綠原酸灌胃對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的改善作用及其機(jī)制

王倩，劉宇，王榮麗

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川瀘州 646000

特發(fā)性肺纖維化（IPF）是一種病因不明、局限于肺部的慢性進(jìn)行性纖維化性的間質(zhì)性肺炎，其組織學(xué)和（或）胸部高分辨率CT（HRCT）常特征性表現(xiàn)為普通型間質(zhì)性肺炎（UIP）［1］。IPF 好發(fā)于老年人，確診后患者中位生存時(shí)間2～5 年，5 年生存率20%～25%［2］。目前IPF 的病因及發(fā)病機(jī)制仍不明確，目前FDA 僅批準(zhǔn)尼達(dá)尼布（nintedanib）和吡非尼酮（pirfenidone）可用于治療IPF，但治療效果較差［3］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）是最有效的促纖維化細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)肺纖維化中起關(guān)鍵作用，其中TGF-β1是其主要的形式。TGF-β 可促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖，促使肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（CollagenⅢ）等細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過(guò)度沉積，最終形成纖維化病灶［4］。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）發(fā)生過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去極性，E-鈣粘蛋白（E-Cadherin）、角蛋白等上皮細(xì)胞表型丟失或表達(dá)下調(diào)，波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)，其中TGF-β可通過(guò)調(diào)控Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)積聚［5］。綠原酸（CGA）也被稱為3-咖啡?？崴幔?-CQA）［6］，是一種具有多種生物活性的酚類化合物；廣泛分布在杜仲、金銀花、茵陳、枸杞、咖啡豆、獼猴桃等藥品及食品中；具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保肝及降糖等作用［7］。CGA可通過(guò)抑制NF-κB p65 的磷酸化、降低炎癥反應(yīng)程度，減輕補(bǔ)體旁路激活誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷［8］；體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)［9］發(fā)現(xiàn)，CGA可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)抑制肺纖維化。CGA 是否可通過(guò)抑制TGF-β1/Smads 信號(hào)通路，抑制肺組織EMT 過(guò)程，發(fā)揮抗肺纖維化的作用，目前尚無(wú)相關(guān)研究。為此，2022年3—6月，我們觀察了CGA 對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的改善作用，進(jìn)一步探討其可能作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑 清潔健康雄性C57BL/6 小鼠60只，6～8 周齡，體質(zhì)量（20 ± 2）g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010］。小鼠飼養(yǎng)于溫度 22～25 ℃、濕度50%～70%、12 h 晝夜循環(huán)的環(huán)境內(nèi)，自主攝入水和食物。實(shí)驗(yàn)所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理標(biāo)準(zhǔn)。鹽酸博萊霉素（純度≥98%，溶于生理鹽水）購(gòu)自北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司；CGA（純度≥98%，溶于超純水）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HE 染色試劑盒、Masson 三色染色液試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Collagen Ⅰ、Vimentin、α-SMA、TGF-β1抗體購(gòu)自北京邁瑞達(dá)科技有限公司；Smad2/3 抗體購(gòu)自成都杰德諾生物科技有限公司；免疫熒光染色試劑盒購(gòu)自海門碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組、博萊霉素（BLM）及CGA 給予方法 將60 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天后隨機(jī)分為6 組（對(duì)照組、模型組、CGA 低劑量組、CGA 中劑量組、CGA 高劑量一組、CGA 高劑量二組），每組各10 只。其中5 組小鼠用博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化［10］（誘導(dǎo)當(dāng)天記作第1 天）：腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉小鼠，固定四肢及頭部，75%酒精消毒頸部，手術(shù)剪行正中縱向切口，鈍性分離肌肉、組織直至暴露氣管，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙行氣管切開(kāi)，用微量移液器將2 mg/kg 博萊霉素溶液沿氣管切口朝向心端緩慢注入氣管內(nèi)；對(duì)照組小鼠相同操作后注入等體積生理鹽水。各組小鼠注入液體后立即將鼠板直立旋轉(zhuǎn)抖動(dòng)，使博萊霉素/生理鹽水在肺內(nèi)均勻分布，縫合肌肉、皮膚后將各組小鼠置于鼠籠中自然蘇醒。第1 天小鼠自然蘇醒后，CGA 高劑量二組小鼠予CGA80 mg/kg 灌胃，1 次/天，連續(xù)灌胃14 d。第8 天起，CGA 低劑量組、CGA 中劑量組、CGA 高劑量一組分別予CGA20、40、80 mg/kg 灌胃，1 次/天，連續(xù)灌胃14 d。第8 天起，對(duì)照組及模型組予等體積超純水連續(xù)灌胃，1次/天，連續(xù)灌胃14天。

1.3 各組小鼠左肺纖維化程度觀察 觀察并記錄各組小鼠存活數(shù)量。飼養(yǎng)第21 天后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠、頸椎脫臼法處死后稱重，開(kāi)胸分離雙肺，用濾紙吸干雙肺表面的液體后稱取濕重，按公式：肺系數(shù)（%）=肺濕重（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%計(jì)算肺系數(shù)。將各組小鼠左肺置于10%多聚甲醛中固定24 h。石蠟包埋后對(duì)左肺組織行5 μm連續(xù)切片。按照HE 染色試劑盒操作說(shuō)明書步驟進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄各組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變。取各組左肺組織切片，按照Masson 三色染色試劑盒操作說(shuō)明書步驟進(jìn)行Masson 染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄小鼠左肺組織中膠原纖維沉積情況。依照Ashcroft 評(píng)分［11］標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組小鼠左肺組織纖維化程度進(jìn)行定量分析：正常肺組織計(jì)0 分，肺泡或細(xì)支氣管壁纖維輕度增厚計(jì)1 分，肺泡壁中度增厚、肺組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯破壞計(jì)3分，肺組織改變介于1、3分之間計(jì)2分，肺纖維化進(jìn)一步加重、肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞、并且有纖維帶或小纖維團(tuán)塊形成計(jì)5 分，肺組織改變介于3、5 分之間計(jì)4 分，肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞、大面積纖維灶形成、可有“蜂窩肺”形成計(jì)7 分，肺組織改變介于5、7 分之間計(jì)6分，整個(gè)視野肺組織完全纖維化閉塞壞死計(jì)8分。

1.4 各組小鼠肺組織TGF-β1/Smads、EMT、脂質(zhì)過(guò)氧化相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 各組小鼠肺組織EMT 過(guò)程中間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA 蛋白檢測(cè) 采用免疫熒光法。按照免疫熒光染色試劑盒說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行，然后在熒光顯微鏡下觀察、拍照，肺組織中α-SMA 蛋白呈橙紅色熒光；每張切片隨機(jī)選擇3 個(gè)視野，用Fiji（Fiji is just ImageJ）軟件對(duì)蛋白陽(yáng)染面積的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，以蛋白陽(yáng)染面積熒光強(qiáng)度代表α-SMA 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.4.2 各組小鼠左肺組織細(xì)胞外基質(zhì)蛋白CollagenⅠ、EMT過(guò)程中間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin及TGF-β1/Smads 信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用免疫組化法。按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書操作步驟嚴(yán)格進(jìn)行。顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)視野，用Fiji（Fiji is just ImageJ）軟件測(cè)算蛋白陽(yáng)染面積的平均光密度值（MOD），肺組織中細(xì)胞核呈藍(lán)色，Collagen I、Vimentin、TGF-β1、Smad2/3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)為棕色或棕黃色顆粒。以MOD 值代表Collagen Ⅰ、Vimentin、TGF-β1、Smad2/3 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.4.3 各組小鼠右肺組織丙二醛（MDA）檢測(cè) 采用硫代巴比妥酸法（TBA法）。取小鼠右肺組織按照MDA 試劑盒說(shuō)明書操作步驟，制備成10%肺組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)532 nm 處測(cè)定每個(gè)樣本的吸光度（OD 值），使用已知丙二醛含量的樣本生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組小鼠右肺組織MDA 含量（nmoL/mgprot）。MDA 含量越高，說(shuō)明肺組織脂質(zhì)過(guò)氧化程度越明顯。

1.4.4 各組小鼠右肺組織EMT過(guò)程中上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin mRNA、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA mRNA 檢測(cè) 采用Real-time qPCR法。取各組小鼠右肺組織解融，剪碎后研磨，制備成勻漿。使用TRIzol法提取小鼠右肺組織的總RNA，使用Nanodrop檢測(cè)RNA濃度及純度；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s（40個(gè)循環(huán)）；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃15 s。E-cadherin mRNA上游引物5'-CGACCGGAAGTGACTCGAAAT-3'，下游引物5' -TCAGAACCACTGCCCTCGTAAT-3'；α-SMA mRNA上游引物5'-GTACCACCATGTACCCAGGC-3'，5' -GAAGGTAGACAGCGAAGCCA-3'；GAPDH 上游引物5'-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3'；下游引物5'-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3'。以GAPDH 作為內(nèi)參，以2-△△CT代表E-cadherin mRNA、α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料通過(guò)Shapiro-Wilk 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，通過(guò)Levene 檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用LSD-t法進(jìn)行事后組間兩兩比較；方差不齊時(shí)進(jìn)行Welch 檢驗(yàn)，采用Tamhane's T2法進(jìn)行事后組間兩兩比較，生存率采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠左肺纖維化程度比較

2.1.1 各組小鼠左肺系數(shù)比較 第21 天時(shí)對(duì)照組小鼠死亡0 只，CGA 高劑量一組、二組分別死亡1只，CGA 中劑量、低劑量組分別死亡2 只，模型組死亡4只。CGA高劑量一組、CGA高劑量二組、CGA中劑量組、CGA 低劑量組、模型組及對(duì)照組小鼠的左肺系數(shù)分別為0.606 1% ± 0.007 4%、0.567 5% ±0.004 9%、0.852 6% ± 0.027 6%、1.304 5% ±0.035 6%、1.941 4% ± 0.027 3%、0.532 5% ±0.009 1%，與對(duì)照組相比，模型組小鼠左肺系數(shù)升高（P＜0.001）；與模型組相比，CGA 各劑量組小鼠的左肺系數(shù)降低（P均＜0.001），且呈劑量依賴性（P＜0.001）；與CGA 高劑量一組比較，CGA 高劑量二組小鼠左肺系數(shù)低（P＜0.001）。

2.1.2 各組小鼠左肺組織病理改變及Ashcroft 評(píng)分比較 對(duì)照組小鼠左肺組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)肺泡間隔水腫，肺泡或支氣管壁可見(jiàn)少許膠原纖維；與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織肺泡腔狹窄、塌陷，肺泡間隔明顯增厚，成纖維細(xì)胞顯著增多，發(fā)生明顯纖維化，大面積纖維灶形成，肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞；與模型組相比，CGA 各劑量組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞程度及膠原纖維沉積情況均得到不同程度的改善。CGA高劑量一組、CGA 高劑量二組、CGA 低劑量組、CGA中劑量組、模型組及對(duì)照組小鼠左肺組織Ashcroft評(píng)分分別為（2.33 ± 1.21）、（2.33 ± 1.21）、（4.33 ±0.82）、（3.33 ± 0.82）、（7.33 ± 0.82）、（0.67 ±0.82）分。與對(duì)照組比較，模型組小鼠左肺組織Ashcroft 評(píng)分高（P＜0.001）；與模型組比較，CGA 各劑量組小鼠肺纖維化Ashcroft 評(píng)分均低（P均＜0.001）；與CGA 低劑量組比較，CGA 高劑量一組小鼠肺纖維化Ashcroft評(píng)分低（P＜0.01）。

2.2 各組小鼠左肺組織α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 CGA高劑量一組、CGA高劑量二組、CGA中劑量組、CGA 低劑量組、模型組及對(duì)照組小鼠左肺組織α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.167 8 ± 0.014 3、1.141 8 ± 0.029 1、1.485 5 ± 0.018 5、1.724 1 ±0.054 7、2.215 3 ± 0.073 7、1.000 0 ± 0.029 4，與對(duì)照組比較，模型組小鼠左肺組織α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)水平高（P＜0.001）；與模型組相比，CGA 各劑量組小鼠左肺組織α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低（P均＜0.001），且降低程度呈劑量依賴性（P＜0.01）。

2.3 各組小鼠左肺組織Collagen Ⅰ、Vimentin 及TGF-β1、Smads2/3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 各組小鼠左肺組織Collagen Ⅰ、Vimentin 及TGF-β1、Smads2/3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠左肺組織Collagen Ⅰ、Vimentin、TGF-β1及Smads2/3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（± s）

表1 各組小鼠左肺組織Collagen Ⅰ、Vimentin、TGF-β1及Smads2/3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與CGA 低劑量組比較，&P＜0.001；與CGA 中劑量組比較，▲P＜0.01；與CGA 高劑量一組比較，▼P＜0.001。

組別CGA低劑量組CGA中劑量組CGA高劑量一組CGA高劑量二組對(duì)照組模型組Collagen Ⅰ0.127 8 ± 0.006 4*#0.104 3 ± 0.003 5*#&0.084 0 ± 0.001 9*#&▲0.062 0 ± 0.005 2*#▼0.039 5 ± 0.003 6 0.216 2 ± 0.007 3*Vimentin 0.201 7 ± 0.006 5*#0.152 8 ± 0.006 6*#&0.129 0 ± 0.003 0*#&▲0.104 2 ± 0.004 8*#▼0.090 2 ± 0.004 7 0.266 8 ± 0.012 5*TGF-β1 0.141 0 ± 0.002 8*#0.117 8 ± 0.001 0*#&0.103 5 ± 0.002 2*#&▲0.085 2 ± 0.002 8*#▼0.064 5 ± 0.004 6 0.186 3 ± 0.014 2*Smad2/3 0.213 8 ± 0.004 1*#0.184 8 ± 0.001 8*#&0.162 0 ± 0.003 6*#&▲0.126 2 ± 0.002 8*#▼0.092 8 ± 0.002 7 0.255 2 ± 0.013 7*

2.4 各組小鼠右肺組織中MDA含量比較 CGA高劑量一組、CGA 高劑量二組、CGA 中劑量組、CGA 低劑量組、模型組及對(duì)照組小鼠右肺組織中MDA含量分別為（1.76 ± 0.08）、（1.58 ± 0.11）、（1.77 ±0.10）、（1.81 ± 0.08）、（1.82 ± 0.12）、（1.20 ± 0.18）nmoL/mgprot。與對(duì)照組比較，模型組小鼠右肺組織MDA含量高（P＜0.001）；與模型組比較，CGA高劑量二組小鼠右肺組織MDA含量低（P＜0.01），CGA高劑量一組小鼠右肺組織MDA含量與模型組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與CGA 高劑量一組比較，CGA高劑量二組小鼠右肺組織MDA含量低（P＜0.05）。

2.5 各組小鼠右肺組織E-cadherin及α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 各組小鼠右肺組織E-cadherin及α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠右肺組織E-cadherin及α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（± s）

表2 各組小鼠右肺組織E-cadherin及α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與CGA 低劑量組比較，&P＜0.01；與CGA中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別CGA低劑量組CGA中劑量組CGA高劑量一組CGA高劑量二組對(duì)照組模型組E-cadherin mRNA 0.141 1 ± 0.032 3*0.332 5 ± 0.078 8*#&0.472 2 ± 0.053 8*#&▲0.385 0 ± 0.067 2*#1.003 9 ± 0.110 3 0.068 3 ± 0.059 1*α-SMA mRNA 6.064 6 ± 0.677 4*#2.946 1 ± 0.560 4*#&1.776 9 ± 0.125 4#&▲1.225 3 ± 0.056 3#1.133 6 ± 0.720 9 11.757 7 ± 0.608 4*

3 討論

IPF 的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，涉及復(fù)雜的細(xì)胞及分子機(jī)制。目前普遍認(rèn)為：遺傳和環(huán)境等多種因素共同作用，導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞（AECs）反復(fù)損傷和異常修復(fù)，誘導(dǎo)產(chǎn)生TGF-β、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及白介素-13（IL-13）等多種促纖維化細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，致使肺微環(huán)境內(nèi)抗纖維化和致纖維化因子失衡，促進(jìn)EMT 過(guò)程，使成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞等間葉細(xì)胞活化、增殖和募集，并分泌大量纖維性ECM，促進(jìn)肺基質(zhì)僵硬和纖維化的惡性循環(huán)，最終致使肺結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失［6］。因此，AECs 可以被認(rèn)為是肺纖維化的啟動(dòng)因子，在疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，IPF 被認(rèn)為是一種“上皮細(xì)胞驅(qū)動(dòng)疾病”，E-Cadherin 是上皮細(xì)胞之間的粘附連接的關(guān)鍵分子，是一種鈣依賴性細(xì)胞粘附跨膜糖蛋白，被認(rèn)為是典型的上皮標(biāo)志，并且E-Cadherin 下調(diào)在EMT 中起著核心作用；而肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是肺纖維化的關(guān)鍵效應(yīng)因子，肌成纖維細(xì)胞特征性表達(dá)α-SMA，具有收縮、遷移的能力，同時(shí)仍保持成纖維細(xì)胞的功能和特性；TGF-β1是目前最有效的生長(zhǎng)因子，被認(rèn)為是參與IPF 發(fā)生發(fā)展最關(guān)鍵的成纖維因子，它可以誘導(dǎo)大量成纖維細(xì)胞增殖、遷移并分化為肌成纖維細(xì)胞，這些成纖維細(xì)胞對(duì)凋亡表現(xiàn)出抗性，并積聚在成纖維細(xì)胞灶的活性纖維化部位，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)量生產(chǎn)和沉積；在肺纖維化的進(jìn)展過(guò)程中，EMT 也有助于肌成纖維細(xì)胞的擴(kuò)張，導(dǎo)致纖維化過(guò)程的發(fā)展和維持［12］。因此，抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖和活化，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞凋亡，阻斷EMT 過(guò)程對(duì)于肺纖維化的治療至關(guān)重要。文獻(xiàn)［13］中報(bào)導(dǎo)TGF-β1可通過(guò)Smad 蛋白依賴型信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)EMT，在肺纖維化中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肺組織中E-Cadherin等上皮細(xì)胞表型的表達(dá)水平明顯降低，而Vimentin、α-SMA等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)水平明顯升高，表明博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維過(guò)程中發(fā)生了EMT，若能有效抑制EMT過(guò)程的發(fā)生，可能延緩甚至終止肺纖維化進(jìn)展。與此同時(shí)，模型組小鼠肺組織中TGF-β1/Smads 信號(hào)通路中的TGF-β1、Smad2/3 蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明TGF-β1/Smads 信號(hào)通路在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化過(guò)程中被激活。

小鼠單次氣管內(nèi)注射博萊霉素后1～7天為急性損傷和炎癥期，大量活性氧產(chǎn)生，介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化等氧化應(yīng)激反應(yīng)，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其水平變化可直接反映組織中脂質(zhì)過(guò)氧化程度及間接反映氧自由基含量，還可衡量機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)程度；博萊霉素作用后7～14 天是炎癥向纖維化活躍期的過(guò)渡階段；博萊霉素作用后第3 周為慢性纖維化階段，肺泡內(nèi)和間隔纖維化形態(tài)明顯。本研究使用博萊霉素單次氣管內(nèi)注射誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)小鼠肺纖維化，模型組小鼠肺系數(shù)明顯升高；HE染色可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚明顯，肺泡塌陷，肺泡腔縮小、甚至閉塞，大量纖維細(xì)胞增生；Masson染色可見(jiàn)明顯的藍(lán)色膠原纖維沉積，Ashcroft 評(píng)分明顯升高；免疫組化可見(jiàn)肺組織中Collagen Ⅰ等膠原蛋白表達(dá)水平明顯升高；表明成功誘導(dǎo)小鼠肺纖維模型。此外，模型組小鼠肺組織MDA 含量明顯升高，表明博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維過(guò)程中發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。

CGA 來(lái)源廣泛，其安全性已經(jīng)得到了證實(shí)，具有多種藥理特性。CGA 可防止肝纖維化過(guò)程中造血干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化；可抑制與腎纖維化相關(guān)的氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化；可減輕與心臟纖維化相關(guān)的氧化應(yīng)激和炎癥［10］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：各劑量CGA 干預(yù)組的小鼠肺系數(shù)降低，肺組織結(jié)構(gòu)破壞程度得到不同程度的減輕，Collagen Ⅰ等膠原纖維沉積減少，Ashcroft 評(píng)分降低，肺組織纖維化程度得到不同程度的改善。與此同時(shí)，CGA 干預(yù)后可明顯上調(diào)小鼠肺組織EMT 過(guò)程中的E-Cadherin 表達(dá)，下調(diào)Vimentin、α-SMA 表達(dá)，表明CGA 可抑制EMT 過(guò)程；在CGA 干預(yù)后TGF-β1、Smad2/3等與TGF-β1/ Smads信號(hào)通路相關(guān)的蛋白表達(dá)下調(diào)，表明CGA 可抑制肺纖維化過(guò)程中TGF-β1/Smads 信號(hào)通路。此外，CGA 高劑量二組小鼠肺系數(shù)及肺組織中的MDA 含量、Collagen Ⅰ蛋白表達(dá)較模型組低，且低于CGA 高劑量一組；表明早期予以CGA 干預(yù)能在一定程度上減輕小鼠在肺纖維化進(jìn)程中的脂質(zhì)過(guò)氧化程度，發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述，在一定濃度范圍內(nèi)，綠原酸干預(yù)可減輕博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化程度，且呈劑量依賴性，其改善肺纖維化的作用機(jī)制可能與抑制TGF-β 1/ Smads 信號(hào)通路從而抑制EMT 有關(guān)。此外，綠原酸早期干預(yù)可減輕小鼠肺纖維化過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而在一定程度上協(xié)同減輕肺纖維化。