探究可變剪接對(duì)銀屑病發(fā)病機(jī)制的影響

張 倩，王慧琴，吳衛(wèi)東*

（1.石河子大學(xué)，新疆 石河子 832000；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科，新疆 烏魯木齊 830001）

銀屑?。╬soriasis）是一種免疫介導(dǎo)的遺傳病[1]。了解銀屑病患者的免疫功能以及固有免疫與適應(yīng)性免疫之間的相互作用有助于控制這種復(fù)雜的疾病。目前，研究者們開始致力于分析銀屑病的基因表達(dá)。微陣列或RNA-seq 數(shù)據(jù)的差異表達(dá)分析顯示，大量的編碼和非編碼基因在銀屑病皮膚和健康對(duì)照皮膚之間存在差異表達(dá)[2]。一項(xiàng)基于RNA-Seq 的基因表達(dá)研究從銀屑病皮損和正常皮膚的大量樣本中發(fā)現(xiàn)了許多免疫系統(tǒng)中的差異表達(dá)基因[3]?；赗NA-Seq 數(shù)據(jù)的分析可以研究銀屑病中的選擇性剪接事件的變化。本研究將從RNA-Seq 技術(shù)角度探究是否存在相關(guān)RNA 結(jié)合蛋白，旨在尋找未發(fā)現(xiàn)的與銀屑病發(fā)病機(jī)制相關(guān)的靶基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究樣本 銀屑病病變組樣本取5 例，正常對(duì)照組樣本取5 例，針對(duì)每個(gè)樣本的比對(duì)結(jié)果用StringTie軟件進(jìn)行概率模型重建樣本中的轉(zhuǎn)錄本合并各個(gè)重建的樣本轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行匯總，進(jìn)而生成一個(gè)可代表本項(xiàng)目樣本轉(zhuǎn)錄情況的轉(zhuǎn)錄本集合。

1.1.2 試劑和儀器 DMEM 培養(yǎng)基，PBS 緩沖液(Thermo Fisher)，胰酶（Thermo Fisher)，1.5% 瓊脂糖凝膠，NanoPhotometer?分光光度計(jì)，Qubit?3.0 Flurometer，安捷倫 2100 RNA Nano 6000 Assay Kit。

1.2 方法

1.2.1 利用RNA-Seq 數(shù)據(jù)的差異選擇性剪接分析 用1 μg 總RNA 制 備RNA-seq 文 庫，去 除DNA，用VAHTS mRNA capture Beads (Vazyme, N401) 捕獲總RNA，用RNA clean beans 純化去除的RNA。利用KAPA 鏈mRNA-Seq Kit 對(duì)RNA 進(jìn)行碎片化、單鏈合成、雙鏈合成、末端修復(fù)、剪接、擴(kuò)增、純化等處理，制備鏈特異性RNA-seq 文庫。最后用Qubit 4.0進(jìn)行濃度定量，并置于-80 ℃冰箱中保存。進(jìn)行末端修復(fù)和5’接頭連接，然后用含有3’接頭序列和隨機(jī)六聚體的RT 引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。對(duì)cDNA 進(jìn)行純化和擴(kuò)增，對(duì)200-500 bps 的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量處理，-80 ℃保存?zhèn)溆?。制備文庫后，?yīng)用Illunima HiSeq X Ten 系統(tǒng)進(jìn)行 150 nt 雙端高通量測序。利用HISAT2 剪接splice junction，通過ABLas 對(duì)HISAT2剪接的splice junction 進(jìn)行處理。在RNA-seq 文庫中，使用Illumina Novaseq 6000 的PE150 模式進(jìn)行高通量測序。

1.2.2 差異基因功能分析 利用GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫對(duì)發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因和差異可變剪接基因進(jìn)行功能聚類分析?；虮倔w是描述基因和蛋白質(zhì)功能的數(shù)據(jù)庫，分為三大類: 分子功能、生物過程和細(xì)胞成分。通過GO 分類富集分析，分析了DEG 和RASG 的功能。將GO 數(shù)據(jù)庫中的每個(gè)term 投射出相應(yīng)的DEG和RASG，同時(shí)計(jì)算相關(guān)term 的基因數(shù)量。利用超幾何分布進(jìn)行檢驗(yàn)，可以獲得差異可變剪接基因顯著富集的GO 項(xiàng)在全基因組GO 注釋的背景下。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG) 是一個(gè)資源數(shù)據(jù)庫，可用于從分子水平的信息（特別是通過大分子數(shù)據(jù)集產(chǎn)生的基因組測序和其他高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)所獲信息）了解相關(guān)高級(jí)功能和生物系統(tǒng)( 如細(xì)胞、生物和生態(tài)系統(tǒng))。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)量檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中樣品顯示出的堿基質(zhì)量合格，reads讀數(shù)的大部分都可以比對(duì)到CDS 區(qū)域（見圖1），并且在基因各部位均勻分布；clean reads 的質(zhì)量分析顯示，Q30 的平均值為96.72%，故該實(shí)驗(yàn)中的高通量測序結(jié)果可靠。

圖1 reads 在基因組上的分布

2.2 差異表達(dá)基因

選取銀屑病病變組5 例和正常對(duì)照組5 例進(jìn)行高通量測序。整合分析銀屑病轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)集和對(duì)照數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因，利用Fold Change 和pvalue 篩選出差異表達(dá)顯著的mRNA 和lncRNA。將差異標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為P＜0.05 且差異表達(dá)倍數(shù)大于2 時(shí)，共檢測到2180 個(gè)差異表達(dá)基因。銀屑病病變組存在差異上調(diào)基因906 個(gè)，差異下調(diào)基因1274 個(gè)?；鹕綀D顯示，兩組樣本中mRNA 和IncRNA 的表達(dá)差異超過2 倍的轉(zhuǎn)錄本( 見圖2) ；紅點(diǎn)表示表達(dá)水平上調(diào)的基因，藍(lán)點(diǎn)表示表達(dá)水平下調(diào)的基因，黑點(diǎn)表示表達(dá)水平無顯著變化的基因。在本次變量剪接分析中，我們采用t檢驗(yàn)法比較兩個(gè)樣本中各基因相同剪接類型變量剪接水平的變化，以P值≤0.05 為標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行過濾，顯示顯著差異。兩組樣本中共發(fā)現(xiàn)差異上調(diào)基因1416 個(gè)，差異下調(diào)基因1629 個(gè)。我們對(duì)每個(gè)樣本中的RASG 和DEG 基因進(jìn)行整合分析，得到246 個(gè)表達(dá)水平差異顯著且剪接水平可變的基因。

圖2 差異表達(dá)火山圖

2.3 差異表達(dá)功能富集分析

本研究中通過分析銀屑病患者與正常健康者的皮膚樣本，并運(yùn)用RNA-Seq 數(shù)據(jù)揭示了相關(guān)可變剪接的大規(guī)模變化。根據(jù)基因本體論可分析具有差異性表達(dá)的mRNA，進(jìn)而研究銀屑病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制（包括生物學(xué)過程、細(xì)胞組件和分子功能三類）。研究結(jié)果顯示，在細(xì)胞組成中，差異可變剪接基因主要存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中，表明此類細(xì)胞組件可能與銀屑病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)；其中細(xì)胞質(zhì)差異表達(dá)的基因有783 個(gè)，細(xì)胞核差異表達(dá)的基因有721 個(gè)。在生物學(xué)過程中，差異可變剪接基因主要參與脂質(zhì)代謝過程、RNA 剪接的調(diào)節(jié)、脂肪酸代謝過程、mRNA 合成過程等。分子功能過程中，差異表達(dá)的mRNA 主要參與結(jié)合氧化還原酶反應(yīng)、催化酶反應(yīng)、裂解酶反應(yīng)，可以看出參與差異性表達(dá)的基因可通過各種生物學(xué)過程影響銀屑病的發(fā)病機(jī)制。從分子水平信息角度進(jìn)行差異可變剪接基因的KEGG pathway 富集性分析可知，差異表達(dá)主要富集于代謝途徑、黏附連接、脂肪酸代謝等過程中，表明銀屑病可變剪接事件的變化與銀屑病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

3 討論

以往的研究表明，可變剪接在銀屑病發(fā)病機(jī)制中具有潛在的作用。例如，TRAF3IP2 的突變亞型可能導(dǎo)致銀屑病的形成。TRAF3IP2 基因是導(dǎo)致銀屑病IL-17 信號(hào)通路的重要適配器。當(dāng)TRAF3IP2 的N端存在特定的氨基酸替換時(shí)，排除外顯子2 的亞型TRAF3IP2 失去了轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-17 信號(hào)調(diào)控下游基因表達(dá)的能力。這種突變亞型的表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)IL-22 和IL-17 的過度產(chǎn)生。因此，這種選擇性剪接使攜帶突變誘發(fā)者易患銀屑病[4]。金莉等人采用了一種基于大規(guī)模計(jì)算分析的系統(tǒng)生物學(xué)方法，利用銀屑病小鼠和人類數(shù)據(jù)集以及一個(gè)帶有擾動(dòng)SFs 的RNA-Seq 數(shù)據(jù)庫來生成關(guān)于可變剪接在銀屑病中潛在作用的生物學(xué)假設(shè)。這項(xiàng)大規(guī)模的分析表明，銀屑病中有18 個(gè)保守的ES 剪接事件以及幾個(gè)候選的SFs 可能會(huì)調(diào)節(jié)銀屑病中的基因剪接[5]。一項(xiàng)研究顯示，NFKBIZ 基因的遺傳變異與牛皮癬的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，并且其還可能有助于確定對(duì)抗TNF 生物藥物的反應(yīng)[6]。基于該基因在抗TNF 藥物發(fā)生反應(yīng)中的作用，有必要對(duì)相關(guān)全轉(zhuǎn)錄本和替代轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)差異進(jìn)行研究。可見，比較抗TNF 治療前后患者的轉(zhuǎn)錄水平也是必要的。通過對(duì)轉(zhuǎn)錄本可變剪接的分析，可為銀屑病的分子機(jī)制提供解釋，并為新治療方法的提出鋪平道路。本研究的結(jié)果表明，lncRNA 的可變剪接變化與多種細(xì)胞功能息息相關(guān)，同時(shí)在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果來看，銀屑病的病理改變與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞角質(zhì)化及細(xì)胞周期等多種因素相關(guān)。在細(xì)胞生命過程中，細(xì)胞周期為必不可少的過程。總的來說，銀屑病的病理改變可引起lncRNA 的差異表達(dá)，lncRNA 的不同表達(dá)作用于不同的細(xì)胞通路可引起差異表達(dá)基因的失調(diào)，二者共同決定了銀屑病的發(fā)病機(jī)制。目前已有研究闡述了選擇性剪接的改變?cè)趌ncRNA 中的貢獻(xiàn)。然而，關(guān)于特定lncRNA 亞型定位和功能的研究仍然很少。有研究指出，GAS5 lncRNA 經(jīng)歷了廣泛的選擇性剪接[7]，然而目前尚不清楚眾多的GAS5 替代剪接異型中哪一種參與了相關(guān)定位模式和功能的調(diào)節(jié)。除了選擇性剪接外，進(jìn)行l(wèi)ncRNA 轉(zhuǎn)錄本的差異處理可能有助于分析獨(dú)特亞細(xì)胞的定位和功能[8]。有實(shí)驗(yàn)表明，選擇性剪接的差異性改變可能對(duì)mRNA 和lncRNA 的分布產(chǎn)生不同的影響，需要通過進(jìn)一步的研究來充分闡明這些潛在的機(jī)制[9]?，F(xiàn)在，我們可以大膽猜測銀屑病發(fā)病過程中存在可受RNA 結(jié)合蛋白調(diào)控靶基因的作用。進(jìn)一步探討這些靶基因的作用機(jī)制可為銀屑病的治療提供新的方向。