2022年諾貝爾化學獎解讀
——點擊化學和生物正交化學

宋新強, 張 玉, 程永明,任雨軒,田梓煜,張 牧

(1. 信陽師范大學 a. 生命科學學院; b. 醫(yī)學院; c. 校醫(yī)院, 河南 信陽 464000;2. 河南中醫(yī)藥大學 第二臨床醫(yī)學院, 河南 鄭州 450003; 3. 河南科技大學 動物科技學院, 河南 洛陽 471000)

0 引言

2022年,丹麥科學家莫滕·梅爾達爾(Morten MELDAL)、卡爾·巴里·夏普利斯(Barry SHARPLESS)和美國科學家卡羅琳·貝爾托齊(Carolyn BERTOZZI)被授予諾貝爾化學獎,表彰他們?yōu)樯镎换瘜W(Bioorthogonal chemistry)和點擊化學(Click chemistry)的發(fā)展所做出的貢獻。其中, SHARPLESS和MELDAL 兩位科學家開發(fā)了實現(xiàn)分子多樣性與功能化的點擊化學反應;而BERTOZZI則將點擊化學的應用從化合物的合成推向生物學細胞的應用,即生物正交化學。點擊化學和生物正交化學是化學學科發(fā)展的一次自我革新和進化[1]。

1 點擊化學

自18世紀現(xiàn)代化學誕生以來,許多化學家都嘗試通過人工合成來構建復雜的分子。然而,復雜的分子在合成過程中,通常產(chǎn)生很多不需要的產(chǎn)物,這些產(chǎn)物最終又需要很多步驟來純化。在傳統(tǒng)的有機合成過程中,科學家們更側重于通過碳碳鍵(C-C)的構建,來合成復雜的分子結構,這一技術路線誕生了以WOODWARD和COREY 等為代表的全合成大師[2]。不過,這一技術路線的弊端也逐漸顯現(xiàn):如或操作難度高,或產(chǎn)率較低,或生產(chǎn)成本高。

2001年,SHARPLESS[3]提出了“點擊化學”的概念,旨在避開前述傳統(tǒng)技術路線,新開辟碳-雜原子鍵(C-X-C)這一方法作為有機合成基礎,并借此來簡單、高效地獲得新的化學分子。2002年, SHARPLESS和MELDAL都發(fā)表了一價銅催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應(Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition,CuAAC), 這種點擊反應具有產(chǎn)率高、室溫下可以進行、應用范圍廣、產(chǎn)物容易純化的優(yōu)點[4-5]。

“點擊化學”的英文表述為Click chemistry,這句話來源于Click it or ticket it這句美國話。Click reaction意指化學反應像系安全帶“喀噠”一聲即可反應完成?！包c擊化學”意指小分子可以通過快速拼接即可以實現(xiàn)大分子的合成(見圖1)。

注:A.點擊反應卡通示意圖,B.銅催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應示意圖。圖1 改變化學界的點擊反應Fig. 1 The click reaction that changed chemistry

目前,常用的點擊化學反應主要包括環(huán)加成反應(疊氮-炔-惠斯根1,3-二極環(huán)化反應和雜二阿爾德環(huán)化反應)、親核開環(huán)反應(雜環(huán)化合物的親核開環(huán)反應,如氮丙啶、環(huán)氧化物、氮丙啶離子、表磺離子和環(huán)狀硫酸鹽)、羰基縮合(非醛基羰基型反應,如形成腙、肟醚、酰胺和芳香雜環(huán))和加成反應(對碳-碳多鍵的加成,主要是邁克爾加成,如胺-烯、硫醇-烯和硫醇-炔加成)4 類[6](見圖2)。其中,銅催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應(CuAAC) 是較為經(jīng)典的點擊化學反應,該反應是指由Cu+催化疊氮化合物與炔基化合物,生成三唑五元環(huán)化合物的共價加成反應。

注:A. 環(huán)加成反應:(1)銅催化的疊氮-烯烴環(huán)化,(2)正常的雜環(huán)Diels-Alder反應;B. 親核開環(huán)反應:(3)環(huán)氧化物親核開環(huán)反應,(4)氮丙啶的親核開環(huán)反應;C. 羰基縮合:(5)形成腙羰基縮合反應,(6)形成肟的羰基縮合反應;D. 加成反應:(7)硫醇-烯加成反應的代表例子,(8)邁克爾加成反應。圖2 點擊反應的類型Fig. 2 Types of click reactions

在這些早期應用實例中,CuAAC作為生物正交化學的能力得到了清楚的證明。然而,同時也暴露了局限性。第一個問題是CuAAC的效率與在有機溶液環(huán)境下相比大幅下降,這就需要加入三唑胺配體TBTA。TBTA在緩沖液或介質中均能提高反應速率和產(chǎn)率,但溶解性較差。第二個問題是副反應,在有機條件下,觀察到副產(chǎn)物如二炔、雙嘧唑和5-羥基三唑。當應用于緩沖條件時,表面標記和過量炔試劑的ABPP方法均出現(xiàn)了非特異性反應。末端炔在Cu(Ⅱ)催化下氧化偶聯(lián)生成副產(chǎn)物二炔。第三個最嚴重的問題是銅離子引起的毒性,銅離子很容易被天然氨基酸殘基螯合,破壞蛋白質的結構和功能,并能誘導活性氧(ROS)的形成,在細胞表面連接CuAAC的大腸桿菌細胞轉移回正常培養(yǎng)基后無法分裂增殖,高于微摩爾濃度的銅離子會造成嚴重的細胞損傷甚至死亡;除了Cu(Ⅰ)的毒性外,高濃度含Cu(Ⅱ)的三唑產(chǎn)物可引起CPMV衣殼等生物分子復合物的分解和降解。考慮到這3個主要的局限性,雖然CuAAC在生物系統(tǒng)中證明了其正交性和有效性,但在細胞內(nèi)的早期應用實例很少。為了進一步拓寬CuAAC作為生物正交化學在生命系統(tǒng)中的應用范圍,必須克服這些障礙[7-8]。

2014年 SHARPLESS又與中國學者董佳家課題組[9]一起發(fā)現(xiàn)了第二個點擊化學反應——六價硫氟交換反應(Sulfur fluoride exchange,SuFEx)。簡言之,SuFEx 是磺酰氟(-SO2F)等與甲硅烷基醚反應生成磺酸酯等。硫氟鍵(S-F)具有很高的化學穩(wěn)定性,又可通過親核取代發(fā)生脫氟反應,硫氟交換反應利用硫氟(S-F)官能團,通過乙烯基磺酰氟(ESF)等含氟含硫砌塊與胺等發(fā)生反應,得到硫氟交換底物,從而實現(xiàn)化學反應,被稱為新一代點擊化學,成為當前有機氟化學研究的新熱點(見圖3)。此反應受空氣等環(huán)境因素影響,具有良好的熱穩(wěn)定性,解決了經(jīng)典點擊化學反應的許多問題。

圖3 硫氟交換點擊化學Fig. 3 Sulfur fluoride exchange (SuFEx) click chemistry

2 生物正交化學

自從SHARPLESS和MELDAL 等[4,10]報道了銅離子催化的疊氮和炔基快速反應的點擊化學之后,很多科學家開始使用此方法對生物分子進行標記和應用。由于銅離子的細胞毒性,限制了其在生物活體內(nèi)的應用。

BERTOZZI 也在研究這一難題,她在研究一類聚糖,聚糖通常位于細胞的表面,產(chǎn)于生物化學過程,唾液酸參與構成聚糖。BERTOZZI 通過實驗設計,預先化學修飾唾液酸,修飾過的唾液酸又參與構成聚糖,通過培養(yǎng)基培養(yǎng),使細胞表面聚集帶有修飾的唾液酸參與的聚糖。例如,提前將熒光分子連接唾液酸,熒光就能在細胞中定位唾液酸參與構成的聚糖。但是,她必須保證,引入的化學基團不能與細胞中的其他物質發(fā)生反應,即不能干擾細胞的正?；瘜W反應。為此,BERTOZZI 團隊引入一個術語 “生物正交”反應( Bioorthogonal reaction)[11],即能夠在生物體系中進行、且不會干擾天然生物化學過程。

2000 年,BERTOZZI[12-14]利用疊氮化物(Azide)成功將熒光分子與引入聚糖中的疊氮化物連接起來。疊氮基團不會影響細胞,甚至也可以被引入到活體生物中(見圖4)。

后來她發(fā)現(xiàn),將炔烴連接到環(huán)狀化學結構上,即使沒有銅催化,疊氮化物和炔烴也可以快速反應,因為張力產(chǎn)生的能量使反應平穩(wěn)進行。2004 年,她發(fā)表 “環(huán)張力促進的疊氮-炔環(huán)加成”( Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition,SPAAC) 反應的論文[15],指出該類生物正交化學在沒有銅催化劑參與下,利用了環(huán)狀炔烴本身的高環(huán)張力,進行的疊氮-炔環(huán)加成反應。在SPAAC 反應中,共軛和位阻效應對SPAAC 反應活性有影響(見圖5)。環(huán)狀炔烴的合理設計,是反應的關鍵,因為它為反應驅動提供動力來源,也是發(fā)展和完善SPAAC關鍵環(huán)節(jié)。 BERTOZZI 團隊的工作使點擊化學進入了無銅催化階段,使點擊化學在生物體內(nèi)安全高效進行。這個里程碑式的研究,使科研人員可以用來探索生物分子在細胞定位和相互作用,以及探索疾病的發(fā)展規(guī)律與治療方法。

圖5 SPAAC生物正交化學追蹤聚糖的原理示意圖Fig. 5 Schematic diagram of the principle of tracing glycans by SPAAC bioorthogonal chemistry

3 點擊化學和生物正交化學在生命科學領域的應用

3.1 點擊化學在蛋白質組學中的應用

近年來,點擊化學結合蛋白質質譜法,在蛋白質組學研究方面得到廣泛應用。通過在小分子活性基團加上接頭,再連接炔基,這樣就形成一個帶有炔基的探針。報告基團通常與疊氮基相連,包括兩類:一類熒光素、Cy3/Cy5 等的熒光基團,當被探針標記的蛋白質組在聚丙烯酰胺凝膠上分離時,被標記的蛋白就會顯示出便于檢測的特定熒光信號;另一類是生物素基團(Biotin), 被探針標記的蛋白既可以通過免疫印跡法檢測,還可以被特異地富集并進行鑒定(見圖6)。基于該方法,科學家們首先合成了一系列活性小分子探針,采用點擊化學的方法在蛋白質組層面找到了其作用靶標,如穿心蓮內(nèi)酯、姜黃素、青蒿素等[16]。

圖6 基于點擊化學的天然產(chǎn)物靶點鑒定的方法Fig. 6 Identification of natural products targets based on click chemistry

3.2 生物正交化學在活體標記與示蹤中的應用

在活細胞中,蛋白質、糖類和脂質都可以被生物正交基團修飾(見圖7)。生物正交基團以化學合成的方法連接到代謝類似物上,在生成發(fā)育過程中,生物正交基團被引入到細胞,隨后通過使用探針,即配對基團,可以標記和定位目標分子,進而確定細胞或目標分子的位置與功能。

圖7 生物正交化學標記生物分子Fig. 7 Bioorthogonal labeling of biomolecules

點擊化學被公認為可以提供多種多價新糖共軛物,包括糖聚合物、糖肽、糖二聚體、糖簇、糖胞、大分子和糖陣列。BERTOZZI 的團隊[11,15]利用糖代謝工程與生物正交化學,分析了糖類在活斑馬魚的胚胎發(fā)育過程中的作用。在斑馬魚胚胎發(fā)育的不同階段,加入環(huán)辛炔功能化的唾液酸,在生長的過程中,唾液酸被細胞攝取并被引入細胞表面的糖蛋白上,隨后與配對基團修飾的熒光探針發(fā)生生物正交,通過此方法,可以直觀地看見糖類在斑馬魚胚胎發(fā)展過程中定位表達和動力學過程(見圖8)。

圖8 疊氮修飾半乳糖在代謝過程中被加入到斑馬魚聚糖Fig. 8 Ac4GalNAz is metabolically incorporated into zebrafish glycans

3.3 生物正交化學在免疫治療中的應用

免疫治療通常需要治療靶點,可以通過生物正交化學,將化學基團引入到腫瘤細胞或病原體的表面,形成人工靶點;也可以將此方法應用于藥物的靶向傳遞,能提高藥物的利用率和降低毒副作用。目前,生物正交化學反應已被應用于成像顯示劑以及抗腫瘤藥物的靶向運輸,體內(nèi)示蹤和靶向腫瘤治療效果明顯(見圖9)。

注:A.疊氮修飾的T細胞膜仿生納米顆粒的制備;B.腫瘤的糖代謝標記與T細胞膜納米藥物的腫瘤光熱靶向治療。圖9 細胞糖代謝生物正交標記用于抗腫瘤藥物的靶向遞送Fig. 9 Schematic illustration of tumor targeted drug delivery based on the metabolic glycoengineering and biorthogonal chemistry

免疫治療也應用到了腫瘤治療,生物正交化學反應也可用于免疫增強劑的傳遞,增加免疫治療的效果。用疊氮化的糖預處理腫瘤細胞使其表達N3基團,將不同的免疫刺激物與二苯并環(huán)辛炔(Dibenzocyclooctyne,DBCO)基團進行偶聯(lián),隨后通過生物正交化學反應將免疫增強劑連接到腫瘤細胞表面,成功引入的免疫增強劑可以激活動物的抗腫瘤能力,抑制腫瘤的發(fā)育[17](見圖10)。

注:A.疊氮修飾的T細胞膜仿生納米顆粒的制備;B.腫瘤的糖代謝標記與T細胞膜納米藥物的腫瘤光熱靶向治療。圖10 基于點擊化學的活體組織靶向技術Fig. 10 Active tissue targeting via anchored click chemistry

4 展望

生物正交化學已經(jīng)成為一種可行的方法,可以在以前無法想象的情況下構建復雜的分子。生物正交化學性的影響已經(jīng)廣泛應用于蛋白質合成、藥物發(fā)現(xiàn)、體內(nèi)化學和聚合物科學。展望未來,生物正交化學將繼續(xù)發(fā)展成為一種能夠遞送新藥、創(chuàng)造新材料和回答現(xiàn)代分子生物學工具(如GFP和CRISPR-Cas9)或小分子配體無法解決的生物學問題的工具。盡管生物正交化學在開發(fā)和應用方面取得了巨大的進展,但仍有許多工作要做。

雖然所有的生物正交基團的分子量都比直接表達的蛋白質標簽低得多,但生物正交連接物仍然代表著對所研究的生物系統(tǒng)的擾動,而且笨重的衍生物可能不被用于將標簽合并到生物靶標的酶機制所接受。目前仍需要小型、安全、穩(wěn)定、具有快速動力學的新試劑,對在活細胞和動物體內(nèi)有效工作的試劑具有很高的價值。最初最小化生物正交基團的大小和改善生理特性的努力已經(jīng)成功,但很少有雙正交反應能產(chǎn)生天然的生物鍵,如酰胺。能夠在生命系統(tǒng)中快速生成天然共價鍵的新型反應將是化學生物學的寶貴工具?！罢簧镎弧狈磻牟粩喟l(fā)展,使得在生命系統(tǒng)中同時使用多個生物正交化學物對成為可能,提供了對所研究的生物系統(tǒng)的另一種控制水平,具有十分重要的價值。

通過開發(fā)將生物正交化學與活體系統(tǒng)中的成像相結合的方法,生物成像已經(jīng)取得了進展。熒光生物正交化學的發(fā)展以及體內(nèi)放射化學的創(chuàng)新已經(jīng)成為從細胞到整個動物水平的強大成像工具。需要通過改善非特異性相互作用或可能降低信噪比的副反應,繼續(xù)推動檢測的極限,從而實現(xiàn)成像的新領域,包括低豐度生物分子目標(如內(nèi)源性蛋白質)的活體細胞成像,以及開發(fā)用于臨床診斷、監(jiān)測和分期人類疾病的體內(nèi)方法。這些發(fā)展將受益于正在進行的合成復雜染料和熒光團的努力,這些染料和熒光團具有定制設計的物理特性,可以照亮復雜生物系統(tǒng)中的單個生物分子。

近年來,在生物大分子上定點附著生物正交手柄的化學技術取得了巨大的進步。安裝獨特的反應性多肽標簽的重組方,法簡化了在蛋白質目標上的位點特異性結合,具有廣泛的底物范圍。但這些方法確實存在轉換不完全的問題,而且需要高濃度的試劑,這導致體內(nèi)使用有限。遺傳密碼的擴展也有助于安裝具有氨基酸精度的生物正交手柄,不需要額外的肽標簽。然而,為了適應新的底物,往往需要對其進行廣泛的重新設計。在一個具有廣泛底物范圍的活體系統(tǒng)中,將小分子定量、非侵入性、高純度、位點特異性地附著在蛋白質上的簡單方法是非常可取的,它代表了一種理想化的蛋白質共軛方法,值得努力。大量的努力都集中在蛋白質共軛策略上,將這些策略擴展到其他生物大分子和復雜代謝物在很大程度上仍尚待開發(fā),這是新方法的關鍵領域。

炔烴與酰基疊氮化物在正常條件下的反應有時是非常復雜的。因此,除了已知的銅催化劑外,還需要發(fā)現(xiàn)更多合適的催化劑,譬如金屬銥、鈀、銀等介導的生物正交偶聯(lián)反應。通過使用簡單的疊氮化物或烷基以外的支架,在溫和條件下提供所需的區(qū)域選擇性產(chǎn)品,還需要探索點擊化學的多組分方法,因為這可以為該領域增加新的內(nèi)容。光化學也為研究具有時空精度的細胞過程提供了一種強大的方法。展望未來,光導生物正交化學提供的控制可能使單個生物分子動態(tài)的實時成像成為可能,并為闡明生物分子在信號通路中的功能提供工具?；诮M織滲透的近紅外光的光誘導生物正交化學的發(fā)展,可提供在體內(nèi)誘導快速反應的能力,為研究活體動物的發(fā)病機制提供新的精確水平。

從有機化學和生物學的交叉,生物正交化學已經(jīng)成為構建生物分子和在其原生環(huán)境中研究它們的基本方法。隨著不斷增長的勢頭,生物正交化學正在推動生物學和生物醫(yī)學的研究,并通過廣泛的應用影響著各個學科的發(fā)展。