孤獨癥譜系障礙患兒血清S100 鈣結(jié)合蛋白B水平變化及其基因多態(tài)性觀察

陳穎，閆淑媛，張梅，潘琳玲，匡曉妮

湖南師范大學附屬長沙市婦幼保健院兒童保健中心，長沙 410007

孤獨癥譜系障礙（Autism spectrum disorder，ASD）是一組以認知功能受損為主要特點的神經(jīng)行為障礙疾病，患病率1%～2%。最新調(diào)查發(fā)現(xiàn)，ASD的發(fā)病率逐年升高，并且男性發(fā)病率（3：1～5：1）顯著高于女性［1］。ASD 的主要臨床表現(xiàn)為社交缺陷、刻板行為和狹隘興趣［2］。ASD 的發(fā)病機制錯綜復雜，可能與遺傳、環(huán)境等諸多因素有關，早期診斷、早期進行康復訓練是目前公認最有效的治療方法［3］。ASD 的診斷主要依賴于醫(yī)療專業(yè)人員的行為觀察，但ASD 的異常行為在出生12～18 個月時才逐漸表現(xiàn)出來，且因為評判人員水平差異等主觀因素，容易出現(xiàn)誤診、漏診現(xiàn)象。因此，尋找一個能夠輔助診斷ASD 的生物標志物是目前的研究熱點。S100 鈣結(jié)合蛋白B（S100B）是一種主要由星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的鈣結(jié)合蛋白，通過旁分泌和自分泌的方式，參與細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、控制神經(jīng)生成、支持突觸發(fā)生、調(diào)控細胞周期和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導等［4］。既往研究［4］顯示，S100B 是中樞神經(jīng)損傷的生物標志物，S100B 基因rs1051169 位點多態(tài)性與多種神經(jīng)發(fā)育障礙疾病有關。S100B 是否可作為ASD 的診斷標志物，目前相關研究較少。2021 年1 月—2023 年2 月，我們觀察了ASD 患兒血清S100B 水平變化，分析血清S100B 水平對ASD 的診斷效能，觀察S100B 基因rs1051169 位點的多態(tài)性，探討S100B 基因rs1051169位點的多態(tài)性與發(fā)病有關。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機選取2021 年1 月—2022 年8月在長沙市婦幼保健院確診為ASD 的患兒78 例（ASD 組）。納入標準：①嚴格按照美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第五版（DSM-5）標準［5］，并通過詳細的病史詢問和查體以及現(xiàn)場兩位經(jīng)驗豐富的醫(yī)生使用兒童孤獨癥評定量表（CARS）確診為ASD；②年齡2～6 歲；排除標準：①近半年內(nèi)有神經(jīng)相關藥物的使用；②排除患有重大疾病者，如自身免疫性疾病、糖尿病、肝腎功能不全、白血病、惡性腫瘤等；③有神經(jīng)發(fā)育障礙或腦損傷、家族遺傳精神病史。同期隨機選取健康體檢的兒童80 例為對照組。ASD 組中男60 例、女18 例，年齡（40.64 ± 7.37）月；對照組中男53 例，女27 例，年齡（38.91 ± 6.67）月。兩組年齡、性別具有可比性。兩組監(jiān)護人均已簽署知情同意書，本項目在長沙市婦幼保健院倫理委員會已經(jīng)獲得批準。

1.2 兩組血清S100B 檢測 使用一次性采血管抽取兩組靜脈血2～3 mL，離心5 min（4 ℃，4 500 r/min），吸取上層血清，將上層血清分裝保存于-80 ℃冰箱。采用ELISA 法檢測血清S100B，所有操作均嚴格依據(jù)說明書上要求進行。重復檢測3 次，取平均值。

1.3 兩組患兒S100B 基因rs1051169 位點基因檢測分析 采用聚合酶鏈反應聯(lián)合DNA 直接測序法檢測兩組S100B 基因rs1051169 位點基因型。DNA 提取步驟嚴格依據(jù)說明書上要求進行。S100B 基因片段按PCR 條件及反應體系擴增，擴增后以Marker Ⅰ為核酸分子質(zhì)量參照標準，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳于紫外燈下照相，擴增產(chǎn)物為目標片段。PCR反應體系：T3 Super PCR Mix 21 μL，上游引物1 μL，DNA 2 μL，下游引物1 μL。PCR 反應條件已通過預實驗：98 ℃預變性2 min，（98 ℃ 10 s→61 ℃ 10 s→72 ℃ 5 s）×循環(huán)35 次，72 ℃終末延伸2 min，4 ℃保存。S100B 的基因片段擴增產(chǎn)物送鉑尚生物技術有限公司進行基因測序，結(jié)果使用Chromas軟件統(tǒng)計。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，性別及基因分型等計數(shù)資料以直接計數(shù)法及百分比表示，組間比較采用χ2檢驗，Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢驗是否具有群體代表性。繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析血清S100B 水平對ASD 的診斷效能。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒血清S100B 水平比較 ASD 組、對照組患兒血清S100B 水平分別為（0.356 ± 0.057）、（0.284 ± 0.058）ng/mL，二者比較，t=7.847，P＜0.001。

2. 2 血清S100B 水平對ASD 的診斷效能 血清S100B 水平診斷ASD 的ROC 曲線下面積（AUC）為0.808（95%CI為0.741～0.875），根據(jù)約登指數(shù)確定S100B 水平界值為0.351 ng/mL 時診斷ASD 的特異度為95%、靈敏度為58%。

2.3 兩組S100B 基因rs1051169 位點基因型及等位基因頻率比較 ASD 組和對照組S100B 基因rs1051169 位點基因型分布頻率經(jīng)檢驗符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡。S100B 基因rs1051169 位點多態(tài)性表現(xiàn)為C 突變?yōu)镚，基因型為有CC、CG、GG，見圖1。ASD 組S100B 基因rs1051169位點CC、CG、GG基因型分別為33、37、8 例，對照組S100B 基因rs1051169 位點CC、CG、GG 基因型分別為28、43、9例，二者比較，χ2=0.893，P＞0.05。ASD 組C、G 等位基因型頻率分別為66%、34%，對照組S100B 基因rs1051169位點C、G 等位基因型頻率分別為61.9%、38.1%，二者比較，χ2=0.590，P＞0.05。

圖1 S100B基因rs1051169位點基因序列圖

3 討論

ASD 發(fā)病機制尚不明確，其診斷主要基于行為學診斷，缺乏明確、可識別的ASD 標志物，因此人們迫切需要尋找早期診斷ASD 的輔助方法。在過去十幾年的研究使人們越來越了解到神經(jīng)膠質(zhì)細胞可能參與ASD 發(fā)病機制，其或與ASD 大腦特有的結(jié)構和異常的功能有關［6］。ZEIDAN 等［6］研究認為ASD可能是由于表觀遺傳基因調(diào)節(jié)和氧化應激的改變導致神經(jīng)膠質(zhì)相互作用失調(diào)的結(jié)果。S100B 主要集中在星形膠質(zhì)細胞中，是星形膠質(zhì)細胞活化的標志之一。目前，S100B 作為阿爾茨海默病、帕金森病、精神分裂癥或情緒障礙等疾病的可能生物標志物被積極研究［4］，但關于S100B 與ASD 的相關研究較少。本研究對78 例ASD 患兒和80 例健康兒童的S100B水平進行檢測，ASD 患兒中S100B 水平顯著高于健康兒童。進行ROC 曲線分析以評估S100B 在ASD早期診斷中的效用，AUC 為0.808（95%CI為0.741-0.875）。以不同S100B 水平作為界值點預測診斷ASD 的靈敏度和特異度，選擇約登指數(shù)最大處為最佳篩查陽性界值；當S100B 為0.351 ng/mL，診斷ASD 的特異度為95%，敏感度為58%，具有一定的診斷效能。

ASD 患兒中S100B 水平升高的機制尚不完全清楚，研究發(fā)現(xiàn)自身免疫可能參與其中的發(fā)展［7］，學者在ASD 患者中發(fā)現(xiàn)了大腦特異性自身抗體，自身抗體可以通過血腦屏障與腦組織抗原結(jié)合，形成免疫復合物并導致神經(jīng)元損傷，因此S100B 水平升高可能表明ASD 中的神經(jīng)元損傷［8］。其次，S100B 可調(diào)節(jié)促炎因子分泌［9］。S100B 可激活一系列細胞信號通路，觸發(fā)細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應，調(diào)節(jié)多種炎癥因子的釋放（如IL-1β、IL- 6、IFN-γ 和TNF-α），支持神經(jīng)炎癥在ASD 發(fā)展中的作用［4］。S100B 可能還通過細胞凋亡影響ASD 的發(fā)病，AYAYDIN 等［10］報道S100B在神經(jīng)細胞凋亡中起重要作用，S100B 對神經(jīng)元具有營養(yǎng)和毒性雙重作用，并且具有濃度差異性。在生理濃度下，S100B 可以起到保護神經(jīng)的作用。當S100B水平過度升高時，S100B具有神經(jīng)毒性并抑制神經(jīng)元的增殖和分化，并誘導神經(jīng)變性和細胞凋亡，這可能與ASD 的發(fā)病機制有關。但S100B 在ASD中的病理生理作用仍未研究清楚，期待未來能有進一步的研究。

遺傳因素是ASD 的核心致病因素之一。隨著研究的進展，已得知MTHFR、VDR、CNTNAP2 等基因多態(tài)性與ASD 的發(fā)病機制相關［11］，但是查閱文獻發(fā)現(xiàn)S100B 基因多態(tài)性與ASD 的相關研究極少。S100B 基因位于q22.3 染色體上，其mRNA 長度為1095 bp，編碼91 個氨基酸。S100B 基因多態(tài)性與多種神經(jīng)發(fā)育障礙疾病有關，例如雙相情感障礙、唐氏綜合征、阿爾茨海默氏病和誦讀困難等［12］。HOHOFF 等［13］發(fā)現(xiàn)S100B 基因多態(tài)性與S100B 的表達顯著相關。WU 等［14］發(fā)現(xiàn)S100B 基因rs1051169 位點多態(tài)性與中國人精神分裂癥的風險增加有關。本研究選取研究較多的S100B 基因rs1051169 位點，以78例ASD患兒及80例健康兒童為研究對象，探討其與ASD 易感性的關系。研究發(fā)現(xiàn)ASD 組與對照組比較，S100B 基因rs1051169 位點基因型分布和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義。但由于S100B基因有多個位點，本實驗僅研究了其中的一個位點，因此S100B 基因多態(tài)性與ASD 的相關性還需進一步研究。

綜上所述，ASD 患兒外周血S100B 水平升高，血清S100B水平診斷ASD有一定的靈敏度和較高的特異度，具有較大的臨床應用價值；但S100B 基因rs1051169 位點與ASD 的易感性無關。本研究結(jié)果尚存在種族類別影響及樣本量較小的問題，S100B水平及其基因多態(tài)性與ASD 的相關性，還有待進一步深入研究。