芪仁通脈合劑中枳實(shí)的薄層色譜鑒別研究

趙娟娟 陸蕙蘭 葉侃倜 葉芷希 楊駿

（上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院 上海 200020）

芪仁通脈合劑是上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院的醫(yī)院制劑，處方由黃芪、燀桃仁、蜜麩炒枳實(shí)、當(dāng)歸、川芎、赤芍、地黃、牛膝、牡丹皮、炒地龍、桂枝、雞血藤和白茯苓等13 味中藥組成，具有益氣養(yǎng)血，活血通絡(luò)的功效，臨床上主要用于治療動(dòng)脈硬化，腦及冠狀動(dòng)脈供血不足所致的冠心病、中風(fēng)、頭暈眼花、胸悶心悸、四肢麻木、靜脈曲張等癥。原制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有枳實(shí)的薄層鑒別及水分等常規(guī)檢查項(xiàng)目，但是通過長期實(shí)驗(yàn)積累的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，以枳實(shí)對(duì)照藥材薄層色譜法鑒別枳實(shí)，在“枳實(shí)對(duì)照藥材”對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)處，供試品顯色特別淡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較不穩(wěn)定。通過文獻(xiàn)分析，枳實(shí)中的橙皮苷可作為指標(biāo)成分進(jìn)行鑒別[1-5]，因此，為控制藥品質(zhì)量，保證臨床用藥的安全性和有效性，本研究依據(jù)2020 版藥典的要求對(duì)芪仁通脈合劑原標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下枳實(shí)的鑒別方法加以研究改進(jìn)，建立新方法，達(dá)到薄層色譜法要求的快速、簡潔、明了的目的，從而為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

ATS4 全自動(dòng)點(diǎn)樣儀、Visualizer 2 薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司）；ST-40R 高速冷凍離心機(jī)、ST-40 高速離心機(jī)（賽默飛公司）；MS204TS/02 電子天平、XSE105DU 電子天平（梅特勒-托利多公司）；P120H超聲波清洗儀（德國Elma 公司）；TW20 恒溫水浴鍋（優(yōu)萊博公司）；KBF(E5.3)恒溫恒濕箱（Binder 公司）；Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)（Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥材

乙酸乙酯、甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、無水甲酸（General-Reagent 公司）；三氯化鋁（麥克林公司）；薄層色譜硅膠預(yù)制板（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）；高效硅膠G 板（青島海洋化學(xué)工業(yè)研究所）；HPTLC silica gel 60 F254（德國Merck 公司）。

橙皮苷對(duì)照品、枳實(shí)（酸橙）對(duì)照藥材（中國食品藥品檢定研究院）；芪仁通脈合劑（上海寶龍藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)2109001、2111001、2111002）；缺枳實(shí)陰性制劑（上海寶龍藥業(yè)股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 供試品制備方法考察

1）供試品溶液 方法1：取芪仁通脈合劑（批號(hào)：2109001）10 mL，置于50 mL 離心管中，加二氯甲烷15 mL，振搖提取，離心（3 800 r/min，25 ℃），取上清液，再用乙酸乙酯萃取2 次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液A；方法2：省略二氯甲烷提取，其余按方法1 制備供試品溶液B。

2）對(duì)照品溶液 取橙皮苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含0.3 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。

3）對(duì)照藥材溶液 取枳實(shí)對(duì)照藥材0.1 g，同對(duì)照品溶液方法制成對(duì)照藥材溶液。

4）陰性溶液制備 取缺枳實(shí)陰性制劑10 mL，同供試品溶液方法制成陰性溶液。

1.3.2 不同展開劑、檢視方式及點(diǎn)樣量考察

吸取1.3.1 項(xiàng)下供試品溶液、橙皮苷對(duì)照品溶液以及陰性制劑溶液，分別將1、2、5 μL 點(diǎn)樣于同一高效硅膠G 薄層板上，分別置于展開系統(tǒng)一[乙酸乙酯-無水甲酸-水（10 ∶1 ∶1）]、展開系統(tǒng)二[三氯甲烷-甲醇-水（13 ∶7 ∶2）10 ℃以下放置的下層溶液]、展開系統(tǒng)三[三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3 ∶8 ∶4 ∶2）10 ℃以下放置的下層溶液]中展層，結(jié)束后取出薄層板，晾干，先直接置于254 nm 或365 nm 紫外燈下檢視，然后再用2%三氯化鋁乙醇溶液噴霧后置于365 nm 紫外燈下檢視。

1.3.3 專屬性考察

考察3 批芪仁通脈合劑和1 批陰性制劑的薄層色譜行為。

1.3.4 不同薄層板、溫、濕度及放置時(shí)間考察

考察3 種不同來源的薄層板，不同溫度（10、20、30 ℃）、濕度（30%、50%、70%）以及供試品不同放置時(shí)間（0、24、48 h）對(duì)芪仁通脈合劑提取液薄層色譜行為的影響。

2 結(jié)果

2.1 供試品制備方法考察

供試品溶液A 和B 色譜在對(duì)照品相應(yīng)位置均可檢出相應(yīng)條帶，兩種供試品溶液的色譜行為基本一致，說明增加二氯甲烷萃取，僅能減少溶劑前沿部分的干擾，未對(duì)主斑點(diǎn)部分產(chǎn)生影響，因此選擇方法2，即直接乙酸乙酯萃取作為芪仁通脈合劑的供試品溶液的制備方法。

此外，通過供試品色譜、陰性色譜和對(duì)照藥材色譜（圖1）比較可知，對(duì)照藥材色譜傳遞到供試品色譜中僅有橙皮苷相應(yīng)的條帶，因此可以采用橙皮苷對(duì)照品進(jìn)行芪仁通脈合劑中枳實(shí)的鑒別。

圖1 供試品制備方法考察

2.2 不同展開劑考察

3 個(gè)展開系統(tǒng)均能在對(duì)照品相應(yīng)位置檢出相應(yīng)條帶，且對(duì)照品比移值（retention factor, Rf）均在0.3～0.7 之間，供試品溶液色譜行為基本一致，但展開系統(tǒng)一和展開系統(tǒng)二供試品溶液中，在橙皮苷相應(yīng)色譜位置上方有一條條帶與之接近，容易重疊，進(jìn)而影響鑒別；而展開系統(tǒng)三，各條帶分離度好，且陰性均無干擾，因此選擇展開系統(tǒng)三作為枳實(shí)鑒別的薄層色譜展開系統(tǒng)（圖1）。

2.3 不同檢視方式考察

顯色前，在紫外燈254 nm 下，橙皮苷對(duì)照品斑點(diǎn)不清晰，特征性不強(qiáng)，而且陰性色譜在對(duì)照品相應(yīng)位置有干擾條帶；在紫外燈365 nm 下，對(duì)照品色譜無熒光條帶，因此兩種條件下均無法鑒別枳實(shí)。而三氯化鋁乙醇顯色后，紫外燈365 nm 下，供試品色譜在對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，均可檢出相同顏色的熒光條帶，且陰性無干擾，因此選擇顯色后的紫外燈365 nm 作為檢視方式。

2.4 供試品點(diǎn)樣量考察

不同點(diǎn)樣量供試品在橙皮苷對(duì)照品相應(yīng)位置均可檢出相同顏色的條帶，但點(diǎn)樣量為2 μL 時(shí)，供試品溶液中鑒別條帶顏色明顯，背景顏色較淺，易于鑒別，因此選擇供試品溶液的點(diǎn)樣體積為2 μL。

2.5 專屬性考察

3 批芪仁通脈合劑提取液和橙皮苷對(duì)照品均Rf 0.37處顯示相同顏色的熒光條帶，而陰性制劑無干擾，說明此方法專屬性強(qiáng)，可作為芪仁通脈合劑中枳實(shí)薄層鑒別方法（圖2）。

圖2 枳實(shí)的薄層色譜鑒別圖

2.6 不同薄層板、溫、濕度及供試品放置時(shí)間考察

在3 種不同來源薄層板，不同溫度和濕度以及供試品不同放置時(shí)間條件下，供試品色譜在與橙皮苷對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，均有相同顏色的斑點(diǎn)，分離度良好，且陰性無干擾，說明薄層板種類、溫度（10～30 ℃范圍內(nèi)）、濕度（30%～70%范圍內(nèi)）對(duì)芪仁通脈合劑的色譜行為影響較小，且供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 最佳枳實(shí)薄層條件

通過對(duì)上述實(shí)驗(yàn)參數(shù)的考察，優(yōu)化后的薄層色譜條件為：取芪仁通脈合劑10 mL，置于50 mL 離心管中，用乙酸乙酯萃取兩次，每次15 mL，離心后合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。取橙皮苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含0.3 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。取缺枳實(shí)陰性制劑10 mL，同供試品溶液方法制成陰性溶液。吸取上述供試品溶液、陰性溶液各2 μL，對(duì)照品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3 ∶8 ∶4 ∶2）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，以2%三氯化鋁乙醇溶液噴霧，晾干后置紫外燈光（365 nm）下檢視。

3 討論

本研究對(duì)芪仁通脈合劑中枳實(shí)的薄層鑒別條件進(jìn)行了考察和優(yōu)化。由于原枳實(shí)鑒別方法中，在“枳實(shí)對(duì)照藥材”對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)處，供試品顯現(xiàn)斑點(diǎn)特別淡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6]，本研究先是對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)的展開系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（7.5 ∶2.5 ∶0.5）為展開劑展開，結(jié)果顯示陰性溶液存在干擾，因此該鑒別方法不可行。研究表明，黃酮類化合物是枳實(shí)的主要藥效成分，約占總含量的20%，主要包括橙皮苷等[1-2]，目前已有大量文獻(xiàn)采用橙皮苷作為枳實(shí)的定性和定量檢測(cè)指標(biāo)[3-5]，因此本研究考慮采用橙皮苷作為芪仁通脈合劑中枳實(shí)的薄層鑒別指標(biāo)成分。

在對(duì)芪仁通脈合劑供試品制備時(shí)，還考察了其他制備方法，如用石油醚、乙醚萃取，或用氨水調(diào)樣品pH 等，結(jié)果均因陰性對(duì)照干擾、橙皮苷對(duì)照品顯色不清晰，以及供試品色譜的相應(yīng)位置未檢出對(duì)照品的特征斑點(diǎn)等原因而無法進(jìn)行定性鑒別。

枳實(shí)是芪仁通脈合劑的臣藥，在該方中起到活血祛瘀的功效，因此對(duì)其進(jìn)行定性鑒別，可在一定程度上反映制劑的質(zhì)量。但中藥成方制劑通常由多味藥組成，其藥效是多種活性物質(zhì)綜合作用的結(jié)果，若只對(duì)單味藥或單一成分進(jìn)行檢測(cè)，難以全面控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量[7]。因此，本研究后續(xù)應(yīng)考慮增加枳實(shí)的含量測(cè)定指標(biāo)，以及君藥黃芪、臣藥燀桃仁、川芎等其他藥味的定性和定量鑒別指標(biāo)，從而能更好地控制制劑的質(zhì)量。