晶型結(jié)構(gòu)。圖1(B)為OPLA，n-HA，OPLA-HA，ESBO-HA和ESBO-OPLA-HA的紅外光譜圖。不同材料在562cm-1、630cm-1、962cm-1和1028cm-1處的衍射峰為磷酸基團(tuán)振動[6]。

圖1 不同材料的XRD譜圖和FT-IR圖

這四個(gè)位置的衍射峰在n-HA進(jìn)行改性前后都沒有發(fā)生變化，說明ESBO和OPLA的改性過程沒有影響到HA的晶體結(jié)構(gòu)。圖1(B)中c，2800cm-1～3000cm-1處的衍射峰為ESBO上的-CH2-和CH3的振動吸收峰，圖1(B)中d，2800cm-1～3000cm-1處的衍射峰屬于ESBO或OPLA上的-CH2-或-CH3的振動吸收峰。1570cm-1和1480cm-1處的吸收峰屬于改性后羧基的振動。通過對FT-IR圖的分析，可以證明ESBO中的羧基與HA中的Ca2+在攪拌過程中發(fā)生螯合，說明通過共沉淀法成功將ESBO接枝到了HA表面，同時(shí)在OPLA-HA中ESBO的吸收峰未出現(xiàn)，說明OPLA無法直接接枝在HA的表面，需要通過ESBO接枝在HA表面的條件，OPLA才能接枝到HA的表面，形成復(fù)合材料。

n-HA，ESBO-HA，OPLA-HA以及ESBO-OPLA-HA系列材料的失重率結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，n-HA失重為5.2%，主要是HA中結(jié)晶水以及自由水的揮發(fā)。對于ESBO-HA而言，總熱失重為8.3%，前5.2%是由HA中的結(jié)晶水以及自由水揮發(fā)導(dǎo)致，后續(xù)失重3.1%為接枝在HA表面上的ESBO分解引起。ESBO-OPLA-HA熱失重為10.2%，其中5.2%為HA中結(jié)晶水以及自由水的揮發(fā)，3.1%為接枝在HA表面上的ESBO分解，1.9%為接枝在HA表面上的OPLA在高溫下分解。

圖2(a)為n-HA，可以觀察到HA呈片層狀團(tuán)聚分布在一起，當(dāng)HA在強(qiáng)堿性環(huán)境中合成時(shí)，HA最終形成片層狀形貌堆疊在一起。圖2(b)為OPLA改性之后的OPLA-HA的形貌，相對圖2(a)，分散沒有那么密集，且片層狀相對較小，可能是OPLA分布在HA表面上，使HA互相間隔開，HA相對分散，形成小塊層狀團(tuán)聚在一起。圖2(c)為ESBO-HA的SEM圖，可以在圖中觀察到ESBO-HA顆粒相對較分散，呈細(xì)針狀分布，少量團(tuán)聚在一起，ESBO可能在反應(yīng)過程中發(fā)揮了表面活性劑的作用，引導(dǎo)HA長成針狀，難以團(tuán)聚在一起形成片層狀。圖2(d)為ESBO-OPLA-HA，可以在圖中觀察到，ESBOOPLA-HA顆粒呈針狀，相較于圖2(c)，少量團(tuán)聚，可能是在表面改性的過程中，OPLA成功接枝到HA表面，使HA在合成過程中分散開，不易團(tuán)聚。

圖2 HA及其改性材料的SEM圖

為了測試材料改性之后分散效果是否得到改善，取一定量n-HA、OPLA-HA、ESBO-OPLA-HA分別加入氯仿溶液中，超聲一定時(shí)間，形成懸浮液，觀察其分散情況。從圖3可以觀察到，n-HA無法穩(wěn)定地懸浮于氯仿溶液中，數(shù)分鐘后顆粒開始沉淀。與n-HA相比，OPLA-HA能以相對穩(wěn)定且均勻的狀態(tài)在氯仿溶液中分散8h。ESBO-OPLA-HA分散穩(wěn)定性最好，能夠在氯仿溶液中穩(wěn)定分散達(dá)到48h?？梢缘贸鼋Y(jié)論，用ESBO和OPLA對HA進(jìn)行表面改性之后，能夠顯著提升復(fù)合材料的疏水性。

圖3 HA及改性HA氯仿懸濁液的穩(wěn)定性

(2)HA和改性HA的生物相容性

圖4為在不同材料上培養(yǎng)MSC細(xì)胞之后的存活情況。從圖中觀察到當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0mg/mL時(shí)，HA對于MSC細(xì)胞存在一定的影響，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間從24h到72h之后，細(xì)胞存活率下降了41.6%。ESBO-HA影響相對較小，培養(yǎng)時(shí)間從24h到72h之后，細(xì)胞存活率下降43.6%。ESBO-OPLA-HA影響最小，培養(yǎng)時(shí)間從24h到72h之后，細(xì)胞存活率僅下降17.6%[7]。當(dāng)加入ESBO和OPLA在HA表面進(jìn)行改性之后，增加了復(fù)合材料的疏水性能，阻止了HA中Ca2+滲出，從而使MSC細(xì)胞存活率提升，說明了進(jìn)行表面改性之后，復(fù)合材料的生物相容性提升，ESBO-OPLA-HA為極具潛力的骨修復(fù)材料。

圖4 MSC細(xì)胞在n-HA，ESBO-HA以及ESBO-OPLA-HA上不同時(shí)間之后的存活率

(3)熱壓工藝制備的HA/PLLA復(fù)合材料性能研究

HA，ESBO-HA以及ESBO-OPLA-HA材料的拉伸強(qiáng)度為ESBO-OPLA-HA/PLLA最高，ESBO-HA/PLLA次之，HA/PLLA在三者中最低。相比HA/PLLA，聚合物接枝改性的HA填料能夠提升PLLA復(fù)合材料的拉伸強(qiáng)度，提高約16.9%。從圖5中可知三種復(fù)合材料的斷裂伸長率都處于6%附近，相差不大，剛性HA納米顆粒的加入并沒有降低其斷裂伸長率。ESBO-OPLA-HA/PLLA和ESBO-HA/PLLA復(fù)合材料拉伸強(qiáng)度得到提升的原因，一方面是OPLA和ESBO在HA表面改性之后形成一層緩沖層，且兩者都為有機(jī)物，可以與PLLA纏繞在一起；另一方面為ESBO和OPLA的加入可以使HA顆粒在PLLA中分散更加均勻。在未改性時(shí)，HA顆粒容易在PLLA基體中團(tuán)聚呈大塊顆粒，造成應(yīng)力缺陷，界面黏附性差，從而導(dǎo)致拉伸強(qiáng)度降低。ESBO-OPLA-HA和PLLA在溶劑中共混時(shí)，HA表面上的OPLA分子能夠幫助HA在PLLA中均勻分布，且降低了顆粒團(tuán)聚程度，提升了HA與PLLA之間的界面黏附性，復(fù)合材料的拉伸強(qiáng)度得到提升。

圖5 系列HA復(fù)合填料對PLLA基復(fù)合材料拉伸性能影響

圖6為HA/PLLA、ESBO-HA/PLLA和ESBO-OPLA-HA/PLLA三種復(fù)合材料在用液氮處理后材料斷面的SEM圖?？梢詮膱D中觀察到，復(fù)合材料斷面上存在少量裂紋或缺陷。三種復(fù)合材料在PLLA基體中仍存在團(tuán)聚，團(tuán)聚程度HA＞ESBO-HA＞ESBO-OPLA-HA。說明加入OPLA和ESBO對HA表面進(jìn)行改性之后能夠改善HA在PLLA基體中的分散，增強(qiáng)了兩者之間的界面結(jié)合力。從力學(xué)性能分析中也能驗(yàn)證此結(jié)論，ESBO-OPLA-HA/PLLA復(fù)合材料的力學(xué)性能優(yōu)于HA/PLLA復(fù)合材料。

圖6 HA/PLLA，ESBO-HA/PLLA以及ESBO-OPLA-HA/PLLA斷面SEM圖

3.結(jié)論

本文探索了用ESBO和OPLA共同改性納米羥基磷灰石，作為填料制備聚乳酸復(fù)合材料的力學(xué)性能和生物性能的影響。ESBO-OPLA-HA疏水性增強(qiáng)，在氯仿溶液中分散性更好，懸浮時(shí)間長達(dá)48h。生物性能測試結(jié)果中，MSC細(xì)胞在改性的ESBO-OPLA-HA上培養(yǎng)之后存活率提升，相比未改性的HA毒性更低。通過溶液共混及熱壓法制備的ESBO-OPLA-HA/PLLA復(fù)合材料的拉伸強(qiáng)度相比HA/PLLA拉伸強(qiáng)度提升約16.9%，斷裂伸長率影響較小。ESBO-OPLA-HA優(yōu)良的生物相容性和相對適中的力學(xué)性能使得ESBO-OPLA-HA成為一種有潛力的生物可吸收高分子的填料。