宿主靶向抗乙型肝炎病毒治療策略研究新進展*

方慧晶 綜述,朱傳龍,章莉莉 審校

HBV感染已呈世界性流行。據(jù)統(tǒng)計,全球每年約有88.7萬人死于HBV感染相關(guān)疾病,其中肝硬化和肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)分別占死亡原因的52%和38%。目前,HBV的治療很少能完全清除病毒,即使藥物應答良好的患者在停藥后仍可能會出現(xiàn)病毒學復發(fā)。HBV難以清除的關(guān)鍵,一方面在于病毒的復制與轉(zhuǎn)錄模板——共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的持續(xù)存在,另一方面在于宿主免疫反應的缺陷。現(xiàn)有的抗病毒藥物治療局限于抑制病毒的復制,從而延緩肝臟纖維化及肝細胞肝癌的發(fā)生,然而對cccDNA的持續(xù)存在無能為力[1]。已有研究發(fā)現(xiàn),HBV cccDNA的形成依賴于宿主因子[2],HBV生命周期的完整性與宿主因素密不可分,靶向宿主的治療藥物有極大的治療潛力。由于乙型肝炎病毒株的變異,針對宿主自身因素的治療發(fā)生耐藥的風險遠遠低于針對病毒本身的藥物,同時其作用的靶點較僅針對病毒的藥物也更為廣闊。此外,有研究證明,新型藥物的研發(fā)及聯(lián)合使用,會增加 HBsAg 血清清除率,誘導 HBV的功能性治愈,但具體療效仍需要大量臨床研究驗證[3]。目前,抑制病毒進入、破壞病毒核酸穩(wěn)定性以及增強宿主對HBV的免疫反應是抗病毒藥物研發(fā)的主要思路。

1 靶向HBV進入的宿主因素

HBV具有高度的物種特異性和嗜肝性,需要通過肝臟特異性高親和力受體——鈉離子牛黃膽酸共轉(zhuǎn)運蛋白(sodium-taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)介導進入肝細胞[4]。目前已證實HBV首先在HBsAg的S域中抗原環(huán)的介導下,以低親和力的方式附著在肝細胞膜的硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPGs)上。緊隨其后,L-HBsAg的PreS1域以高親和力的方式與肝細胞基底膜上的NTCP結(jié)合,此時PreS1 N端肉豆蔻化以增強受體識別能力從而促進病毒感染[5]。因此,靶向NTCP及其底物介導的病毒入胞過程為探索抗HBV治療提供了更廣闊的思路[6]。Myrcludex B(別名Bulevirtide)是一種源自HBV preS1結(jié)構(gòu)域的合成脂肽,可與HBV競爭性結(jié)合NTCP,從而特異性阻斷病毒對正常肝細胞的感染,同時抑制已感染肝細胞內(nèi)cccDNA的生成。一項IIb期臨床試驗表明,Myrcludex B +PegIFN-α治療48周后,HBV/HDV合并感染患者血清HBsAg陰轉(zhuǎn)率為27%[7]。此外,替諾福韋與Myrcludex B聯(lián)合用藥表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性,且兩種藥物對彼此藥代動力學穩(wěn)態(tài)無影響[8]。目前Myrcludex B正進入III期臨床研究,研究者將對CHB患者進行單藥治療或與PegIFN-α聯(lián)合治療的效果評估。另一種進入抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)及其衍生物則是通過抑制preS1附著于NTCP而阻止病毒進入肝細胞,CsA衍生物SCY450和SCY995僅抑制 HBV 進入而不顯著影響 NTCP 的轉(zhuǎn)運蛋白功能,避免發(fā)生膽汁酸攝取障礙[9]。曲格列酮從特異性抑制表皮生長因子誘導的NTCP寡聚化方面阻斷HBV preS1及其受體NTCP的內(nèi)化,抑制HBV感染[10]。有研究表明E-鈣粘蛋白通過與糖基化的NTCP相互作用促進其在肝細胞中的膜定位,而敲低E-鈣粘蛋白可顯著降低HBV顆粒的感染以及HBV假顆粒進入受感染的肝細胞和細胞系[11]。NTCP的糖基化在生物學上直接和/或間接影響HBV感染過程[12]。靶向NTCP的藥物可阻止病毒進入未感染肝細胞,從而對肝臟形成一定的保護作用,但是其終究對已進入細胞并開始轉(zhuǎn)錄復制的病毒束手無策,因此上述藥物勢必要聯(lián)合其他抗病毒藥物治療,達到最終的臨床治愈。

2 靶向宿主因子

2.1 靶向宿主RNA相關(guān)因子 已知HBV mRNA代謝依賴于宿主轉(zhuǎn)錄機制,影響宿主細胞mRNA代謝周期的RNA監(jiān)測和降解機制很可能同時影響HBs mRNA產(chǎn)生與降解。據(jù)報道,HBV mRNA的穩(wěn)定性,由宿主非經(jīng)典的多聚腺苷酸化聚合酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域5和7(noncanonical poly(A) polymerase-associated domain 5 and 7,PAPD5 and PAPD7)調(diào)節(jié),在敲低PAPD5 / 7后可觀察到HepaRG細胞和原代人肝細胞中HBs顯著降低[13]。宿主蛋白PAPD5/7的主要功能是將異常的非編碼RNA(ncRNA)的3'末端寡聚腺苷酸化,進行外泌體降解。而HBV通過劫持PAPD5 / 7的RNA腺苷酸化功能來穩(wěn)定病毒mRNA[14]。作為靶向宿主途徑調(diào)節(jié)PAPD5/7和HBV mRNA間相互作用的藥物,口服小分子二氫喹啉酮(DHQ)可通過抑制宿主PAPD5/7,誘導HBV RNA快速和選擇性降解,從而減少病毒基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[15]。具有DHQ結(jié)構(gòu)的先導化合物RG7834已被證明可在體外和體內(nèi)選擇性地減少HBsAg、HBeAg以及HBV DNA[16]。而對于已報道的RG7834急性神經(jīng)毒性,有研究嘗試通過合成高度肝臟特異性DHQ衍生物,以限制藥物在血液中的分布,避免藥物的全身分布從而減輕甚至消除其對多臟器的毒性作用[17]。另一二氫喹酮類化合物AB-452也表現(xiàn)出HBV特異性抗病毒活性,可抑制HBV DNA復制,降低HBsAg、HBeAg的表達[18]。

2.2 靶向宿主DNA相關(guān)因子 作為HBV轉(zhuǎn)錄與復制的模板,cccDNA的產(chǎn)生和持續(xù)存在是HBV感染最關(guān)鍵的步驟之一,盡管將病毒粒子相關(guān)的松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA ,rcDNA)轉(zhuǎn)化為這種穩(wěn)定的微染色體的過程尚不完全明確,但目前已證實宿主細胞DNA合成和修復因子(如DNA修復酶TDP2或TDP相關(guān)蛋白[19],DNA聚合酶α[20],κ[21]、DNA連接酶[22]、FEN1[23]及 DNA拓撲異構(gòu)酶I和II)是HBV cccDNA合成中不可或缺的因素。病毒庫的沉默勢必會極大地促進HBV的功能性治愈,因此,從宿主因子方面著手調(diào)控cccDNA生成的研究前景深遠。其中,TDP2同時作為病毒蛋白解鏈酶,參與病毒轉(zhuǎn)錄和翻譯,基于此構(gòu)建高選擇性TDP2抑制劑異惡唑喹啉二酮衍生物[24],為抗HBV治療開辟了新的思路。宿主細胞DNA修復通路ATR-CHK1抑制劑AZD6738和VE-821可在體外減少cccDNA生成[25]。

除外上述抑制cccDNA產(chǎn)生的宿主因子,目前已被證實對HBV感染有負性調(diào)節(jié)作用的宿主限制因子包括NF-κB、STAT1和STAT2、PROX1、EZH2、YY1、SIRT1和 SIRT3、 PRMT1、PRMT5、HDAC1、SETDB1、 Smc5/6、ZHX2、DDX3及APOBEC3A和APOBEC3B[26]。研究表明,乙型肝炎病毒編碼調(diào)節(jié)X蛋白(HBx)通過劫持含有細胞DDB1的E3泛素連接酶來靶向降解染色體結(jié)構(gòu)維持復合物5/6(structural maintenance of chromosomes complex 5/6,Smc5/6),促進受感染細胞染色體外病毒基因組的轉(zhuǎn)錄[27]。在有效抑制HBx的前提下, Smc5/6復合物可促進人肝嵌合小鼠體內(nèi)HBV cccDNA沉默,進而實現(xiàn)病毒轉(zhuǎn)錄的持續(xù)抑制[28]。有研究發(fā)現(xiàn)硝唑尼特和pevonedistat (MLN 4924)[29]可阻斷Smc5/6的降解并恢復Smc5/6表達,抑制HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄,其中硝唑尼特已獲FDA批準用于治療多種病毒和寄生蟲感染,但仍需要更多臨床研究進一步評估抗病毒活性。由此可見,靶向宿主DNA修復機制的思路,極有可能成為最終消除cccDNA的治療方向。

3 靶向免疫調(diào)節(jié)

3.1 靶向固有免疫調(diào)節(jié) 模式識別受體 (pattern recognition receptor,PRR) 是宿主抗病毒免疫的第一道防線,可檢測病毒病原體的保守分子特征并通過PRR家族特異性銜接蛋白(例如,干擾素基因刺激物 (STING) 或 MYD88)以及一組絲氨酸/蘇氨酸激酶和轉(zhuǎn)錄因子的分層激活啟動先天免疫信號傳導。慢性乙型肝炎患者肝臟活檢的相關(guān)研究表明,HBV可逃避病毒攜帶者的模式識別受體[30],這一特征推進了模式識別受體靶向藥物作為潛在抗病毒治療藥物的研究。根據(jù)亞細胞定位可以將這些先天免疫傳感器分為兩大類:位于質(zhì)膜或內(nèi)體膜上識別細胞外病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)的PRR,包括 Toll 樣受體 (Toll-like receptor,TLR) 和C型凝集素受體(C-type lectin receptors,CLR);存在于哺乳動物細胞的細胞質(zhì)或細胞核中的PRR,包括NOD樣受體(NOD-like receptor,NLR)、RIG -I 樣受體(RIG-I-like receptor,RLR)及其他細胞內(nèi) DNA 傳感器[31]。

TLR介導通路的激活誘導HBV復制的抑制和HBV特異性適應性免疫的恢復。目前研究較多的TLR7激動劑GS-9620[32],可在漿細胞樣樹突狀細胞中誘導IFN-α產(chǎn)生,在慢性感染 WHV 的土撥鼠和感染 HBV 的黑猩猩中觀察到病毒載量顯著持續(xù)降低[33]。最新研究發(fā)現(xiàn)抗SIGLEC-3mAb (10C8)可以逆轉(zhuǎn) HBV介導的TLR 配體相關(guān)的免疫抑制并上調(diào)對抗原呈遞至關(guān)重要的表面分子。此外,10C8 與 GS-9620 具有協(xié)同作用,可上調(diào)細胞因子的產(chǎn)生以及 MHC-I、MHC-II 和共刺激信號的表達水平[34]。由于在Ib/IIa期試驗中,單獨使用GS-9620無法達到血清HBV DNA和HBsAg水平的顯著變化[35],因此將 GS-9620和10C8 聯(lián)合使用可增強T細胞免疫力以清除 HBV 感染,是一種很有前景的策略。口服TLR7 激動劑 JNJ-4964通過細胞因子介導的非細胞溶解機制實現(xiàn)抗HBV作用,在臨床前實驗中觀察到劑量依賴性抗HBV活性以及全身細胞因子、B 和 T 細胞誘導激活[36]。TLR8激動劑GS-9688可將土撥鼠肝內(nèi)WHV DNA和RNA 水平降低 20 倍[37]。GS-9688在人外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中誘導細胞因子,通過多種免疫介質(zhì)激活抗病毒效應功能[38]。研究發(fā)現(xiàn),用GS-9688刺激過的PBMC作為培養(yǎng)基,培養(yǎng)出的HBV感染的原代肝細胞中觀察到病毒標志物的減少[39]。而雙重TLR 7/8 調(diào)節(jié)劑2,4-二氨基喹唑啉用于乙型肝炎病毒治療也正在研究中[40],TLR 2也被證實是HBV感染后B細胞活化所必須的。隨著TLR通路中的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導蛋白——髓系分化初級反應蛋白(myeloid differentiation primary response protein, MyD88)在宿主免疫信號通路中作用的發(fā)現(xiàn),靶向MyD88藥物也為抗病毒治療提供了廣泛的思路。但要達到完全清除病毒的目的,還需要更廣泛且深入的研究來確定TLR在病毒感染后機體免疫過程中的具體作用通路。

研究表明,HBV利用CLR途徑劫持樹突狀細胞(dendritic cell, DC)亞群從而逃避機體的免疫監(jiān)視。因此,通過調(diào)節(jié)病毒聚糖-凝集素軸來改變病毒與宿主間的相互作用,最終觸發(fā)機體免疫反應達到清除病毒效果不失為抗病毒治療的另一思路[41]。RIG-I通過識別HBV pgRNA 5' ε 區(qū)域并誘導III型干擾素的產(chǎn)生激活機體先天免疫,此外,RIG-I還能以RNA結(jié)合的方式,抑制聚合酶介導的衣殼化,達到抗病毒的效果[42]。目前已有RIG-I相關(guān)藥物進行動物試驗,據(jù)報道RIG-I/NOD2激動劑SB 9200 (Iranigivir)可降低土撥鼠的血清WHV DNA 及WHsAg和水平[43]。

3.2 靶向特異性免疫 慢性乙型肝炎患者特異性免疫治療策略最大的挑戰(zhàn)是T細胞免疫耐受及病毒特異性T細胞耗竭。有研究表明,在CHB 患者中程序性死亡受體1 (PD-1) 等抑制性受體在T細胞上過度表達,引起T細胞負性調(diào)節(jié),這可能是慢性乙型肝炎患者肝臟中T細胞耗竭出現(xiàn)病毒持續(xù)性感染難以清除的原因。在Ib 期臨床研究中,PD-1抑制劑nivolumab可導致大多數(shù)患者HBsAg下降[44]。PD-1抑制劑JNJ-63723283和口服PD-L1抑制劑AB-101目前已分別進入I期臨床和臨床前試驗。

乙型肝炎治療性疫苗BRII-179的 IIa期臨床研究表明,單獨使用或與低劑量干擾素-α 聯(lián)合使用可誘導增強CHB患者的特異性抗體和T細胞反應,但是對病毒學狀態(tài)影響較小[45]。用于治療CHB 的免疫原性疫苗的暫未能表現(xiàn)出可靠的療效,但有研究報道,樹突狀細胞受體靶向嵌合免疫治療蛋白[46]在綿羊和人的PBMCs中,可誘導出HBV特異性抗體并增強T細胞反應[47]。通過 T 細胞受體 (TCR) 基因轉(zhuǎn)移或通過使用嵌合抗原受體 (CAR) T 細胞來實現(xiàn)基因重編程以創(chuàng)建功能性 T 細胞以消除 HBV 感染的肝細胞可能是一種HBV治療新策[48]。盡管CAR-T細胞療法會降低發(fā)生HCC和肝硬化的機會,但是該治療方案的生產(chǎn)和實施繁瑣、昂貴,對技能人員要求較高,暫時無法替代現(xiàn)有的抗病毒治療[49]。

4 結(jié)論與展望

慢性乙型肝炎的治療是困擾全球?qū)W者許久的重大問題,而開辟新的治療靶點,例如NTCP及其底物、宿主PAPD5/7、TDP2以及上調(diào)機體免疫反應等,其相關(guān)藥物已在臨床前及臨床試驗中表現(xiàn)出較好的抗病毒活性,均可以優(yōu)化現(xiàn)有的治療方案。慢性乙型肝炎的治愈,重點與難點在于清除HBV cccDNA。因此,更準確與全面的了解HBV復制的分子生物學過程,尤其是cccDNA的產(chǎn)生和降解的影響因素,將是實現(xiàn)乙型肝炎全面治愈的關(guān)鍵。同時,針對HBVDNA、RNA、核衣殼及逆轉(zhuǎn)錄酶等作用機制的研究也為新型藥物研發(fā)提供了較多可靠的治療靶點依據(jù)。有研究表明,相較于單一藥物治療,在核苷(酸)類似物或干擾素療法的基礎(chǔ)上,加用病毒進入抑制劑、核心蛋白變構(gòu)調(diào)節(jié)劑和轉(zhuǎn)錄抑制劑會具有更好的抗病毒效果[50],而上述新藥的研發(fā)及新藥與現(xiàn)有藥物的聯(lián)合治療也在加大力度研究中,可以想見未來慢性乙型肝炎治愈的方案必然會是針對病毒與宿主兩方面、多靶點,同時更安全更高效。