共同性外斜視貓的眼內(nèi)直肌組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子蛋白及mRNA表達(dá)觀察

孫一帆，李曉彤，張偉，郝瑞

1 天津醫(yī)科大學(xué)眼科臨床學(xué)院，天津 300020；2 天津市眼科醫(yī)院斜視與小兒眼科；3 天津市眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4 南開大學(xué)附屬眼科醫(yī)院眼科

共同性斜視（concomitant strabismus）是指眼球運(yùn)動(dòng)無障礙，斜視角度不隨注視眼別和注視方向而改變的斜視。按偏斜的方向可將共同性斜視分為共同性內(nèi)斜視和共同性外斜視［1］。共同性外斜視是臨床常見的斜視類型，發(fā)病率1%～3%，可影響患者的雙眼視功能發(fā)育，甚至破壞雙眼視功能［2］。目前共同性斜視的治療仍以手術(shù)為主，通過直肌手術(shù)來矯正患者眼位，但臨床治療效果不一［3］。共同性外斜視的確切病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，可能與眼眶解剖結(jié)構(gòu)、眼外肌的解剖異常、筋膜結(jié)構(gòu)的異常、異常神經(jīng)支配的集合和分開功能失衡等有關(guān)［4］。因此，了解眼外肌的病理變化，對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)共同性外斜視的發(fā)病機(jī)制以及指導(dǎo)臨床治療具有一定的意義。眼外肌是一種特殊類型的骨骼肌，具有組織重塑和持續(xù)自我更新的特點(diǎn)，能夠持續(xù)表達(dá)肌球蛋白重鏈的未成熟亞型、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）等。研究［5］發(fā)現(xiàn)，兔、猴等成熟哺乳動(dòng)物未受損的眼外肌組織中肌衛(wèi)星細(xì)胞含量較高。肌肉損傷時(shí)肌衛(wèi)星細(xì)胞可被激活，增殖、分化后形成成熟的肌肉纖維。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是體內(nèi)含量最多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，通過與酪氨酸激酶B結(jié)合，維持和促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育分化與生長(zhǎng)再生［6］。BDNF 是視神經(jīng)損傷后哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中一種有效的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)劑［7］。CLOW 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，BDNF 參與調(diào)節(jié)衛(wèi)星細(xì)胞功能和肌肉損傷后的肌纖維再生。目前，關(guān)于BDNF 在共同性外斜視中作用機(jī)制相關(guān)研究較少。2022年6—8月，我們觀察了共同性外斜視貓內(nèi)直肌組織中BNDF 蛋白及mRNA 的表達(dá)變化，探討B(tài)DNF 在共同性外斜視發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物培養(yǎng)、分組及共同性外斜視模型構(gòu)建方法 3～4 周齡雌性貓28 只，體質(zhì)量280～325 g。貓?jiān)?2 h 光/暗周期、相對(duì)濕度（40%～70%）、溫度（18～22℃）和噪音（＜50 分貝）的條件下自由獲取食物和水。28只貓隨機(jī)分為A、B、C 組及對(duì)照組，每組各7只。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)專業(yè)委員會(huì)批準(zhǔn)，符合相關(guān)動(dòng)物指南。A、B、C 組貓均佩戴雙眼各15△底向外、尖向內(nèi)三棱鏡2、4、6 個(gè)月，構(gòu)建共同性外斜視模型。對(duì)照組貓全天配戴平光鏡片6個(gè)月。佩戴6 個(gè)月時(shí)，采用角膜映光法聯(lián)合三棱鏡檢查，三組貓眼睛棱鏡度＞10△，說明共同性外斜視模型造模成功，最終A 組6 只貓、B 組5 只貓、C 組5只貓?jiān)炷３晒?。造模成功后取四組貓，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（35 mg/kg，Sigma， CA， USA）麻醉后，用生理鹽水沖洗雙眼結(jié)膜囊，切開鼻側(cè)結(jié)膜囊，鉤取分離眼內(nèi)直肌，留取眼內(nèi)直肌組織。

1.2 各組貓眼內(nèi)直肌纖維橫截面積及肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)測(cè)算 采用Masson 染色法。 取各組貓眼內(nèi)直肌組織，4%多聚甲醛溶液中固定48 h，脫水包埋，3～5 μm 的厚度連續(xù)切片，75%乙醇固定30 min，80%乙醇Ⅰ固定 30 min，80%乙醇Ⅱ固定 30 min，95%乙醇Ⅰ 固定150 min，95%乙醇Ⅱ固定 50 min，100%乙醇Ⅰ固定 60 min，100%乙醇Ⅱ固定 60 min，松節(jié)油Ⅰ固定 30 min，松節(jié)油Ⅱ固定 30 min，石蠟Ⅰ處理30 min，石蠟Ⅱ處理 30 min，石蠟Ⅲ處理30 min，組織切片用二甲苯15 min，無水乙醇處理5 min（2次），蒸餾水沖洗5 min（共2 次）。細(xì)胞核蘇木精染色5 min，蒸餾水洗滌5 min（2 次），5 g/L 鹽酸酒精誘導(dǎo)分化15 min。切片用麗春紅品紅溶液染色10 min，蒸餾水清洗5min（2 次），10 g/L 磷酸鋁染色2 min。苯胺藍(lán)或亮綠液處理5 min，再用0.2%冰醋酸水溶液浸泡。切片經(jīng)95%酒精、無水酒精和二甲苯處理后用中性樹膠封住，在BX51 光學(xué)顯微鏡（Olympus，Japan）下觀察各組貓內(nèi)直肌組織病理變化，測(cè)算內(nèi)直肌纖維橫截面積及肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)。重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.3 各組貓眼內(nèi)直肌肌肉組織BDNF mRNA 檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）法。取四組貓眼內(nèi)直肌組織，收集內(nèi)直肌總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系為：熒光定量PCR 預(yù)混液10 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL，擴(kuò)增條件為：98 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，變性-退火-延伸共循環(huán)40 次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，Ct=實(shí)驗(yàn)組（Ct 靶基因-Ct GAPDH）-對(duì)照組（Ct 靶基因-Ct GAPDH），以2-ΔΔCt代表BDNF mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.4 各組貓眼內(nèi)直肌肌肉組織BDNF 蛋白檢測(cè)采用WESTERN Blotting 法。取四組貓眼內(nèi)直肌組織，采集內(nèi)直肌總蛋白。用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Beyotime Biotech）定量總蛋白，在上樣緩沖液中煮沸5～10 min。蛋白樣品用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離2 h，轉(zhuǎn)膜90 min。用5%脫脂牛奶與TBST溶液在室溫下封閉1h 后，與1：1 000 稀釋的一抗在4 ℃孵育過夜，然后在室溫下加入含有1：2 000 稀釋的辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase， HRP）標(biāo)記的二抗孵育1 h，最后曝光X 光片，并使用Scion NIH 圖像軟件（Scion Corporation， MD， USA）進(jìn)行條帶分析。以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值代表BDNF 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)測(cè)算3 次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS Inc.，IL，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以-x ± s表示，組間兩兩比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組貓眼內(nèi)直肌纖維橫截面積及肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)比較 對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組貓的眼內(nèi)直肌肌纖維形態(tài)正常，排列整齊，無細(xì)胞腫脹和變性，各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的內(nèi)直肌肌纖維走向無明顯差異（見圖1）。A、B、C 組及對(duì)照組貓的眼內(nèi)直肌肌纖維橫截面積分別為904.33 ± 40.08、797.33 ± 33.13、702.33 ±46.65、1 005.33 ± 40.81，肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)分別為34.00 ± 3.46、20.00 ± 4，7.67 ± 2.08、3.33 ± 4.16，與對(duì)照組比較，A、B、C 組貓的眼內(nèi)直肌肌纖維橫截面積小、肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)少（P均＜0.05）。

圖1 各組貓的眼內(nèi)直肌肌纖維形態(tài)

2.2 各組貓的眼內(nèi)直肌BDNF mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 A、B、C 組及對(duì)照組貓的眼內(nèi)直肌BDNF mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.51 ± 0.05、0.41 ± 0.04、0.10 ± 0.04、1.00 ± 0.10，與對(duì)照組比較，A、B、C 組貓的眼內(nèi)直肌BDNF mRNA 相對(duì)表達(dá)量低（P均＜0.05）。

2.3 各組貓的眼內(nèi)直肌BDNF 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 A、B、C組及對(duì)照組貓的眼內(nèi)直肌BDNF 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.85 ± 0.11、0.66 ± 0.05、0.14 ±0.05、0.97 ± 0.09，與對(duì)照組比較，A、B、C 組貓的眼內(nèi)直肌BDNF 蛋白相對(duì)表達(dá)量低（P均＜0.05）。

3 討論

目前，關(guān)于共同性外斜視的發(fā)病機(jī)制有解剖學(xué)、調(diào)節(jié)學(xué)、神經(jīng)學(xué)和遺傳學(xué)等幾種理論，但仍未闡明［7］。近年來，一些研究［9］發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子與骨骼肌的損傷和修復(fù)有關(guān)，且在眼外肌中進(jìn)行了研究，證實(shí)了細(xì)胞因子在眼外肌中的高表達(dá)；然而，目前仍不確定這些細(xì)胞因子是否參與了斜視的發(fā)生和發(fā)展，以及如何調(diào)節(jié)眼外肌的損傷和修復(fù)。因此，建立穩(wěn)定、重復(fù)性好的共同性外斜視動(dòng)物模型，研究相關(guān)細(xì)胞因子與斜視發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，不僅有助于深入了解共同性外斜視的發(fā)病機(jī)制，而且為探索斜視的非手術(shù)治療方法提供了新的思路。

骨骼肌不僅是負(fù)責(zé)機(jī)體運(yùn)動(dòng)功能的主要器官之一，同時(shí)也是人體最大的代謝和內(nèi)分泌器官，能合成、分泌、表達(dá)多種細(xì)胞因子和多肽，這些活性物質(zhì)被稱為肌源性因子（myokines），調(diào)節(jié)肌源性分化和肌肉再生，在骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝以及一些疾病的病理過程中扮演了重要角色［10］。細(xì)胞因子屬于不同的細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白家族，在眼外肌細(xì)胞的增殖、分化和代謝過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械損傷、缺血和缺氧等病理刺激可以影響和改變細(xì)胞因子的活性［11］。胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）和心肌營(yíng)養(yǎng)素1（cardiotrophin 1，CT-1）可以增加幼雞成長(zhǎng)期間眼外肌的力量和質(zhì)量［12］。ANDERSON 等［13］表明，肌源性生長(zhǎng)因子可以減少眼外肌的力量，這揭示了一種治療斜視的潛在生物學(xué)方法。LI 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，外源性IGF-1 治療可促進(jìn)貓斜視模型內(nèi)直肌肌分化因子5（myocyte differentiation factor 5 ，Myf5）的表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）的表達(dá)。BDNF 是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌蛋白家族中的一員，主要在大腦中產(chǎn)生，骨骼肌中也有合成，在神經(jīng)肌肉功能中起重要作用。是視神經(jīng)損傷后哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中一種有效的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)劑［7］。

肌衛(wèi)星細(xì)胞能夠在肌肉損傷時(shí)被激活，分裂并修復(fù)受損的纖維或形成新的肌纖維［9］。許多成熟哺乳動(dòng)物未受損的眼外肌含有活躍的肌衛(wèi)星細(xì)胞［8，11］，這表明眼外肌具有自我更新能力。研究［8］發(fā)現(xiàn)，肌肉來源的BDNF 在調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化以及肌肉損傷后的再生方面具有重要作用。WILLOUGHBY 等［15］對(duì)猴應(yīng)用外源性BDNF 后發(fā)現(xiàn)慢肌纖維先受影響，與對(duì)照組外直肌神經(jīng)肌肉接頭相比，慢肌纖維上的神經(jīng)肌肉接頭更大，對(duì)于快肌纖維的神經(jīng)肌肉接頭的大小或形態(tài)沒有影響。而慢肌纖維能夠維持眼外肌的張力，促進(jìn)緩慢，持續(xù)的眼球運(yùn)動(dòng)。我們前期研究中將擬行外直肌后徙聯(lián)合內(nèi)直肌縮短術(shù)共同性外斜視患者分為術(shù)前斜視度數(shù)40△～60△、60△～80△、80△～100△組，采用RT-qPCR 法檢測(cè)內(nèi)直肌組織BDNF mRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共同性外斜視患者內(nèi)直肌BDNF mRNA 相對(duì)表達(dá)量隨斜視度數(shù)增加而減少。本研究結(jié)果中，共同性外斜視的貓模型發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的肌纖維橫截面積和肌衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。肌肉的橫截面積是決定肌肉力量大小的重要指標(biāo)，橫截面積越大，肌肉收縮時(shí)產(chǎn)生的力量也就越大。實(shí)驗(yàn)組貓內(nèi)直肌形態(tài)發(fā)生明顯變化，力量減弱，引起斜視。這些數(shù)據(jù)不僅證明了貓的眼外肌與其他哺乳動(dòng)物相似，具有活躍的肌衛(wèi)星細(xì)胞，能夠自我更新和重塑，還證實(shí)了共同性外斜視所導(dǎo)致的一系列病理變化如肌纖維橫截面積減小、衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量減少等與肌源性因子有關(guān)。此外，通過在動(dòng)物模型中進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組BDNF的mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯降低，并呈下降趨勢(shì)。明確了共同性外斜視中內(nèi)直肌BDNF 的表達(dá)與斜視度數(shù)、病程具有一定的相關(guān)性，推測(cè)其可能通過調(diào)節(jié)肌肉力量參與調(diào)控共同性外斜視的發(fā)生發(fā)展。有研究［8］表明，BDNF能夠調(diào)節(jié)肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化，以應(yīng)對(duì)肌肉損傷后的修復(fù)。因此我們推測(cè)，在共同性外斜視發(fā)生時(shí)，內(nèi)直肌的增殖、分化和代謝減少。BDNF 分泌減少，導(dǎo)致肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化能力也降低，阻礙了內(nèi)直肌的生長(zhǎng)、發(fā)育、修復(fù)和再生，最終使內(nèi)直肌結(jié)構(gòu)改變，力量減弱，眼位發(fā)生偏斜。此外，隨著共同性外斜視病程的延長(zhǎng)，BDNF的表達(dá)呈明顯下降趨勢(shì)，推測(cè)BDNF 的表達(dá)下降可能促進(jìn)了斜視病情的進(jìn)一步加重，提示BDNF 可能與斜視的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性。

綜上所述，共同性外斜視貓內(nèi)直肌BDNF mRNA和蛋白表達(dá)降低，且隨病程延長(zhǎng)降低更明顯。BDNF mRNA 和蛋白可能通過抑制貓內(nèi)直肌肌肉衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)，參與共同性外斜視的發(fā)生發(fā)展。由于本研究只對(duì)截取的貓內(nèi)直肌進(jìn)行研究，共同性外斜視貓的外直肌及其他眼外肌組織中病理性改變及是其他調(diào)控因子尚需后續(xù)進(jìn)一步研究。