野生中藥材農(nóng)藥殘留樣品制備方法綜述

李 瑞，郭 楊，張樹武，蔣 瓊

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，蘭州 730000；2甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治重點實驗室，蘭州 730000）

0 引言

中草藥是一類具有藥用價值的重要植物資源。其中，冬蟲夏草、人參和靈芝等野生中藥材因稀有、獨特的藥理作用，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中具有非常重要的地位，被廣泛應(yīng)用于制藥、保健等領(lǐng)域。冬蟲夏草[1]是冬蟲夏草菌侵染蝙蝠蛾科幼蟲而形成的蟲菌復(fù)合體，也是青藏高原特有的珍貴生物資源，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、護(hù)肝腎等藥理作用[2]。人參[3]是五加科人參屬，多年生草本植物，具有較高藥用價值[4]，有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、增強人體免疫力、抗腫瘤、抗疲勞和抗菌等作用[5]。靈芝[6]是多孔菌科靈芝屬，一般指赤芝或紫芝的干燥子實體[7]。靈芝子實體成熟時產(chǎn)生釋放出靈芝孢子[8]具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗糖尿等作用[7-8]。但這類中藥材目前人工種植難度較大，且人工種植難以成活或品質(zhì)較差，藥物來源仍舊以野生采摘入藥為主，因此此類野生藥材的采集處理和前處理方法較為重要。

隨著農(nóng)藥[9]產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，農(nóng)藥殘留問題日益嚴(yán)重，農(nóng)藥殘留漂移[10]、遷移[11]等現(xiàn)象的發(fā)生，野生植物資源[12]中存在農(nóng)藥殘留[13]的報道也逐漸增多。農(nóng)藥使用后的殘留問題造成野生資源品質(zhì)下降，并對野生中藥材資源的數(shù)量、區(qū)域分布、種間平衡等產(chǎn)生不同程度影響。農(nóng)藥殘留的漂移、遷移問題也正是中藥材體內(nèi)農(nóng)藥殘留成分超標(biāo)的主要誘因，嚴(yán)重影響品質(zhì)質(zhì)量與使用安全[14]，因此對野生藥材中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測分析是十分必要的。

樣品采集與預(yù)處理是農(nóng)藥殘留分析過程中的樣品前處理環(huán)節(jié)，采集方法和制備結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化對后續(xù)試驗數(shù)據(jù)具有影響，研究規(guī)范化樣品采集與制備很有必要。筆者綜述冬蟲夏草、人參和靈芝3 種名貴中藥材樣品農(nóng)藥殘留分析的采集與制備方法，旨在進(jìn)一步明確名貴中藥材的采集方法與樣品前處理過程的標(biāo)準(zhǔn)操作，為野生中藥材的農(nóng)藥殘留分析研究提供前期試驗基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 名貴中藥材樣品采集

1.1 冬蟲夏草

冬蟲夏草是傳統(tǒng)的名貴滋補中藥材，具有廣泛的藥用價值，在中藥領(lǐng)域占有重要地位，且市場發(fā)展前景廣闊，需求量較大[15]。目前冬蟲夏草人工繁育技術(shù)不斷完善，該技術(shù)主要通過收集冬蟲夏草菌的分生孢子，人工接種到蝙蝠蛾幼蟲的蟲體上，將感菌的幼蟲在室內(nèi)模擬的高原環(huán)境條件下培育或適合冬蟲夏草生長的高海拔環(huán)境下培育，直至長出子座形成冬蟲夏草[16]。但在蟲體形狀、子座形狀等方面仍與野生品存在差異，人工繁育的冬蟲夏草蟲體大多呈現(xiàn)飽滿的圓柱形，子座形狀一般較為順直，容易斷裂[17]。此外產(chǎn)量低、成本高、繁育周期長、寄主蝠蛾生長易遭受病害侵襲等問題也尚未解決[16]。

野生冬蟲夏草的蟲體大多呈現(xiàn)圓柱形，子座一般是彎曲狀或扭曲狀，質(zhì)地較為柔韌。在營養(yǎng)價值方面，野生冬蟲夏草的蛋白質(zhì)含量和種類都優(yōu)于人工繁育品[18]，甘露醇和多糖的平均水平也是野生品優(yōu)于人工繁育品[19]。因此本研究涉及的冬蟲夏草來源還是以野外采集為主。

1.1.1 采樣地點 冬蟲夏草主要分布于西藏[20]、青海[21]、四川[22]、云南[23]和甘肅[24]等高海拔地區(qū)。其中西藏地區(qū)包括拉薩、那曲、昌都、山南、林芝、日喀則等，云南地區(qū)包括德欽、麗江、中甸、巧家、維西、寧蒗、東川、云龍、大理、貢山等，青海地區(qū)包括玉樹、果洛、海南、黃南、海東等，四川地區(qū)包括德陽、綿陽、北川、樂山、雅安、涼山、阿壩、甘孜等，甘肅地區(qū)包括甘南、臨夏、隴南等[25]。分布中心是青藏高原的那曲、玉樹、昌都等地[26]。

1.1.2 采樣時間 冬蟲夏草在每年農(nóng)歷4—5月高原（海拔3000～5200 m）積雪開始融化時進(jìn)行采挖。此時冬蟲夏草菌的子座多暴露在雪地表面，出苗（種子發(fā)芽后成長的幼苗露出地表面）未超過3 cm，是采收的最適時期。采收時間過早，蟲草發(fā)育不成熟；采收時間過晚則積雪融化，周圍雜草遍布，難以尋找[27]。

1.1.3 采樣方法 冬蟲夏草入土很淺，通常使用寬3～5 cm、長不超過30 cm 的小尖鋤作為采集工具。采挖時，用鋤頭撬起冬蟲夏草近邊的草皮，輕提子座取出蟲草[27]。根據(jù)《冬蟲夏草采挖技術(shù)規(guī)程》(DB63/T 701—2008)規(guī)定采挖工具距離草頭約7 cm 左右，連同草皮挖9 cm 左右，再取出蟲草。采挖后，坑要填平、踩實，采挖產(chǎn)生的裸露面積不應(yīng)該超過30～50 cm2。裸露的原植被放回原處，做到隨挖隨填。取出的蟲草應(yīng)放入布袋內(nèi)暫存。然后將采集樣品用保鮮袋真空包裝，做好標(biāo)記，并在24 h內(nèi)運送回實驗室。

建議根據(jù)冬蟲夏草生長海拔高度選擇樣方區(qū)域采樣，目前暫無相關(guān)文獻(xiàn)報道。該方法針對野外采樣效果更加合理，即在海拔高度3000～5200 m之間，平均分為4 個海拔高度區(qū)域，分別為3000～3550、3550～4100、4100～4650、4650～5200 m，在這4個區(qū)域內(nèi)采用隨機(jī)取樣的方式進(jìn)行采樣。因野生冬蟲夏草生長分布不均勻，無法在某一標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域內(nèi)規(guī)范化采收，為了取樣的均一性，需要劃定幾個大的分布區(qū)域，在該區(qū)域里進(jìn)行隨機(jī)抽取，以達(dá)到取樣的科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。受自然條件的限制，冬蟲夏草采集過程中需嚴(yán)格控制采集的數(shù)量。冬蟲夏草屬于稀有保護(hù)物種，為防止對種群整體分布產(chǎn)生影響，不能過度采集，滿足研究條件即可，防止破壞種群生長。

1.2 人參

可以根據(jù)環(huán)境種植條件對人參進(jìn)行分類。藥用人參分為野生人參[28]、林下山參[29]、移山參[30]和園參[31]等。其中野生人參主要指種子自然落地或被鳥獸傳播，在深山密林中沒有任何人為干擾的情況下自然發(fā)芽，長期自然生長的原生態(tài)人參，屬于國家一級保護(hù)植物[32]。林下山參指人工野外播種后，野生環(huán)境下自然生長而成，一般經(jīng)過15 年以上成株，存活率5%左右，且功效接近野生人參，在市場上常被標(biāo)注為野山參進(jìn)行銷售[33]。移山參是半自然半人工培育的人參，在采參時可以將小野山參或山參捻子移植到看護(hù)的山林中或人工的參園子里，也可以將人工種植的山參移植到野生環(huán)境條件下[33]。園參是人工栽培的品種，可分為山上栽參和平地栽參2種[34]。本研究探討的人參采集方法和預(yù)處理主要針對林下山參。

1.2.1 采樣地點 人參在中國吉林、遼寧和黑龍江三省東部的長白山脈、小興安嶺東南部、朝鮮半島北部和俄羅斯烏蘇里江流域等地區(qū)分布[32]。國內(nèi)林下山參主要分布在遼寧省和吉林省，主要產(chǎn)區(qū)是桓仁、集安等地，多集中在北緯40°—45°、海拔500～1000 m 的各種山地[32]。在采樣時根據(jù)其生長環(huán)境選擇合適的地點。

1.2.2 采樣時間 林下山參采收年限一般為15～20 年，若在20年后采收則品質(zhì)更好，可達(dá)到野生人參的藥用價值[35]。林下山參在每年7月下旬—8月上旬，秋季參葉變黃、越冬芽[36]長大之前進(jìn)山挖掘為宜[37]。

1.2.3 采樣方法 根據(jù)《林下山參規(guī)范化生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（試行）》規(guī)定，選用鎬、鍬、軟質(zhì)小棍棒（如樹枝）、軟毛小刷等作為采收工具。以植株地上部分的面積確定參根部位挖掘的開盤位置，然后用板鎬在確定面積的四周擴(kuò)散挖土，再由外向內(nèi)逐漸集中輕挖。以不傷參根為采集先決條件。采挖時，用樹棍先從植株基部清除近土，然后采用軟毛小刷沿須根、支根、主根，一根根小心刷去根須浮土，最后將參根取出，不損傷根系任何部位，保證參根的完整無缺。一般常用青苔、草皮或適量松軟的腐殖土，埋在藤筐等容器內(nèi)或?qū)⒘窒律絽脮捍?，保護(hù)林下山參整體（包括參須）不受損害[37]。采集到的樣品集中后用保鮮袋真空包裝，做好標(biāo)記，并在24 h內(nèi)運回實驗室進(jìn)行處理。

因沒有相關(guān)采集方法的文獻(xiàn)報道，根據(jù)林下山參分布的地形特點，建議分層取樣，即在野外山林條件下以山頭作為選取區(qū)域的樣方總體，根據(jù)植被類型而進(jìn)行分組，再從每組中隨機(jī)抽樣。因林下山參生長分布不均勻，無法在山林條件下規(guī)范化采收，所以需要劃定大的分布區(qū)域，在區(qū)域內(nèi)進(jìn)行分組隨機(jī)抽取，以達(dá)到取樣的科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。受自然條件的限制，需嚴(yán)格控制林下山參采集的數(shù)量。林下山參屬于珍貴物種，為防止對種群整體分布產(chǎn)生影響，不能過度采集，滿足研究條件即可。

1.3 靈芝

靈芝子實體俗稱靈芝，靈芝孢子是靈芝的生殖細(xì)胞。靈芝子實體為一年生，屬木栓質(zhì)，由菌蓋和菌柄組成。靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細(xì)小的孢子顆粒，內(nèi)含靈芝全部遺傳活性物質(zhì)[8]。孢子顆粒具有重要藥理活性，是靈芝類保健產(chǎn)品的主要有效成分[38]。

1.3.1 采樣地點 野生靈芝一般生長在濕度高且光線昏暗山林中的腐樹或其根部[39]。靈芝分布于河北、山西、山東、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、臺灣、湖南、海南、廣西、貴州、四川、吉林及云南等地[40]。采樣地點以這些地區(qū)為主。

1.3.2 采樣時間 靈芝一般在每年6—7 月進(jìn)行采收[41]。當(dāng)靈芝子實體菌蓋從白色生長圈消失開始，菌蓋不再增大，繼續(xù)增厚，邊緣由黃色變成棕褐色，菌蓋表面顏色一致，有少量孢子粉開始彈射，此時靈芝子實體已基本成熟[42]，可進(jìn)行采收。

1.3.3 采樣方法 采收時，野生條件下生長的靈芝，用果樹剪從靈芝子實體的菌柄基部剪下，應(yīng)盡量不觸摸碰撞菌蓋，以防孢子粉沾染掉落，再剪去過長的菌柄，清除菌蓋上的泥土和其他雜質(zhì)。保證靈芝子實體和孢子粉結(jié)構(gòu)的完整。

人工栽培的靈芝，子實體采收與野生品種的操作基本相同，但孢子粉的收集方式不同。常用的孢子粉收集方法有培養(yǎng)架密封收集、套紙筒收集、小拱棚地膜收集、風(fēng)機(jī)吸附收集[42]等，可選擇適宜的方法。將采集到的全部樣品用真空保鮮袋包裝，做好標(biāo)記，并在24 h內(nèi)運送回實驗室。

建議根據(jù)靈芝生長方式的不同而選擇不同的采樣方法。野生條件下生長的靈芝有長在地上的，也有長在樹樁上的[43]。生長在地上的靈芝可以選擇分層取樣，即在野外山地條件下選取一定區(qū)域（參考區(qū)域大小1000 m×1000 m）作為樣方總體，將總體進(jìn)行分組，再從每組中隨機(jī)抽樣。生長在樹樁上的靈芝可選擇分群取樣，以不同樹群作為取樣區(qū)域，在該區(qū)域內(nèi)隨機(jī)抽樣即可。野生靈芝生長分布不均勻，無法規(guī)范化采收，所以需要制定不同的取樣方法。受自然條件的限制，靈芝采集過程中，需嚴(yán)格控制采集的數(shù)量。靈芝屬于稀有保護(hù)物種，為防止對種群整體分布產(chǎn)生影響，不能過度采集，滿足研究條件即可。

2 樣品預(yù)處理

2.1 冬蟲夏草

樣品送至實驗室，將新鮮冬蟲夏草先做干燥預(yù)處理。當(dāng)蟲體未干時，用鑷子除去附著在蟲體上的黃色蠟衣，再用刷子除去附著在蟲體上的浮土等雜質(zhì)，然后在干燥通風(fēng)處陰干。待完全干燥后，將樣品統(tǒng)一收集管理，并粘貼標(biāo)簽，記錄完整信息（采收名稱、采收時間、采收地點、采收人等）。也可將采集后的蟲草先清洗干凈，曬干至六七成再除去蟲體上多余的附著物及其他雜質(zhì)，最后陰干或低溫干燥[27]，待完全干燥后重復(fù)上述步驟。除傳統(tǒng)的干燥工藝外，真空冷凍干燥技術(shù)[44]也適用于冬蟲夏草的干燥預(yù)處理[45]，將采集的冬蟲夏草平鋪在凍干機(jī)的托盤中，低溫高真空條件下冷凍干燥96 h，至水分含量低于13%時即可收集[45]。水分含量的測定以《中國藥典》2015 年版四部中水分測定法（烘干法）進(jìn)行操作[45]。

干燥后的冬蟲夏草可用研缽或打粉器粉碎，粉碎前后均記錄樣品質(zhì)量，計算損耗率，并將粉末全部過篩。過篩（50 目篩[46]、80 目篩[47]、100 目篩[48]）后稱重并充分混勻，封存于磨口的廣口瓶中，粘貼標(biāo)簽記錄樣品的完整信息。

冬蟲夏草樣品有效成分萃取過程可以采用溶劑提取法、超聲波提取法、超臨界CO2萃取法和固相萃取法等技術(shù)。

2.1.1 溶劑提取法 溶劑提取法是利用物質(zhì)中各種成分在互不相溶的溶劑中其溶解度不同而將有效成分進(jìn)行分離的一種方法[49-50]，也是常用的提取方法。保存的冬蟲夏草粉末適量稱取后加入蒸餾水水浴加熱，過濾后再加入水和甘油的混合液(V水:V甘油=1.0:21.5)，繼續(xù)水浴加熱提取，接著真空濃縮和離心，離心后取上清液并加入相同質(zhì)量的甘油，最后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，得到樣品中有效成分的提取物[51]，提取過程基本完成。

溶劑提取法作為樣品前處理過程中一種傳統(tǒng)的方法經(jīng)常被采用[52]，但其操作復(fù)雜、提取時間較長、效率較低、危害分析人員身體健康、污染環(huán)境[52]，需謹(jǐn)慎選擇。

2.1.2 超聲波提取法 超聲波提取是利用超聲波輻射產(chǎn)生的強烈空化效應(yīng)、機(jī)械振動、高加速度、乳化擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用等多級效應(yīng)，增大物質(zhì)分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標(biāo)成分有效進(jìn)入溶劑，促進(jìn)提取的進(jìn)行[53-54]。將保存的冬蟲夏草樣品粉末加入提取液后充分混勻，經(jīng)超聲和離心處理后取上清液，再繼續(xù)水浴加熱，加熱后過0.22 μm 水系濾膜過濾，最終取濾液即可[46]。超聲波提取法具有操作簡便、提取時間較短、提取適應(yīng)性廣、分析速度較快、污染少環(huán)保等優(yōu)點[53-54]，在食品、藥品、工業(yè)原料和農(nóng)業(yè)環(huán)境等方面有良好的發(fā)展前景[52]。

2.1.3 超臨界CO2萃取法 超臨界CO2萃取法是由萃取和分離組合而成的一種新型的萃取分離技術(shù)[55]。保存的冬蟲夏草樣品加入到超臨界CO2萃取池中（壓力20 MPa，解析溫度40℃），經(jīng)過動態(tài)和靜態(tài)萃取后用干燥劑過夜處理，最后將濾除干燥劑的濾液用二氯甲烷定容到容量瓶中[47]即可。超臨界CO2萃取法適用性強、靈活性高、無污染、節(jié)約能源[56]、操作簡單、提取效率較高、精密度較高，是一種發(fā)展較快、應(yīng)用較廣的物質(zhì)分離技術(shù)[52,57-58]。

2.1.4 固相萃取法 固相萃取法通過采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品的不同成分進(jìn)行分離，從而實現(xiàn)分離和富集目標(biāo)化合物的目的[52,57]。將準(zhǔn)確稱取的蟲草粉末加入離心管后用純水渦旋混勻浸泡，再用乙腈振蕩提取和氯化鈉劇烈搖晃離心，最后取上清液等待下一步凈化[48]。緊接著將萃取柱(Supelclean ENVI-18)放入固定架并轉(zhuǎn)移提取液至固相萃取小柱上，先用乙腈預(yù)洗后將收集的提取液和洗滌液在水浴中濃縮，再加正己烷復(fù)溶等待進(jìn)一步凈化。將另一萃取柱(DSC-SiSPE)放入固定架上并加入無水硫酸鈉，以二氯甲烷-正己烷和正己烷溶液預(yù)洗，當(dāng)去除淋洗液后加入正己烷提取液并用二氯甲烷-正己烷混合溶洗脫，收集洗脫液及水浴濃縮至凈干，再用正己烷溶液進(jìn)行溶劑置換，重復(fù)1～2次后用正己烷定容[48,59-60]。

固相萃取法可以提高樣品的處理量、減少雜質(zhì)的干擾、回收率較高、重現(xiàn)性較好、精確度較高，是目前國內(nèi)農(nóng)藥殘留樣品前處理過程中的主流技術(shù)[52,57,61-62]，可選為珍貴中藥材樣品提取方法。

2.2 人參

樣品送達(dá)實驗室后，將采集到的林下山參用3～5 cm 寬的毛刷或柔軟牙刷在水里把林下山參的蘆、膀、體、須等4 個部位上的浮土淤泥等雜質(zhì)刷洗干凈，清潔干凈后參體呈白色或黃白色為宜，注意清洗過程不能破壞主根表皮部分[37]。將清洗完的林下山參進(jìn)行切片，切片技術(shù)包括輥壓切片法和冷凍切片法等，待全部完成后，將樣品統(tǒng)一收集管理并粘貼標(biāo)簽，記錄完整信息（采收名稱、采收時間、采收地點、采收人等）。除了切片操作外，林下山參也可進(jìn)行粉碎處理。將清洗干凈的林下山參放在通風(fēng)處陰干，干燥后的林下山參可用研缽、打粉器或超微粉碎技術(shù)粉碎，待完全粉碎后，重復(fù)上述收集管理步驟。

2.2.1 輥壓切片法 將清洗完的林下山參樣品進(jìn)行陰干，使其含水量控制在10%～25%。再用小型輥壓機(jī)一次性輥壓處理（壓力控制在5～20 kg），輥壓后切成厚度為1.0～1.5 mm 薄片，最后干燥至含水量為3%～7%即可[63]。輥壓切片法通過輥壓整個參體，合理破壞其纖維組織結(jié)構(gòu)，更有利于水浸泡后纖維組織被重新浸潤，藥材成分可以被高效浸出[63]。

2.2.2 冷凍切片法 冷凍切片法是利用低溫條件使樣品組織快速冷凍，并達(dá)到一定的硬度后進(jìn)行切片的方法[64]。將清洗完的林下山參樣品通風(fēng)陰干，含水量控制在5%～15%，然后在-20～-5℃下冷凍處理后切為厚度1.0～1.5 mm 的薄片，干燥至含水量為3%～7%即可[63]。冷凍切片法相比于其他方法更加快速方便，能很好地保留樣品組織中的抗原和酶活性，但也存在保存時間較短、無法進(jìn)行回顧性研究等缺點[65]。

2.2.3 超微粉碎技術(shù) 超微粉碎技術(shù)是利用機(jī)械或流體動力的方法克服固體內(nèi)部凝聚力進(jìn)行破碎，使樣品物料的直徑小于10μm，甚至達(dá)到1μm 的超微水平[66-67]。對林下山參樣品進(jìn)行粉碎，需要將人參樣品烘干后置于破碎機(jī)中破碎，使其呈小塊狀，然后選用振動式超微粉碎機(jī)將其進(jìn)行粉碎[68]。超微粉碎技術(shù)的特點是速度快、時間短、操作簡便、粒徑大小均等、利用率高等[69]，在中藥材粉碎技術(shù)中可廣泛應(yīng)用。

2.3 靈芝

靈芝孢子粉和靈芝子實體分別需要進(jìn)行干燥預(yù)處理。采集到的野生靈芝先用毛刷（或毛筆）將菌蓋及保鮮袋上的孢子粉輕輕刷入培養(yǎng)皿中，并晾干。再清除靈芝子實體上的泥沙雜質(zhì)，剪除附有的朽木，晾曬或在40～50℃烘箱中烘干[70]。待全部干燥后將樣品統(tǒng)一收集管理，并粘貼標(biāo)簽，記錄完整信息（采收名稱、采收時間、采收地點、采收人等）。干燥的靈芝子實體可用研缽或打粉器粉碎，粉碎前后均記錄樣品質(zhì)量，計算損耗率，并將粉末全部過篩。過篩后稱重并充分混勻，封存于磨口的廣口瓶中，粘貼標(biāo)簽記錄樣品的完整信息。干燥的靈芝孢子粉采用破壁技術(shù)進(jìn)行處理，達(dá)到有效成分的合理運用與檢測。常用的破壁方法有機(jī)械法、物理法、化學(xué)法、生物法、綜合法等[71]，其中綜合法包括機(jī)械與物理、機(jī)械與生物或化學(xué)等組合方法[72]。根據(jù)樣品具體形態(tài)和要求選擇合適的細(xì)胞破壁方法。

2.3.1 機(jī)械破壁法

（1）超微粉碎孢子破壁法。該方法利用超微粉碎技術(shù)，借用機(jī)械或流體動力克服固體內(nèi)部凝聚力從而實現(xiàn)孢子破碎，破碎后樣品物料的直徑小于10 μm，甚至達(dá)到1 μm的超微水平[66-67]。超微粉碎技術(shù)可分為機(jī)械粉碎和化學(xué)合成粉碎，其中機(jī)械粉碎包括氣流式、高頻振動式、旋轉(zhuǎn)球（棒）磨式、錘擊式和自磨式，以及膠體磨和均質(zhì)機(jī)[67]。超微粉碎孢子破壁技術(shù)有利于增加有效物質(zhì)的溶出，提高生物利用度，增強藥用效果并節(jié)約資源，避免了環(huán)境污染[66,73]。目前，超微振動粉碎法是工業(yè)上靈芝孢子破壁的主要方法，氣流粉碎機(jī)也是近年來粉碎中藥材的重要方法之一[71]。

（2）擠壓膨化孢子破壁法。利用螺桿擠壓膨化的方式，通過壓力、剪切力、摩擦力、升溫等作用對物料進(jìn)行處理，完成高溫高壓條件下靈芝孢子的細(xì)胞壁破壁，達(dá)到破壁的效果[74]，這種方法稱為擠壓膨化孢子破壁法。它將靈芝孢子與一定量的純凈水進(jìn)行混合調(diào)配，待孢子充分濕潤后利用雙螺桿擠出機(jī)處理，使其保持濕潤狀態(tài)，再放入恒溫干燥箱內(nèi)干燥，并粉碎處理[75]。擠壓膨化孢子破壁法操作簡便，適合大量連續(xù)的孢子進(jìn)行破壁處理，能效高、污染少。但操作過程中伴隨著壓力和溫度的升高，可能會造成個別靈芝孢子性質(zhì)的改變，影響其破壁效果[72,76]。

（3）超高壓超臨界流體撞擊流孢子破壁法。采用超臨界二氧化碳作為靈芝孢子破壁的工作流體，實現(xiàn)破壁的一種方法[71,77]。通過將超臨界二氧化碳作為撞擊粉碎過程中的載體，在超高壓的條件下，形成一個高壓、高速射流區(qū)，在此區(qū)域內(nèi)靈芝孢子相互碰撞、摩擦，產(chǎn)生的擠壓力和剪切力使孢子達(dá)到破壁的效果[77]。該方法的破壁效率較高，但由于靈芝孢子的質(zhì)量較小，撞擊的著力點難以找尋，所以可以結(jié)合其他方法共同完成靈芝孢子破壁[71]。

2.3.2 物理破壁法

（1）超聲波孢子破壁法。通過超聲波技術(shù)，引起靈芝孢子周圍溶液氣泡炸裂而產(chǎn)生的機(jī)械作用力使其達(dá)到破壁的效果[71]。超聲波孢子破壁法能夠縮短其破壁時間，但如果單獨使用超聲波破壁，容易產(chǎn)生局部高熱，而使孢子失活變性，降低破壁效率[72]。

（2）微波孢子破壁法。以輻射形式加熱的電磁波直接作用于孢子體內(nèi)的水分子，使其吸熱蒸發(fā)后的壓力破壞孢子的細(xì)胞壁[71]。用微波爐將靈芝孢子微波處理后加入到特制的振動磨中，并沖入氬氣，然后低溫震動粉碎即可[78]。微波孢子破壁法具有操作簡便、成本低、無污染等優(yōu)點，但也同樣容易造成孢子失活變性[71]。

（3）超低溫液氮脆化孢子破壁法。利用液氮的超低溫原理，將靈芝孢子快速凍結(jié)后再解凍，從而達(dá)到破壁的效果[79]。使用真空泵制取一定過冷的液氮，將過篩的靈芝孢子用滌綸布打包直接彈入過冷液氮中進(jìn)行超快速凍結(jié)后并迅速取出，在恒溫水浴中解凍，解凍后的靈芝孢子于顯微鏡下直接觀察拍照并統(tǒng)計破壁率[79]。超低溫液氮脆化破壁法耗能較低、操作簡便、破壁效果較好，但作用時間相對較長[72]。

2.3.3 化學(xué)破壁法 使用化學(xué)溶劑提取靈芝孢子中的有效成分，或利用酸、堿等試劑降解其孢子的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[72]，多用于靈芝孢子破壁的前處理或孢子粉有效成分提取等?；瘜W(xué)破壁法的優(yōu)點是設(shè)備投入少、能量消耗低，缺點是提取或破壁時間相對較長，容易造成溶劑殘留等污染情況[72]。

2.3.4 生物破壁法

（1）酶解孢子破壁法。通過利用溶壁酶來破壞靈芝孢子的細(xì)胞壁達(dá)到破壁的效果[71-72]。將靈芝孢子粉配制成液體，再進(jìn)行復(fù)水[80]。稀釋少量樣品并觀察細(xì)胞復(fù)水情況。用檸檬酸調(diào)制至pH 4.5，并添加溶壁酶。調(diào)制完的混合液恒溫攪拌，待酶解完成后按鈍酶處理。將酶解液預(yù)凍，取出后加水融化，再繼續(xù)冷凍。在凍融液中添加硅藻土，攪拌均勻后用醋酸纖維膜減壓過濾。然后在干燥塔中，經(jīng)過霧化器噴成霧狀與高溫?zé)犸L(fēng)接觸后水分迅速蒸發(fā)，干燥成靈芝孢子粉[81]。酶解孢子破壁法的破壁效率較高，破壁效果明顯[72,82]。

（2）微生物孢子破壁法。微生物孢子破壁法先將靈芝孢子粉滅菌，再采用灰色鏈霉菌作為溶壁菌對靈芝孢子進(jìn)行破壁處理。該方法可以最大程度保留靈芝孢子體內(nèi)的有效活性成分，更有利于人體吸收[72,83]。

2.3.5 綜合法

（1）變溫壓差脆化結(jié)合超微粉碎孢子破壁法。周萍等[84]利用變溫壓差脆化技術(shù)結(jié)合超微粉碎技術(shù)對靈芝孢子進(jìn)行破壁處理，破壁率可達(dá)99%以上。以變溫壓差脆化技術(shù)作為樣品預(yù)處理，將保存的樣品放在變溫壓差脆化的罐中，保溫保壓一段時間后瞬間泄壓使樣品脆化，且在真空環(huán)境條件下脫水干燥，得到干燥的靈芝孢子[85]。接下來將脆化、干燥的靈芝孢子放入振動式超微粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎處理，孢子破壁過程基本完成[84]。該方法可以提高孢子破壁的效率[86]。

（2）高壓冷凍孢子破壁法。吳鐵等[87]采用高壓滅菌法在121℃、維持30 min 條件下先對靈芝孢子進(jìn)行高壓破壁，然后在烤箱中烘干，再放置到冰箱冷凍，取出后繼續(xù)烘干即可，靈芝孢子的破壁過程基本完成。高壓冷凍破壁法的破壁率可達(dá)到99%以上，提高了孢子的破壁效率[72]。

3 樣品保存方法

將制備的樣品用于試驗研究后，剩余的樣品放入密封干凈的容器中，貼好標(biāo)簽（樣品名稱、制備時間、制備地點、剩余樣品質(zhì)量等）并保存。一般保留半年，時間不宜過長。冬蟲夏草剩余干燥粉末放置在磨口的廣口瓶中并于冰箱冷藏保存。林下山參剩余切片晾干后低溫干燥保存，林下山參干燥粉末也放置在磨口的廣口瓶中低溫保存。靈芝子實體剩余干燥粉末放置在磨口的廣口瓶中并于冰箱冷藏保存。破壁后的靈芝孢子粉應(yīng)低溫、避光保存。

4 展望

文章通過整理冬蟲夏草、人參、靈芝3種名貴野生中藥材農(nóng)藥殘留檢測分析中樣品采集與制備的方法，歸納總結(jié)了其采樣、樣品前處理及樣品保存的具體過程。該操作簡單完整，可較大限度減少樣品的損耗，進(jìn)一步完善野生中藥材農(nóng)藥殘留樣品預(yù)處理的方法。

目前，中藥材中農(nóng)藥殘留檢測樣品前處理過程，往往都是以萃取、凈化為主，根據(jù)樣品有效成分和性質(zhì)，通過改變其萃取、凈化條件而進(jìn)一步優(yōu)化試驗方案。主要包括使用不同的有機(jī)溶劑，選擇不同的萃取方法（固相萃取、固相微萃取、液液微萃取、微波萃取、超臨界流體萃取等），縮短試驗時間和完善試驗步驟等，但萃取、凈化2 個試驗過程無法制定詳細(xì)具體的操作準(zhǔn)則，不能完全保留試驗所需樣品的有效成分，造成樣品浪費及分析結(jié)果誤差，這是目前農(nóng)藥殘留檢測分析中面臨的問題。此外，中藥材采集也是藥材加工炮制的重要環(huán)節(jié)，針對其采集方法的研究也是按照中藥材的種類，分類討論其采集方法和注意事項，沒有具體實現(xiàn)某一藥材的采樣過程，是目前樣品采集與制備中存在的問題。因此，面對以上問題，現(xiàn)階段需要更多的研究人員關(guān)注中藥材樣品采集制備領(lǐng)域，通過更多實踐操作去總結(jié)開創(chuàng)新的采樣方法，并整理一套完整科學(xué)的樣品處理過程，未來可能不僅體現(xiàn)在中藥材上，也應(yīng)展現(xiàn)在不同樣品種類中。最終，筆者選擇了中藥材中具有重要價值的3 種，結(jié)合大量文獻(xiàn)資料總結(jié)了相關(guān)農(nóng)藥殘留檢測分析中采樣及樣品前處理的方法。

王新風(fēng)[88]通過整理蔬菜樣品相關(guān)資料，概括了農(nóng)藥殘留檢測分析中蔬菜樣品采集與制備的具體方法，依據(jù)不同種類的蔬菜樣品，總結(jié)了其采集數(shù)量和制備等標(biāo)準(zhǔn)。對于中藥材的樣品采集與制備來說，參考蔬菜樣品可以一定程度上應(yīng)用相關(guān)的基本方法，例如在采樣數(shù)量和樣品運輸方面可以吸取經(jīng)驗，還有鮮樣制備方面去除多余殘留物等，對于特殊中藥材可以采取該方法，但具體樣品還需具體分析，在蔬菜樣品采樣方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步細(xì)化樣品種類，爭取在中藥材樣品中創(chuàng)新制備過程，然后通過實際運用等改進(jìn)或調(diào)整方案，以得到更加適合中藥材樣品的采樣方法，為中藥材樣品提供理論和技術(shù)指導(dǎo)。

采樣與制備方法的標(biāo)準(zhǔn)化不僅對農(nóng)藥殘留檢測分析工作具有價值，對樣品加工處理等環(huán)節(jié)也有重要作用，因此在未來還需探討和學(xué)習(xí)。