外泌體在肝細(xì)胞癌耐藥中的研究進(jìn)展

李紹麟，趙辰戈

116001 遼寧 大連，大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 心血管內(nèi)科（李紹麟）；517000 廣東 河源，暨南大學(xué)附屬第五醫(yī)院 藥學(xué)部（趙辰戈）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）約占原發(fā)性肝癌的90%，是世界范圍內(nèi)最常見的腫瘤之一，也是癌癥患者死亡的主要原因之一［1］。早期HCC患者的一線治療，即手術(shù)切除，5年生存率為70%，但由于HCC在早期階段無癥狀，導(dǎo)致超過50%的患者在診斷時已經(jīng)是晚期肝癌。在美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的晚期肝癌治療方法中，手術(shù)切除、射頻消融術(shù)和經(jīng)動脈化療栓塞術(shù)等方案均存在易復(fù)發(fā)的缺陷［2］。近年來，用于HCC治療的分子靶向藥物的開發(fā)取得了重大進(jìn)展，包括廣譜酪氨酸激酶抑制劑，如索拉非尼和樂伐替尼，以及免疫治療和抗血管生成治療的組合，即阿替祖單抗和貝伐珠單抗也表現(xiàn)出了出色的療效［3］。然而，長期的藥物治療中不僅會引起對多器官的毒副作用，最重要的是出現(xiàn)了耐藥性。

大多數(shù)HCC患者最終會出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致預(yù)后不良。在藥物的全身治療中發(fā)現(xiàn)的不良事件主要包括胃腸道、心臟和腎臟毒性，以及皮膚損害等，嚴(yán)重時可能會出現(xiàn)高血壓和劇烈腹痛導(dǎo)致治療中斷［4］。因此，為了提高藥物利用率，改善腫瘤的化療耐藥對HCC的治療有著重要的意義。最近的研究表明，表觀遺傳學(xué)、細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的改變、調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡和腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是HCC化療耐藥性發(fā)生和發(fā)展中的重要因素，外泌體作為一種細(xì)胞間傳遞信息的功能介質(zhì)，攜帶的物質(zhì)可以調(diào)節(jié)多種生物活動，在HCC進(jìn)展中扮演著重要角色［5］。

細(xì)胞外囊泡根據(jù)其大小和生物發(fā)生機(jī)制分為不同的類型。被廣泛研究的主要類型包括外泌體（直徑 40 ～ 160 nm）、微粒（直徑 100 ～ 1 000 nm）、凋亡小體（1 ～ 5 μm）和癌小體（1 ～ 10 μm）等［6］。在這些種類中，外泌體因其獨(dú)特的生物發(fā)生和功能而備受關(guān)注。外泌體作為細(xì)胞間的通訊介質(zhì)，因其特有的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，從而可以轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)以及編碼和非編碼RNA （non-coding RNA，ncRNAs）等物質(zhì)并保護(hù)其不被酶降解，通過自分泌和旁分泌相互作用調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程［7］。越來越多的研究表明外泌體在HCC的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥中發(fā)揮重要作用。在此基礎(chǔ)上，研究外泌體在HCC化療耐藥中的作用機(jī)制，以及開發(fā)外泌體作為天然載體改善HCC耐藥有著廣闊的前景［8］。

1 外泌體介導(dǎo)的腫瘤耐藥

耐藥性一直是影響HCC治療效果的重要因素。手術(shù)與化療相結(jié)合是HCC目前標(biāo)準(zhǔn)的一線治療策略。雖然大多數(shù)患者最初對鉑類化療藥物有一定的敏感性，但約70% ～ 80%的腫瘤會復(fù)發(fā)并對治療產(chǎn)生耐藥性［9］。對化療藥物的耐藥性可分為兩大類，內(nèi)源性和獲得性耐藥性。在內(nèi)源性耐藥中，耐藥相關(guān)因素在未接觸任何藥物之前就存在于腫瘤細(xì)胞中［10］，而獲得性耐藥或多重耐藥是一個緩慢而逐步的過程，迫使腫瘤細(xì)胞在治療期間發(fā)生基因突變或表觀遺傳變化，從而導(dǎo)致耐藥［11］。獲得性耐藥可歸因于化療藥物的細(xì)胞內(nèi)濃度降低、癌基因或抑癌基因表達(dá)改變、DNA損傷修復(fù)增強(qiáng)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、自噬和高酸性TME［12］。最近，越來越多的研究強(qiáng)調(diào)了外泌體在誘導(dǎo)腫瘤化療耐藥中的重要作用。

1.1 外泌體介導(dǎo)的藥物流出

腫瘤細(xì)胞降低化療藥物藥效的機(jī)制之一是通過外泌體攜帶化療藥物排出細(xì)胞外從而抑制這些藥物及其代謝物的作用?；熕幬锉患?xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)排出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降，被認(rèn)為是化療耐藥的主要原因［13］。例如，在前列腺癌中，與相應(yīng)的化療敏感細(xì)胞相比，恩雜魯胺 （enzalutamide，ENZ） 耐藥細(xì)胞釋放的外泌體數(shù)量顯著增加（2 ～ 3倍），這些耐藥細(xì)胞通過外泌體將ENZ從細(xì)胞中排出以減少細(xì)胞內(nèi)藥物濃度［14］。此外還有一項(xiàng)研究表明用紫杉醇或多柔比星作用于乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞系可呈時間和劑量依賴性顯著增加外泌體的釋放，從這些細(xì)胞中分離出的外泌體含有相當(dāng)濃度的藥物，對受體細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用［15］。類似地，細(xì)胞外酸化可以加速黑色素瘤細(xì)胞通過外泌體直接排除順鉑類藥物，從而促進(jìn)了黑色素瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥性，但質(zhì)子泵抑制劑在一定程度上逆轉(zhuǎn)了黑色素瘤細(xì)胞的化療耐藥性［16］。

1.2 外泌體調(diào)節(jié)肝癌干細(xì)胞特性

肝癌干細(xì)胞（liver cancer stem cell，LCSC）是一種具有強(qiáng)大自我更新、分化和腫瘤發(fā)生能力的肝癌細(xì)胞亞群。LCSC相關(guān)基因，包括上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和CD133在索拉非尼耐藥細(xì)胞中高度表達(dá)。 EpCAM+細(xì)胞大量表達(dá)鈣黏素4，一種染色質(zhì)重塑酶，并影響 PPAR 和DNA雙鏈斷裂修復(fù)以增強(qiáng) HCC 細(xì)胞的耐藥性［17］。目前，CD133已成為LCSCs研究的焦點(diǎn)，HCC 組織中的CD133表達(dá)是HCC患者生存和腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素。與CD133-HCC細(xì)胞相比，CD133+HCC細(xì)胞具有顯著的順鉑耐藥性，并且miR-124的過表達(dá)通過靶向SIRT1/ROS/JNK引起順鉑誘導(dǎo)的針對CD133+HCC細(xì)胞的細(xì)胞毒性的敏感性［18］。CD133+HCC 細(xì)胞還可以通過激活 AKT/PKB通路，賦予對阿霉素和5-氟尿嘧啶 （5-fluorouracil，5-FU） 的耐藥性［19］。因此，LCSC特性被認(rèn)為是導(dǎo)致HCC耐藥性的關(guān)鍵因素。

在一項(xiàng)體外研究中，將富含lincRNA-ROR（linc-ROR）的外泌體與CD133+LCSC共孵育，減少了索拉非尼或阿霉素誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞死亡。而敲除linc-ROR增強(qiáng)了化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性，表明了外泌體lncRNA在LCSC誘導(dǎo)的化療耐藥中的重要性［20］。然而，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞分泌的外泌體中的p120-連環(huán)蛋白抑制HCC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移以及LCSCs的擴(kuò)增［21］。綜上所述，不同干細(xì)胞群分泌的外泌體在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮不同的功能。外泌體對LCSC介導(dǎo)的HCC細(xì)胞耐藥性的影響是復(fù)雜的，應(yīng)在各種條件下進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.3 TME中的外泌體對HCC耐藥的影響

TME是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，是腫瘤發(fā)生和發(fā)展各個階段的積極參與者［22］。TME包含瘤上皮和各種腫瘤支持細(xì)胞，如免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫抑制細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和各種細(xì)胞因子［23］。外泌體在腫瘤細(xì)胞和構(gòu)成TME的周圍細(xì)胞之間充當(dāng)有效的信號分子，在腫瘤耐藥的發(fā)生中起到至關(guān)重要的作用。

巨噬細(xì)胞能夠分泌出促進(jìn)腫瘤生長的外泌體。最近的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了巨噬細(xì)胞衍生的外泌體增強(qiáng)糖酵解，介導(dǎo)肺癌細(xì)胞對順鉑化療的耐藥性。分子通路研究表明，這些外泌體具有高水平的miRNA-3679-5p并降低NEDD4L的表達(dá)以促進(jìn)c-Myc的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)肺癌的生長，并增強(qiáng)了糖酵解和順鉑的耐藥性［24］。TME中缺氧會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞分泌含有高水平miRNA-223的外泌體作為腫瘤促進(jìn)因子。通過外泌體傳遞miRNA-223 降低磷酸酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue，PTEN）表達(dá)以誘導(dǎo) PI3K/AKT 信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞耐藥［25］?；|(zhì)細(xì)胞還有助于環(huán)境酸化，為腫瘤的生長創(chuàng)造有利的TME。酸性微環(huán)境觸發(fā)缺氧誘導(dǎo)因子 1/2α（hypoxia inducible factor-1/2α，HIF-1/2α）的激活并刺激外泌體miR-21和miR-10b的表達(dá)，從而顯著促進(jìn)HCC 細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖、遷移和侵襲［26］。腫瘤來源的外泌體參與了成纖維細(xì)胞向癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblast，CAF）的分化，從而促進(jìn)了腫瘤耐藥性的發(fā)生。例如，從HCC細(xì)胞中分離的外泌體表現(xiàn)出將正常肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）轉(zhuǎn)化為CAF的強(qiáng)大能力，因?yàn)橥饷隗wmiR-21直接靶向PTEN，導(dǎo)致HSC中PDK1/AKT信號通路的激活。此外，活化的CAF通過分泌血管生成細(xì)胞因子（包括 VEGF、MMP2、MMP9 和 TGF-β）進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［27］。CAF 分泌的外泌體也會促使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。順鉑和紫杉醇通過激活泛素特異性蛋白酶 7/異質(zhì)核核糖核蛋白A1軸促進(jìn)CAF分泌miR-522，從而抑制手性脂氧合酶15并減少癌細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物的積累，最終導(dǎo)致化療敏感性降低［28］。在HCC細(xì)胞中，外泌體作為信息載體，介導(dǎo)TME中各種細(xì)胞類型之間的通訊，從而導(dǎo)致耐藥性的獲得［29］。

2 外泌體作為預(yù)測HCC治療敏感度的生物標(biāo)志物

在血漿或血清中發(fā)現(xiàn)的外泌體不僅來自血細(xì)胞，還來自全身組織。這表明外泌體可能會作為監(jiān)測腫瘤耐藥性的循環(huán)生物標(biāo)志物［30］。幾種 miRNA 已被證明可用作 HCC 預(yù)后的預(yù)測性生物標(biāo)志物。最近的研究表明，miR-92a、miR-221、miR-487a 或 miR-1468 的高表達(dá)與HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)［31-34］。相反，miR-33a、miR-137、miR-194 或 miR-940 的下調(diào)導(dǎo)致 HCC的不良預(yù)后［35-37］。靶向 PTEN 的外泌體 miR-32-5p 的高表達(dá)表明 HCC 患者預(yù)后不良［38］。外泌體 miR-93 和 miRNA-665 的過表達(dá)在HCC患者中均顯示出較短的存活時間，這表明血清外泌體miRNA 既可用于診斷，也可作為肝癌預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。由于血液中外泌體 miRNA 的穩(wěn)定存在，外泌體診斷標(biāo)志物甚至比經(jīng)典的血清標(biāo)志物甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP） 具有優(yōu)勢。多項(xiàng)研究證實(shí)，外泌體 miR-125b［39］、 miR-9-3p［40］、和 miR-10b-5p 對HCC患者診斷的敏感性和特異性明顯優(yōu)于常規(guī)血清 AFP［41］。

外泌體也在其他腫瘤中顯示出了作為預(yù)測治療敏感度的生物標(biāo)志物的潛力。例如，循環(huán)外泌體中miRNA的表達(dá)程度與鉑類耐藥和卵巢癌的復(fù)發(fā)有關(guān)［42］。miR-891a-5p在復(fù)發(fā)性卵巢癌患者中高表達(dá)，而在未復(fù)發(fā)的患者中則低表達(dá)。轉(zhuǎn)染miR-891a-5p的上皮性卵巢癌細(xì)胞增加了參與DNA修復(fù)機(jī)制的G2/M檢查點(diǎn)蛋白的表達(dá)，這可能與順鉑耐藥性和高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)［43］。順鉑耐藥卵巢癌患者血清外泌體中circRNA Foxp1表達(dá)上調(diào)，而circRNA Cdr1as表達(dá)下調(diào)［44］。在鉑類耐藥卵巢癌細(xì)胞中，外泌體pGSN表達(dá)顯著增加已被認(rèn)為是化療耐藥的生物標(biāo)志物［45］。

綜上所述，外泌體作為“液體活檢”的重要組成部分，揭示了外泌體在耐藥機(jī)制中的潛在作用，在腫瘤的精準(zhǔn)診斷和治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。外泌體是大分子物質(zhì)的載體，在機(jī)體細(xì)胞的信息交換和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的生理作用。外泌體具有穩(wěn)定性高、含量豐富、無創(chuàng)性和快速檢測等優(yōu)點(diǎn)，有望成為新型循環(huán)生物標(biāo)志物，具有潛在的臨床疾病輔助診斷應(yīng)用價(jià)值。

3 外泌體作為逆轉(zhuǎn)HCC耐藥性的新型治療手段

外泌體作為細(xì)胞間蛋白質(zhì)和核酸的天然載體，它們能夠穿過脂質(zhì)雙層分子膜結(jié)構(gòu)，有相當(dāng)多的研究表明外泌體可以有效傳遞藥物或基因。例如，將阿霉素通過電穿孔的方式裝載到外泌體中能夠更迅速地在乳腺癌細(xì)胞中進(jìn)行藥物的吸收和分布［46］。負(fù)載miRNA-126的外泌體調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT信號通路，從而減少人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的增殖和遷移［47］。此外，將外泌體表面的CD47激活后可以使外泌體避免單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬作用，使得裝載Erastin的CD47+外泌體在肝癌組織中的分布效率更高，在體外和體內(nèi)都可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的鐵死亡［48］。外泌體作為人體的天然產(chǎn)物，與其他用于藥物或基因遞送的合成納米載體相比具有許多優(yōu)勢，例如低免疫原性、高生物相容性和高遞送效率［49］。此外，外泌體在循環(huán)系統(tǒng)中具有良好的穩(wěn)定性，這使它們能夠在體內(nèi)長距離行進(jìn)，并在生理和病理?xiàng)l件下將它們的貨物運(yùn)送到靶細(xì)胞。外泌體具有類似胞質(zhì)溶膠的核心，這使其成為水溶性藥物的合適載體［50］。例如，通過電穿孔從載有 5-FU和 miR-21i 的供體細(xì)胞中純化工程化外泌體，將其引入抗 5-FU 的結(jié)直腸癌細(xì)胞系 HCT-116/5FR，與 miR-21i 或 5-FU 的單一治療相比，miR-21i 和 5-FU 與工程外泌體的組合遞送有效地逆轉(zhuǎn)了耐藥性并顯著增強(qiáng)了 5-FU 對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性［51］。將順鉑轉(zhuǎn)移到外泌體中，亦顯著提高了順鉑在人卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥株A2780/DDP細(xì)胞中的細(xì)胞毒作用［52］。這些天然納米顆粒被廣泛用作常規(guī)藥物、基因和其他天然化合物的遞送系統(tǒng)。

除此之外，通過抑制外泌體的生物發(fā)生來維持細(xì)胞內(nèi)藥物濃度或從外泌體內(nèi)輸出誘導(dǎo)耐藥性物質(zhì)也是未來逆轉(zhuǎn)肝癌化療耐藥的新目標(biāo)。盡管在HCC方面的相關(guān)研究較少，但在其他幾種癌癥類型中進(jìn)行了研究。例如，B細(xì)胞淋巴瘤分泌的CD20+外泌體，可以作為利妥昔單抗的靶點(diǎn)，CD20+外泌體通過抗原抗體結(jié)合的方式，大量消耗了游離利妥昔單抗的數(shù)量，減少了有效到達(dá)腫瘤細(xì)胞的藥物分子的數(shù)量。相反，通過吲哚美辛阻斷外泌體的生物生成，恢復(fù)了治療益處［53］。脂肪細(xì)胞外泌體中的甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白（microsomal triglyceride transfer protein，MTTP）表達(dá)增加，可作為鐵死亡的抑制劑，降低了結(jié)直腸癌細(xì)胞鐵死亡的敏感性，從而促進(jìn)了對奧沙利鉑的耐藥性。相反，靶向分泌型 MTTP 的治療可能會逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中奧沙利鉑耐藥性。證明MTTP的抑制增加了對化療的敏感性［54］。外泌體的靶向治療可能是逆轉(zhuǎn)HCC耐藥性的新方案。

4 總 結(jié)

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，HCC在診斷、治療方面已取得了顯著的進(jìn)步，但仍需進(jìn)一步明確腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。目前HCC治療的有效手段是化療，但HCC對化療藥物產(chǎn)生的耐藥性是目前面臨的一個主要障礙，需要找到化療耐藥的根源，更好地解決化療耐藥這一難題。外泌體作為生物活性成分，將蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、mRNA、ncRNA等物質(zhì)從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，在HCC的耐藥、監(jiān)測、轉(zhuǎn)移和治療中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，為臨床治療HCC提供了新思路。盡管尚未完全明確耐藥相關(guān)機(jī)制，但外泌體在腫瘤的化療耐藥中的研究已取得了一定成果。在今后的研究中，明確HCC耐藥過程中外泌體介導(dǎo)的具體分子機(jī)制變得尤其重要，可為靶向治療及利用外泌體的新型治療提供重要的理論依據(jù)。希望研究人員能夠深入研究這一新興領(lǐng)域，并設(shè)計(jì)出基于外泌體的策略來克服腫瘤治療中的耐藥性，這將是腫瘤治療中最具前景和最具挑戰(zhàn)性的問題。

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