廣西柑橘衰退病和黃脈病調(diào)查及其病原病毒的遺傳多樣性分析

耿雪欣　高方欄　梁文馨等

關(guān)鍵詞 柑橘衰退病毒；柑橘黃脈病毒；病原檢測(cè)；遺傳多樣性分析

中圖分類號(hào)：S 432. 41 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI： 10.16688/j.zwbh 2022391

柑橘是全球最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，是世界第一大類水果[1]。廣西是我國(guó)最大的柑橘種植區(qū)，隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，柑橘病毒病的威脅越來(lái)越大。柑橘衰退病由柑橘衰退病毒（citrus tristeza vi-rus，CTV）引起，是柑橘產(chǎn)業(yè)中最具毀滅性的病毒病害之一，導(dǎo)致柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)降低，樹勢(shì)衰弱甚至死亡。CTV是長(zhǎng)線形病毒科Closteroviridae長(zhǎng)線形病毒屬Closterovirus成員，為正義單鏈RNA（posi-tive single strand RNA，+ssRNA）病毒?；蚪M長(zhǎng)約20 kb[2]，含有12個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF），被認(rèn)為是目前已知最大的植物RNA病毒[3]。CTV有外殼蛋白（coat protein，CP）和小外殼蛋白（minor coat protein，CPm）兩種外殼蛋白[4]。其中，CP基因位于ORF 7，是CTV病毒顆粒的主要組裝成分[5]。通常，CP和CPm的序列表現(xiàn)出很大程度的保守性[6]。有研究表明，CTV的CP具有RNA沉默抑制活性，會(huì)極大地促進(jìn)病毒顆粒的積累，是其致病性的重要決定因素。在我國(guó)，多個(gè)柑橘產(chǎn)區(qū)如四川、重慶，廣西、江西等地均陸續(xù)有柑橘感染CTV的報(bào)道[8]。柑橘黃脈病由甲型線性病毒科Alpha flexiviridae印度柑橘病毒屬M(fèi)andarivirus的柑橘黃脈病毒（citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）引起，癥狀表現(xiàn)為葉片脈明黃化，并伴隨皺縮、反卷，葉背水漬狀等，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致樹勢(shì)減弱，果實(shí)減產(chǎn)。CYVCV為+ssRNA病毒，含有6個(gè)開放閱讀框，其中CP由ORF 5編碼，對(duì)核酸起保護(hù)作用，決定了病毒的寄主范圍、細(xì)胞內(nèi)系統(tǒng)侵染能力、癥狀表現(xiàn)和向外擴(kuò)散傳播的能力[9]。目前，我國(guó)已報(bào)道的CYVCV分離物主要來(lái)源于浙江、江西、湖北、湖南、廣東、廣西、福建、云南、四川和重慶等地[10]。該病毒可通過(guò)嫁接和介體昆蟲傳播，在我國(guó)主要柑橘產(chǎn)區(qū)常與CTV發(fā)生混合感染[11]。

病毒的CP基因具有序列保守的結(jié)構(gòu)域，不僅可用于病毒的分子檢測(cè)，還可以進(jìn)行同種病毒不同分離物和不同種病毒之間的遺傳多樣性分析[12]。本研究通過(guò)調(diào)查廣西百色、北海、崇左、貴港、桂林、河池、賀州、來(lái)賓、柳州、南寧、梧州、玉林等柑橘產(chǎn)區(qū)的衰退病和黃脈病發(fā)生情況，對(duì)CTV和CYVCV陽(yáng)性樣品的CP基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增測(cè)序，了解這兩種病毒CP基因序列的遺傳多樣性及其與地理來(lái)源和寄主來(lái)源的相關(guān)性，為病毒的流行監(jiān)測(cè)、早期診斷和抗病品種培育提供參考。

1材料與方法

1.1材料

2020年9月到2021年9月間，采集廣西百色、北海、崇左、貴港、桂林、河池、賀州、來(lái)賓、柳州、南寧、梧州、玉林等12個(gè)柑橘產(chǎn)區(qū)多個(gè)柑橘品種的葉片樣品共737份。柑橘類樣品包括‘沃柑’‘砂糖橘’‘馬水橘’‘蜜橘’‘八月橘’‘茂谷柑’‘貢柑’‘金橘’‘皇帝柑’和‘溫柑’等；橙類樣品包括‘蜜香橙’‘臍橙’‘冰糖橙’和‘紅江橙’等；柚類樣品包括‘青柚’‘沙田柚’‘蜜柚’和‘紅心柚’等。疑似感染病毒病樣品的癥狀包括明顯的植株矮小和生長(zhǎng)遲緩，葉片變小、斑駁、皺縮以及葉脈變黃。樣品置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2總RNA提取和RT-PCR

取0.1 g左右的柑橘葉片樣品置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，用TRIzol法提取葉片總RNA[13]。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（百邁客生物科技有限公司）合成cDNA。反應(yīng)體系為20μL，包括：總RNA 1.0μg， d（T）23VN 2.0μL， 10mmol／LdNTPs 1.0μL， Biomarker Script Ⅱ Reaction Mix（2×）

10.0μL， Biomarker ScriptⅡEnzyme Mix（10×）2.0μL，Nuclease-free H20補(bǔ)充至20μL;常溫下靜置反應(yīng)5 min后，42℃溫浴th。然后用CTV與CYVCV的特異性引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括：2×TaqMaster Mix 12.5μL，上、下游引物各1.0μL，模板cDNA 1.0μL，ddH20 9.5μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s，退火溫度下退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。使用凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]回收特異性條帶。純化的PCR產(chǎn)物委托南寧鑫金生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3序列分析

利用NCBI （National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST程序（https：∥blast.ncbi.nlm.nih. gov／Blast.cgi）進(jìn)行序列比對(duì)。采用Vector NTI軟件進(jìn)行序列一致性、核苷酸遺傳距離分析，DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)。從Gen-Bank基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中檢索所有柑橘病毒相關(guān)序列后，通過(guò)Clustal W程序和默認(rèn)參數(shù)將代表性的特定CP基因序列與本研究中獲得的分離物的CP基因序列進(jìn)行比較和分析，選擇具有代表性的病毒CP序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析。使用MEGA-X軟件最大似然（maximum likelihood estimate，MLE）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展檢驗(yàn)法（bootstrap）重復(fù)取值1000次，根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析各分離物與地理來(lái)源和宿主的相關(guān)性。

2結(jié)果與分析

2.1田間癥狀

田間柑橘病毒病發(fā)生普遍，癥狀表現(xiàn)復(fù)雜多樣，包括植株矮化、樹勢(shì)弱、葉脈黃化、葉片脈間失綠和葉片黃化等。其中感染CTV的植株整體長(zhǎng)勢(shì)衰弱，果實(shí)小，葉片小、黃化、葉片脈間失綠，似缺素癥狀；感染CYVCV的則表現(xiàn)為葉脈透明和黃化等。結(jié)合病毒檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)受CYVCV侵染的植株僅在葉片表現(xiàn)癥狀，枝條和果實(shí)尚未觀察到典型的癥狀，部分無(wú)癥狀的樣品也檢出病毒。調(diào)查發(fā)現(xiàn)的2種柑橘病毒病田間典型癥狀見圖1。

2.2病毒檢出率

CTV和CYVCV的檢出率在不同地區(qū)的樣品間存在差異（表2）。CTV的總檢出率為20.62%，CYVCV的總檢出率為18.32%。貴港市樣品中兩種病毒均未檢測(cè)出，崇左市樣品中未檢測(cè)出CTV，百色市和梧州市的樣品中未檢測(cè)出CYVCV。此次檢測(cè)中賀州市樣品的CTV和CYVCV檢出率最高，分別為63.64%和50.00%。CTV和CYVCV復(fù)合侵染的情況普遍存在，復(fù)合侵染率為34.50%。

此外，不同柑橘品種中CTV和CYVCV檢出率也存在差異（表3）。CTV在橙類上的檢出率最高，為26.58%; CYVCV在柑橘類上的檢出率最高，為19.83%；在柚類樣品上兩種病毒的檢出率均最低，均為8.82%。

2.3 CTV和CYVCV的核苷酸序列一致性和多重比對(duì)分析

選擇來(lái)源于不同地區(qū)和不同柑橘品種的CTV和CYVCV陽(yáng)性樣品，對(duì)其CP基因片段進(jìn)行克隆測(cè)序，共獲得12個(gè)CTV分離物和6個(gè)CYVCV分離物的CP基因序列片段（表4）。12個(gè)CTV分離物CP基因的核苷酸序列相似性在88.3%～98.3%，存在87個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)。其中來(lái)賓的CTV分離物L(fēng)B52與北海分離物k2420的遺傳差異最大，核苷酸遺傳距離為0.13，其余CTV分離物之間核苷酸遺傳距離在0.018～0. 123，遺傳變異較小。對(duì)12個(gè)CTV分離物的核苷酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)CP基因的5′端出現(xiàn)較多堿基突變、缺失的現(xiàn)象，3′端區(qū)域相對(duì)較保守。

本研究獲得的6個(gè)CYVCV分離物的CP基因核苷酸序列較CTV分離物更為保守，遺傳變異較小，序列相似性為97.9%～100%，僅存在10個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)。其中，來(lái)賓分離物L(fēng)B71與其他分離物的遺傳差異最大，相似性在97.9%～98.4%。對(duì)CYVCV分離物CP基因的序列進(jìn)行多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)來(lái)自同一個(gè)采集地的CYVCV分離物L(fēng)B71、LB72、LB73的CP基因序列相似性為97.9%，存在10個(gè)堿基的差別，而地理位置相距較遠(yuǎn)的北海分離物k7093與桂林分離物GL71、GL72的CP基因序列相似性達(dá)99.2%，僅有3個(gè)堿基的差別。可能是由于近年來(lái)廣西柑橘種質(zhì)交流頻繁導(dǎo)致該病毒的流行，分離物間尚未因地理隔離出現(xiàn)顯著的序列差異。

2.4 CTV和CYVCV分離物的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于CTV的CP基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)CTV的分離物可聚為4個(gè)類群（圖2）。A類群的14個(gè)CTV分離物分別來(lái)自中國(guó)廣西（LB51、LB52、LB53和BH51）、意大利、南非、馬來(lái)西亞、美國(guó)和伊朗。值得關(guān)注的是廣西分離物L(fēng)B51與意大利分離物SG29的親緣關(guān)系最近，可能是國(guó)際種質(zhì)交流導(dǎo)致病毒傳人國(guó)內(nèi)。B類群的4個(gè)CTV分離物來(lái)自中國(guó)廣西（L251、GL53和k4138）和馬來(lái)西亞（AMJ31），其中分離物k4138與AMJ31聚在同一分支。C類群的4個(gè)CTV分離物來(lái)自中國(guó)廣西（k2420、GL51和GL52）和巴西（CSL01），其中分離物k2420與CSL01聚在同一分支。D類群的6個(gè)CTV分離物來(lái)自中國(guó)和美國(guó)，其中本研究獲得的廣西分離物k2051與美國(guó)分離物CA-S1-L聚在同一分支。分離物寄主以柑橘屬植物為主，包括柑橘類、橙類和柚類等，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，CTV分離物的聚類情況與寄主來(lái)源沒有明顯相關(guān)性。

以印度環(huán)斑病毒（Indian citrus ringspot virus，ICRSV，MN518760.1）為外群構(gòu)建CYVCV CP序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)CYVCV的分離物可聚為3個(gè)類群（圖3）。分離物寄主以柑橘屬植物為主，包括檸檬、甜橙、蜜橘和柚子等。A類群的14個(gè)CYVCV分離物來(lái)自中國(guó)廣西、四川、重慶、江西、云南等地，包括本研究獲得的廣西分離物GL71、GL72、LB71、LB72、LB73和k7093。來(lái)自伊朗柑橘分離物單獨(dú)聚在B類群，2個(gè)印度分離物組成了C類群。由系統(tǒng)進(jìn)化可知CYVCV的進(jìn)化與柑橘品種沒有明顯的相關(guān)性，但存在地區(qū)差異，且本研究獲得的所有CYVCV分離物與其他中國(guó)本土的分離物親緣關(guān)系較近，說(shuō)明它們可能為本土毒株。

3結(jié)論與討論

柑橘病毒病對(duì)我國(guó)柑橘產(chǎn)區(qū)的危害越來(lái)越嚴(yán)重，特別是CTV和CYVCV常常復(fù)合侵染植株，使癥狀加重，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重危害[11]。因此，了解CTV與CYVCV引起的衰退病和黃脈病在廣西柑橘產(chǎn)區(qū)的發(fā)生情況對(duì)柑橘病毒病的防控具有重要指導(dǎo)意義。本研究在廣西百色、北海、崇左等12個(gè)柑橘產(chǎn)區(qū)共采集了737份柑橘樣品，其中CTV的檢出率為20.62%，CYVCV的檢出率為18. 32%。與在海南地區(qū)的CTV檢出率（71.15%）[16]和福建三明地區(qū)CYVCV的檢出率（57%）[17]相比，廣西的CTV和CYVCV的檢出率總體相對(duì)較低，與Zhou等2017年報(bào)道的廣西CYVCV的檢出率（29.1%）相比，有所下降[18]。通過(guò)分析不同寄主品種上的柑橘病毒檢出情況，發(fā)現(xiàn)不同柑橘品種對(duì)CTV和CYVCV敏感性存在差異。柚類樣品上兩種病毒的檢出率均最低（8.82%）。利用寄主抗病性是控制植物病毒病害最有效的手段之一，針對(duì)本研究CTV和CYVCV在柚類樣品中檢出率最低這一發(fā)現(xiàn)，后續(xù)可從寄主一病毒互作的角度進(jìn)行深入研究，明確柚類對(duì)CTV和CYVCV是否確實(shí)存在較強(qiáng)抗性，為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有抗性資源和品種的合理利用，以及將來(lái)培育抗病毒柑橘新品種提供新思路。

本研究對(duì)獲得的12個(gè)CTV分離物和6個(gè)CYVCV分離物的CP基因的核苷酸序列進(jìn)行一致性分析，發(fā)現(xiàn)這兩種病毒的CP基因序列都較為保守，可以針對(duì)其保守序列探索多種檢測(cè)方法。如設(shè)計(jì)重組酶聚合酶快速擴(kuò)增技術(shù)的特異性引物、制備血清抗體等，為大規(guī)模田間快速診斷技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。另外對(duì)CTV的CP基因序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其序列多樣性從5′端到3′端逐漸減小，這與易龍[19]對(duì)11個(gè)野生柑橘和13個(gè)栽培品種上的CTV分離物CP基因序列遺傳多樣性的結(jié)果一致，Melzer等[20]對(duì)來(lái)自美國(guó)的CTV分離物的研究也得出這一結(jié)論。基于這12個(gè)CTV分離物CP基因5′端和3′端序列多樣性的研究，可以為CTV毒株的分離與鑒定提供理論依據(jù)，為尋找具有交叉保護(hù)作用的CTV弱毒株提供新的思路。

對(duì)CTV的CP基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)CTV分離物的序列變異與地理來(lái)源和寄主來(lái)源沒有明顯的相關(guān)性，說(shuō)明該病毒在世界各地廣泛傳播和分布，且適應(yīng)性較強(qiáng)，無(wú)明顯的地理和氣候條件限制。如本研究獲得的廣西LB51、k4138、k2420和k2051分離物相較本土分離物，分別與意大利、馬來(lái)西亞、巴西和美國(guó)的CTV分離物親緣關(guān)系更近。推測(cè)可能是由于國(guó)家間種質(zhì)交流頻繁或無(wú)性繁殖材料長(zhǎng)距離運(yùn)輸導(dǎo)致親緣關(guān)系較近的分離物在世界范圍內(nèi)不同地方出現(xiàn)。吳官維[21]將中國(guó)不同地區(qū)的CTV分離物和國(guó)外的CTV分離物的CP基因和CPm基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)不同地理來(lái)源的CTV分離物間存在明顯的基因漂移，各分離物間無(wú)明顯的地域相關(guān)性，與本研究結(jié)論一致。因此，在引種時(shí)要加強(qiáng)柑橘苗木的檢疫，或盡量種植脫毒苗木，以阻斷病毒的傳播。

利用CYVCV分離物CP基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，供試的CYVCV分離物可聚為3個(gè)類群，來(lái)自中國(guó)廣西、四川、重慶、江西、云南等地的14個(gè)CYVCV分離物聚為A類群，來(lái)自伊朗的CYVCV分離物組成了B類群，2個(gè)印度分離物單獨(dú)聚在C類群，表明CYVCV分離物與地理來(lái)源相關(guān)，但3個(gè)類群與寄主來(lái)源無(wú)明顯相關(guān)性。這與劉惠芳[22]和陳洪明等[23]對(duì)不同地區(qū)以及不同柑橘品種中得到的CYVCV分離物進(jìn)行遺傳多樣性分析得出的結(jié)論一致。Zhen等[24]對(duì)中國(guó)和土耳其的檸檬中獲得的2個(gè)CYVCV分離物的全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CYVCV的序列變異很小，不易因地理和寄主差異發(fā)生明顯變異。這可能是由于CYVCV入侵中國(guó)地區(qū)時(shí)間不長(zhǎng)，種內(nèi)尚未出現(xiàn)明顯變異與分化就廣泛傳播[18]。

群體遺傳多樣性的形成是一個(gè)長(zhǎng)期過(guò)程，與種質(zhì)交流、介體傳播、序列突變和自然選擇多種因素有關(guān)，本研究對(duì)廣西的CTV分離物和CYVCV分離物進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，研究結(jié)果可為深入了解CTV和CYVCV在廣西的流行情況以及柑橘病毒病的檢疫和防控提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。