SerpinB1a蛋白表達(dá)與小鼠酒精性脂肪肝發(fā)生及白藜蘆醇干預(yù)作用的相關(guān)性研究*

韓 敏,易 旭

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴陽(yáng) 550025;2．貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550003)

研究表明,長(zhǎng)期慢性酒精攝入能夠通過(guò)異常酒精代謝導(dǎo)致的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD+)百分比增加、氧化應(yīng)激誘導(dǎo)、脂質(zhì)代謝紊亂、抑制自噬等機(jī)制誘發(fā)肝細(xì)胞的脂肪變性[1],從而形成酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)[2]。自噬作為各種生理和疾病條件下細(xì)胞適應(yīng)和生存的一種重要機(jī)制,在維持細(xì)胞穩(wěn)定性中有著重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn),慢性酒精攝入能夠激活FK-506結(jié)合蛋白(FKBP)-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORc1)和抑制腺苷酸激活蛋白激酶表達(dá),通過(guò)抑制下游的Unc-51樣激酶1(ULK1)復(fù)合體形成導(dǎo)致自噬的抑制,出現(xiàn)肝細(xì)胞中脂質(zhì)的積累、線粒體穩(wěn)態(tài)失調(diào)和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLIP3)炎癥小體活化增多等從而促進(jìn)脂肪肝的形成[4-5]。因此,調(diào)節(jié)自噬是AFLD的一種潛在治療策略,這一認(rèn)識(shí)已在白藜蘆醇通過(guò)增加自噬體數(shù)量,上調(diào)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3Ⅱ)、Beclin1表達(dá),下調(diào)p62蛋白表達(dá)發(fā)揮抗AFLD的治療作用中得到驗(yàn)證[6]。研究發(fā)現(xiàn),酒精暴露還可以抑制自噬激活的另一重要調(diào)節(jié)分子叉頭框蛋白O1(FOXO1)的表達(dá),導(dǎo)致固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)與脂肪酸合成酶表達(dá)水平上調(diào),從而增加脂質(zhì)生成和誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死[7-9]。但酒精如何介導(dǎo)FOXO1表達(dá)抑制仍不清楚。LIANG等[10]發(fā)現(xiàn),主要在肝臟合成的絲氨酸蛋白酶抑制劑B1a(SerpinB1a)表達(dá)抑制會(huì)下調(diào)FOXO1表達(dá)水平,減弱FOXO1的抗氧化應(yīng)激作用,從而加重糖尿病性腎病中的氧化應(yīng)激反應(yīng)。這提示SerpinB1a對(duì)FOXO1表達(dá)水平的正向調(diào)控作用,但SerpinB1a是否參與AFLD的發(fā)生尚缺少文獻(xiàn)報(bào)道。已知磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(pSTAT3)可以通過(guò)對(duì)Bcl-2家族成員、自噬相關(guān)基因BECN1、磷脂酰肌醇3激酶C3(PIK3C3)等與自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)參與自噬的抑制或活化[11]。運(yùn)用乙醛脫氫酶2(ALDH2)基因敲除小鼠,發(fā)現(xiàn)激活STAT3可以通過(guò)減弱SREBP-1c基因轉(zhuǎn)錄、抑制脂肪酸合成和影響脂肪肝發(fā)展來(lái)減輕乙醇攝入引起的脂肪肝[12]。此外,pSTAT3在AFLD中通過(guò)上調(diào)自噬相關(guān)基因5(ATG5)的表達(dá)促進(jìn)自噬以發(fā)揮保護(hù)作用[13]。XU等[14]通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染抑制豬胰腺細(xì)胞SerpinB1a蛋白表達(dá),引起pSTAT3表達(dá)水平下調(diào),相反,過(guò)表達(dá)SerpinB1a蛋白則可以通過(guò)上調(diào)pSTAT3表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以促進(jìn)豬胰腺細(xì)胞增殖,提示了SerpinB1a與pSTAT3存在正調(diào)控關(guān)系。但尚未見(jiàn)肝臟相關(guān)疾病中有關(guān)SerpinB1a與pSTAT3調(diào)控關(guān)系的研究報(bào)道。

基于AFLD病理階段存在FOXO1和pSTAT3介導(dǎo)的肝臟自噬抑制作用及其分別與SerpinB1a的調(diào)控關(guān)系的研究認(rèn)識(shí),設(shè)想SerpinB1a在肝組織表達(dá)水平的變化可能與AFLD的發(fā)生有關(guān)。因此,本文采用4D非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定、分析了SerpinB1a蛋白在AFLD小鼠肝組織中的表達(dá)水平及其在白藜蘆醇抗AFLD干預(yù)機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取雄性無(wú)特殊病原體(SPF)級(jí)C57BL/6J小鼠9只[北京唯尚立德,SCXK(京)2016-0009],體重20～24 g,在有適宜溫度、濕度、光照的獨(dú)立通風(fēng)籠具(IVC)系統(tǒng)的動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)。將小鼠隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組(C組)、模型組(M組)、白藜蘆醇干預(yù)組(R組),每組各3只。

1.1.2主要試劑

95%乙醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);胰酶[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司];丙酮(浙江漢諾化工科技有限公司);蛋白酶抑制劑(美國(guó)Merck Millipore公司);碘乙酰胺、尿素、煙酰胺、二硫蘇糖醇、三氯乙酸及四乙基溴化銨(美國(guó)Sigma公司);甲酸(美國(guó)Fluka公司);去乙?；敢种苿?美國(guó)MedChemExpress公司);乙腈(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);超純水(美國(guó)Fisher Chemical公司)等。

1.2 方法

1.2.1AFLD小鼠模型建立及白藜蘆醇干預(yù)

參考文獻(xiàn)[15]方法進(jìn)行AFLD模型制備,即使用江蘇南通特洛菲標(biāo)準(zhǔn)型Lieber-DeCarli乙醇液體、對(duì)照液體飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后,自由進(jìn)食10 d乙醇液體飼料,第16天灌胃給予1次95%乙醇。經(jīng)鑒定模型制備成功后,按1次/d、400 mg/次灌胃給予白藜蘆醇溶液(美國(guó)Sigma公司,使用滅菌的30% Kolliphor HS15溶液配制),9 d后收集肝組織標(biāo)本,置于-80 ℃超低溫冰箱中以備蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)用。

1.2.2SerpinB1a蛋白的4D非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1.2.2.1鑒定思路

構(gòu)建UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源的小鼠肝組織標(biāo)本特異性蛋白數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行標(biāo)本總蛋白提取和胰酶酶解后的蛋白肽段制備,經(jīng)基于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的4D非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)獲得并分析標(biāo)本中肽段的質(zhì)量與信號(hào)強(qiáng)度,以及肽段碎裂后碎片離子的質(zhì)量和信號(hào)強(qiáng)度。利用Maxquant軟件(v1.6.15.0)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的檢索,通過(guò)算法打分過(guò)濾后獲得正確匹配的理論肽段序列。

1.2.2.2肝組織中總蛋白提取、胰酶消化

稱取適量小鼠肝組織樣品于液氮中充分研磨成粉狀并轉(zhuǎn)移至5 mL的離心管。然后,加入4倍體積的組織裂解液(含50 mmol/L煙酰胺,3 μmol/L去乙酰化酶抑制劑,1%蛋白酶抑制劑及8 mol尿素)超聲下裂解。在4 ℃下,12 000×g離心10 min,去除剩余碎片,收集上清液,采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)水平。在胰蛋白酶消化過(guò)程中,首先向離心管中加入適量標(biāo)準(zhǔn)蛋白,再加入裂解液以調(diào)整體積至一致,緩慢向其中加入20%的三氯乙酸,利用渦旋混勻儀振蕩、混勻,4 ℃靜置2 h以充分沉淀。4 500×g離心5 min后,用預(yù)冷的丙酮3次洗滌所得蛋白沉淀,晾干后加入200 mmol/L的四乙基溴化銨并于超聲儀中充分打散,經(jīng)酶底比1∶50(m/m)的胰酶消化過(guò)夜。先后加入5 mmol/L二硫蘇糖醇56 ℃還原30 min、11 mmol/L碘乙酰胺室溫暗孵育15 min。

1.2.2.3液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

用NanoElute超高效液相系統(tǒng)分離溶解于液相色譜流動(dòng)相A相(含2%乙腈和0.1%甲酸)中的樣品蛋白肽段。配制含0.1%甲酸和100%乙腈溶液的流動(dòng)相B,以0～1 min,2%～5% B;>1～76 min,>5%～27% B;>76～82 min,>27%～35% B;>82～86 min,>35%～85% B梯度,300 nL/min流速洗脫多肽。分離后的多肽被注入Capillary離子源(電壓1.75 kV)中進(jìn)行電離和隨后的飛行時(shí)間(time-of-flight,TOF)質(zhì)譜timsTOF Pro分析。采用高分辨的TOF質(zhì)譜檢測(cè)和分析肽段母離子及其二級(jí)碎片。參考文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描和數(shù)據(jù)收集。

1.2.2.4定量分析

根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的搜庫(kù)分析結(jié)果給出的每個(gè)肽段在不同樣品中的信號(hào)強(qiáng)度信息計(jì)算蛋白的相對(duì)定量。即首先將信號(hào)強(qiáng)度值(I)通過(guò)中心化變化后,按公式R_{ij}=I_{ij}/Mean(I_j)得到肽段在不同樣品中的相對(duì)定量值(R),i表示樣品,j表示肽段;然后采用中位數(shù)歸一化方法對(duì)得到的肽段相對(duì)定量值進(jìn)行校正(NR)以消除不同樣品在質(zhì)譜檢測(cè)中上樣量的系統(tǒng)誤差,計(jì)算公式:NR_{ij}=R_{ij}/Median(R_i);最后采用蛋白對(duì)應(yīng)特異性肽段相對(duì)定量值的中值表示蛋白的相對(duì)定量值。計(jì)算公式:R_{ik}=Median(NR_{ij},j/in k),k表示蛋白,j表示蛋白所屬的特異性肽段。分別采用Person相關(guān)性、主成分分析和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差3種統(tǒng)計(jì)分析方法評(píng)估蛋白定量重復(fù)性。

1.2.2.5SerpinB1a蛋白基因本體論(GO)功能富集分析

采用UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫(kù)的GO分類分析方法,從分子功能、細(xì)胞組成和生物進(jìn)程等角度對(duì)SerpinB1a蛋白的生物學(xué)作用進(jìn)行注釋,并結(jié)合當(dāng)前AFLD發(fā)生機(jī)制相關(guān)國(guó)內(nèi)外研究文獻(xiàn)推測(cè)涉及AFLD發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)容。

1.2.3SerpinB1a蛋白表達(dá)的驗(yàn)證

1.2.3.1總體思路

采用基于質(zhì)譜技術(shù)的靶向蛋白質(zhì)組定量分析方法。將上述蛋白組學(xué)獲得的含SerpinB1a蛋白的肽段分別進(jìn)行EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)分離和電離后的Q-ExactiveTMPlus質(zhì)譜分析,經(jīng)Max-Quant軟件(v1.6.15.0)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.3.2液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

SerpinB1a蛋白肽段來(lái)自上述蛋白組學(xué)剩余肽段,經(jīng)液相色譜流動(dòng)相A相(含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液)溶解后,使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動(dòng)相B為含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。液相梯度設(shè)置:0～16 min,7%～25% B;>16～22 min,>25%～35% B;>22～26 min,>35%～80% B;>26～30 min,>80% B,流速維持在500 nL/min。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入納米噴霧電離(NSI)離子源中進(jìn)行電離,然后用Q ExactiveTMPlus質(zhì)譜進(jìn)行分析。離子源電壓設(shè)置為2.1 kV,肽段母離子及其二級(jí)碎片都使用高分辨的Orbitrap進(jìn)行檢測(cè)和分析。一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為360～1 020 m/z,掃描分辨率設(shè)置為70 000;二級(jí)質(zhì)譜Orbitrap掃描分辨率設(shè)置為17 500。數(shù)據(jù)采集模式使用數(shù)據(jù)非依賴型掃描(DIA)程序,高能碰撞離解(HCD)碰撞池的碎裂能量設(shè)置為27。一級(jí)質(zhì)譜自動(dòng)增益控制(AGC)設(shè)置為3E6,最大離子注入時(shí)間(maximum IT)設(shè)置為50 ms;二級(jí)質(zhì)譜AGC設(shè)置為1E5,maximum IT設(shè)置為250 ms,隔離窗口設(shè)置為1.6 m/z。

1.2.3.3數(shù)據(jù)處理

肽段參數(shù)設(shè)置:蛋白酶為胰蛋白酶[KR/P],K、R、P分別代表賴氨酸、精氨酸、脯氨酸,最大漏切位點(diǎn)數(shù)為0,肽段長(zhǎng)度為7～25個(gè)氨基酸殘基,設(shè)置半胱氨酸烷基化為固定修飾。Transition參數(shù)設(shè)置:母離子電荷為2,3;子離子電荷為1;離子類型為b,y。碎片離子選擇從第3個(gè)開(kāi)始至最后1個(gè),并設(shè)置離子匹配的質(zhì)量誤差容忍度為0.02 Da。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 SerpinB1a蛋白的4D非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定與定量結(jié)果

經(jīng)課題組前期造模成功后,在蛋白組學(xué)中各實(shí)驗(yàn)組肝組織中均鑒定到SerpinB1a蛋白,蛋白質(zhì)登記號(hào):Q9D154,肽段:FQSLNAEVSK。以3組中SerpinB1a蛋白質(zhì)重復(fù)測(cè)量平均值比值作為差異倍數(shù),當(dāng)P≤0.05且差異倍數(shù)≥2或≤0.5時(shí)被認(rèn)為具有明顯差異。與C組(2.18±0.51)比較,M組SerpinB1a蛋白相對(duì)表達(dá)水平(0.18±0.09)明顯下降(P=0.002),下調(diào)表達(dá)0.08倍;與M組比較,R組SerpinB1a蛋白相對(duì)表達(dá)水平(1.08±0.07)明顯升高(P=0.004),上調(diào)表達(dá)6.00倍。

2.2 SerpinB1a蛋白的GO富集分析結(jié)果

經(jīng)GO富集分析,顯示SerpinB1a蛋白共涉及8個(gè)分子功能、20個(gè)細(xì)胞組成和59個(gè)生物進(jìn)程,進(jìn)一步推測(cè)其中的2個(gè)分子功能、3個(gè)細(xì)胞組成和12個(gè)生物進(jìn)程涉及AFLD的發(fā)生、發(fā)展,見(jiàn)表1。

表1 SerpinB1a蛋白的GO富集分析

2.3 SerpinB1a蛋白表達(dá)的驗(yàn)證

利用以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的靶向蛋白質(zhì)組定量技術(shù)對(duì)SerpinB1a蛋白表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。采用峰面積進(jìn)行定量,呈現(xiàn)的7種顏色條帶分別對(duì)應(yīng)肽段在質(zhì)譜儀中裂解后的7種特異性氨基酸序列,見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示:與C組比較,M組SerpinB1a蛋白表達(dá)水平下調(diào)0.21倍,與上述4D非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的定量結(jié)果一致。

C1～C3:C組;M1～M3:M組。

3 討 論

近年來(lái),日益發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在基因組學(xué)等其他“組學(xué)”技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步表明了生物個(gè)體蛋白的身份、識(shí)別蛋白質(zhì)的分子構(gòu)成,為探究疾病的發(fā)病機(jī)制、尋找分子標(biāo)志物和了解藥物作用靶點(diǎn)等提供了重要線索[17-18]。運(yùn)用蛋白組學(xué)方法在非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠模型和相應(yīng)的臨床患者肝臟中均發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因3(ATG3)是與脂肪變性發(fā)生有關(guān)的新分子,其表達(dá)與NAFLD脂肪變性分級(jí)和活動(dòng)評(píng)分呈正相關(guān)[19]。CARLSSON等[20]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn),生長(zhǎng)分化因子15是糖尿病腎病和心血管事件發(fā)生的潛在生物標(biāo)志物,為糖尿病腎病和心血管疾病的機(jī)制研究提供了新的見(jiàn)解。DING等[21]運(yùn)用等壓標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶2(SOD2)在唾液中可能作為肝細(xì)胞癌的潛在生物標(biāo)記物,提供了一種無(wú)創(chuàng)、廉價(jià)的唾液檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)肝細(xì)胞癌。本研究借助蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢(shì),采用4D非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)和分析了乙醇喂養(yǎng)AFLD小鼠和經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后的小鼠肝組織SerpinB1a蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示,M組小鼠肝組織SerpinB1a蛋白表達(dá)水平較C組下調(diào)0.08倍,經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后上調(diào)6.00倍。表明慢性酒精攝入可以引起肝組織SerpinB1a蛋白表達(dá)水平下降,提示該蛋白可能同時(shí)參與了AFLD的發(fā)生和白藜蘆醇的AFLD保護(hù)作用。目前,尚未發(fā)現(xiàn)SerpinB1a蛋白與酒精性肝損傷及白藜蘆醇保護(hù)作用相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,值得進(jìn)一步關(guān)注和探討。

白藜蘆醇是一種存在于多種植物中的天然多酚,作為沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)激動(dòng)劑[22],具有抗炎、抗缺血、抗氧化、抗癌、心臟保護(hù)等調(diào)節(jié)作用[23]。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可通過(guò)促進(jìn)自噬以減少酒精誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性[6],下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子和細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)表達(dá),減少活性氧(ROS)等有害物質(zhì)產(chǎn)生[24],加速巨噬細(xì)胞極化以抗凋亡[25],發(fā)揮酒精性肝損傷保護(hù)作用。但截至目前,其具體的分子干預(yù)機(jī)制尚不清楚。人類SerpinB1(小鼠SerpinB1a的功能同源物)與多種疾病有關(guān),如2型糖尿病患者血清SerpinB1水平明顯升高與胰島B細(xì)胞功能障礙、血糖控制和血脂異常有關(guān)[26],SerpinB1通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)因子信號(hào)通路促進(jìn)胰島B細(xì)胞增殖以應(yīng)對(duì)胰島素抵抗[27]。MOURAD等[28]檢測(cè)了葡聚糖硫酸酯鈉誘導(dǎo)的炎癥性結(jié)腸炎模型小鼠的結(jié)腸蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)SerpinBla表達(dá)上調(diào)并參與先天免疫反應(yīng)。運(yùn)用蛋白組學(xué)串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)和生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)早期大鼠急性胰腺炎中SerpinB1a低表達(dá),并通過(guò)減弱對(duì)彈性蛋白酶的抑制發(fā)揮抗炎作用[29]。在癌癥領(lǐng)域也顯示,過(guò)表達(dá)SerpinB1會(huì)促進(jìn)口腔癌細(xì)胞在侵襲性口腔鱗狀細(xì)胞癌中的轉(zhuǎn)移[30],相反地,在乳腺癌、肺癌與肝細(xì)胞癌等癌組織中SerpinB1表達(dá)增強(qiáng)并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2活性,從而發(fā)揮抑癌作用[31-32]。由此可見(jiàn),SerpinB1a與多種疾病發(fā)生或保護(hù)作用有關(guān),涉及免疫防御、蛋白水解、抑癌或促進(jìn)癌細(xì)胞擴(kuò)散等多種反應(yīng),在不同疾病中存在正性或負(fù)性表達(dá)的差異性。本研究發(fā)現(xiàn)在慢性酒精攝入后,肝臟SerpinB1a表達(dá)水平明顯下調(diào)和經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后SerpinB1a表達(dá)水平明顯上調(diào),這提示有必要進(jìn)一步證實(shí)其是否真的參與了AFLD發(fā)生的保護(hù)作用及其機(jī)制。

與4D非標(biāo)定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)結(jié)果模式一致,靶向蛋白質(zhì)組定量技術(shù)驗(yàn)證了SerpinB1a蛋白表達(dá)在AFLD小鼠肝組織明顯下調(diào),提示該蛋白在AFLD發(fā)生中的保護(hù)作用,白藜蘆醇干預(yù)后SerpinB1a蛋白表達(dá)明顯上調(diào)可初步證明這一點(diǎn)。根據(jù)前言所述,在研究基于AFLD疾病階段的肝臟自噬抑制作用,以及經(jīng)FOXO1和pSTAT3介導(dǎo)的酒精攝入引起的肝損傷與SerpinB1a的調(diào)控關(guān)系基礎(chǔ)上,作者提出了SerpinB1a在酒精誘導(dǎo)的肝損傷保護(hù)中可能通過(guò)FOXO1-STAT3介導(dǎo)的自噬信號(hào)通路發(fā)揮作用。已知FOXO1通過(guò)正向調(diào)控應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白3以抑制mTORc1、增強(qiáng)自噬相關(guān)基因(ATGs)的表達(dá),實(shí)現(xiàn)自噬誘導(dǎo)的調(diào)控[11]。SINGH等[33]在肝細(xì)胞中對(duì)ATG7基因進(jìn)行特異性敲除,并檢測(cè)了肝組織中甘油三酯水平,以研究自噬是否參與了脂質(zhì)分解代謝,結(jié)果顯示:在抑制自噬后肝臟中甘油三酯積累明顯增多。相反,激活自噬有助于肝細(xì)胞中脂質(zhì)的分解,通過(guò)脂吞噬或微脂噬兩種自噬形式,從而減少肝細(xì)胞中脂肪變性[34]。除了參與調(diào)控自噬和脂質(zhì)分解代謝的調(diào)節(jié),FOXO1還能降低過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的轉(zhuǎn)錄活性,減少游離脂肪酸的攝取,并抑制脂肪酸合成酶和乙酰輔酶a羧化酶1的表達(dá),從而抑制脂肪的合成并減少肝臟中甘油三酯的積累[35-36]。此外,FOXO1的表達(dá)下調(diào)會(huì)降低超氧化物歧化酶(SOD)生成,加重氧化應(yīng)激發(fā)生[37]?；赟erpinB1a與FOXO1、PPARγ的關(guān)系[10-11,35-36],以及抗氧化應(yīng)激、自噬誘導(dǎo)在白藜蘆醇抗酒精性肝損傷的研究發(fā)現(xiàn)[6,24],作者認(rèn)為上調(diào)SerpinB1a的表達(dá)、經(jīng)FOXO1介導(dǎo)的PPARγ拮抗作用及自噬誘導(dǎo)可能是白藜蘆醇發(fā)揮AFLD保護(hù)作用的重要機(jī)制。此外,作為肝保護(hù)信號(hào)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3),既可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2互作蛋白3的表達(dá)誘導(dǎo)自噬[11],進(jìn)而促進(jìn)脂肪分解,減少脂肪變性,還可以通過(guò)抑制SREBP-1c的表達(dá)來(lái)抑制脂肪合成[38]。因此,SerpinB1a的肝臟保護(hù)作用也可能是通過(guò)激活肝細(xì)胞中的STAT3,進(jìn)一步激活自噬以加快脂肪分解,并抑制SREBP-1c表達(dá)以減少脂肪生成來(lái)發(fā)揮的。

綜上所述,本文探討了SerpinB1a表達(dá)水平與AFLD發(fā)生的關(guān)系,提出了SerpinB1a可能作為FOXO1、STAT3介導(dǎo)的自噬誘導(dǎo)上游調(diào)控因子,其表達(dá)水平的變化參與了AFLD的形成及白藜蘆醇的抗AFLD作用,但還需要進(jìn)一步驗(yàn)證?？傊?本文為完善AFLD發(fā)生的分子機(jī)制及探討白藜蘆醇的AFLD保護(hù)機(jī)制提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。