菌黃保腸合劑對膿毒癥大鼠腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)作用的影響※

鐵明慧 陳 斌 龐永誠 李巽華 劉 明 陳維軍

(云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,云南 昆明 650500)

膿毒癥是由細菌等病原微生物侵入機體引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征,嚴重者可出現(xiàn)器官功能及循環(huán)障礙[1]。研究表明,炎性反應(yīng)及治療干預(yù)措施(如抗生素、質(zhì)子泵抑制劑、腸外營養(yǎng)等)等可引起腸道微生態(tài)環(huán)境發(fā)生劇烈變化,導(dǎo)致正常的腸道微生物組成結(jié)構(gòu)和功能喪失,細菌腸道易位和毒力基因轉(zhuǎn)化,是膿毒癥器官功能障礙的獨立危險因素[2-3],并有越來越多的實驗及臨床研究結(jié)果顯示,通過改善腸道微生物組成結(jié)構(gòu)可減輕膿毒癥炎性反應(yīng),提高患者生存率[4-5]。菌黃保腸合劑是我院重癥團隊20世紀80年代研制而成的醫(yī)院特色制劑,具有健脾益氣生津、清熱利濕行氣的功效,前期的臨床及藥理研究已證實菌黃保腸合劑具有治療腸道感染,促進腸道免疫及生物屏障修復(fù)的作用[6-7]。本實驗旨在探討菌黃保腸合劑對膿毒癥模型大鼠腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用,以期闡明菌黃保腸合劑在膿毒癥治療中的作用機制及實際應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠80只,10周齡,體質(zhì)量275～315 g,經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后進行實驗,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,合格證號：SYXK(湘)2016-0002,飼養(yǎng)在云南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,實驗動物設(shè)施使用許可證號：SYXK(滇)2017-005,本實驗獲得云南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會審核批準,批準編號：R-06201903。

1.2 實驗藥物 菌黃保腸合劑(主要由黃芪、太子參、茯苓、白術(shù)、酒炒黃連、薏苡仁、神曲、茵陳、石菖蒲等組成,云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科輔助加工制作,滇藥制字[Z]20082615A);雙歧桿菌活菌膠囊(麗珠集團麗珠制藥廠,批號2018020488-1);鹽酸頭孢噻呋鈉注射液(江西正和生物科技有限公司,批號20180802)。

1.3 主要實驗試劑及儀器

1.3.1 實驗試劑 細菌基因組總DNA抽提試劑盒(德國QIAGEN公司,貨號12888);腸道微生物樣本核酸純化試劑盒(德國QIAGEN公司,貨號51531);聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)用DNA聚合酶(日本TaKaRa公司,貨號R060B);定量DNA濃度檢測的熒光試劑(美國Thermo公司,貨號Q32854)。

1.3.2 主要儀器 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)儀(美國 Bio-Rad公司,型號580BR10905);核酸電泳儀(上海天能科技有限公司,型號HE-120);凝膠成像儀(上海天能科技有限公司,型號2500);QubitTMFlex熒光計(美國Thermo公司);高通量核酸純化工作站(德國QIAGEN公司,型號SN002358);Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)(美國Agilent公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組與模型制備 造模前禁食不禁水24 h,稱質(zhì)量后運用SPSS 21.0軟件進行完全隨機化分成4組：假手術(shù)組、模型組、菌黃保腸合劑組及雙歧桿菌組,每組各20只。采用盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)法制備大鼠膿毒癥模型[8]。以2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,麻醉滿意后大鼠無翻正反射,用碘伏常規(guī)消毒腹部區(qū)域,鋪無菌洞巾,用手術(shù)刀沿腹正中線作一長約3～4 cm縱行切口,逐層分離肌肉、筋膜、腹膜,無菌鑷探查并仔細分離盲腸。將分離的盲腸置于0.9%氯化鈉注射液濕潤的紗布上,在盲腸全長1/2處用4號線結(jié)扎,然后用20 G套管針將盲腸貫通穿孔2次,避免損傷腸系膜及盲腸血管,擠出少許糞便并確保針孔通暢,將盲腸回納腹腔,簡單縫合關(guān)腹后使用金屬夾臨時夾閉皮膚。其中假手術(shù)組僅分離并拖出暴露盲腸后直接回納腹腔,不進行結(jié)扎及穿刺操作。術(shù)后各組大鼠皮下注射預(yù)熱的0.9%氯化鈉注射液50 mL/kg補充手術(shù)中丟失的體液,并將其置于保溫墊上直至麻醉蘇醒后送回飼養(yǎng)室正常飼養(yǎng)。于CLP術(shù)后24 h時重新開腹,仔細切除壞死的盲腸,用60 mL預(yù)熱的0.9%氯化鈉注射液沖洗腹腔后逐層縫合,同時連續(xù)3天皮下注射鹽酸頭孢噻呋鈉抗感染治療,劑量為5 mg/(kg·d)。

1.4.2 動物給藥 CLP術(shù)后48 h對各組大鼠開始給藥處理,參照藥理試驗中大鼠與人體間的等效劑量換算[9],菌黃保腸合劑組按4.0 g/(kg·d)(成人等效劑量2倍)予菌黃保腸合劑灌胃,雙歧桿菌組按0.1 g/(kg·d)予雙歧桿菌活菌膠囊灌胃,假手術(shù)組和模型組予3 mL純凈水灌胃,各組均連續(xù)灌胃7天。灌胃結(jié)束后處死大鼠,采集的大鼠腸內(nèi)容物(空腸上段、回腸下段)樣本,備用。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 腸道內(nèi)容物細菌DNA提取 采集大鼠腸內(nèi)容物新鮮樣本后立即放入液氮中,2 h后儲存于-20 ℃冰箱。使用細菌基因組總DNA抽提試劑盒對樣本的基因組DNA進行提取,之后利用瓊脂糖凝膠電泳和熒光計測定樣本DNA濃度。

1.5.2 DNA文庫構(gòu)建及高通量測序 采用細菌16S V4(引物343F-798R)特異引物對DNA樣品進行PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)純化后構(gòu)建文庫。使用Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)測定文庫平均分子長度及濃度,并通過Real-time PCR對文庫進行量化。采用Illumina HiSeq 2500平臺對合格文庫進行Paired-end測序生成原始雙端序列,測序類型為PE250。

1.5.3 生物信息學(xué)分析 使用Trimmomatic 軟件對原始雙端序列進行去雜;使用Vsearch軟件聚類得到OTUs的代表序列;使用QIIME軟件將代表序列與數(shù)據(jù)庫進行比對注釋[10];物種比對注釋采用RDP分類算法[11]對代表序列與數(shù)據(jù)庫進行比對,進行物種注釋,得到相應(yīng)的物種信息和基于物種豐度的分布情況。計算細菌群落在門分類學(xué)相對豐度、Alpha多樣性指數(shù),分析beta多樣性,使用R軟件繪制出主坐標成分分析圖(PCoA),并采用在線分析程序LEfSe尋找組間在豐度上有顯著差異的物種[12]。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠7天生存率 除假手術(shù)組外,其余各組大鼠于CLP術(shù)后48 h開始陸續(xù)死亡,最后假手術(shù)組20只大鼠均存活,模型組11只大鼠存活,存活率55%,菌黃保腸合劑組14只大鼠存活,存活率70%,雙歧桿菌組13只大鼠存活,存活率65%。與假手術(shù)組比較,模型組、菌黃保腸合劑組、雙歧桿菌組大鼠存活率顯著降低,比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組、菌黃保腸合劑組、雙歧桿菌組3組大鼠存活率組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠術(shù)后7天生存率情況(n=20)

2.2 各組大鼠腸道細菌群落在門分類學(xué)水平上相對豐度比較 進行物種注釋后,假手術(shù)組大鼠通過高通量測序總共檢測到了14個門166個屬的細菌,門水平相對豐度排在前4位的依次為：厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、放線菌門,它們構(gòu)成了約99%的序列。模型組、菌黃保腸合劑組及雙歧桿菌組大鼠均以厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、放線菌門為優(yōu)勢菌門,但各組組間主要菌門的相對豐度構(gòu)成比明顯不同。與假手術(shù)組比較,模型組擬桿菌門、變形桿菌門相對豐度明顯上調(diào),厚壁菌門、放線菌門相對豐度明顯下調(diào),比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明膿毒癥造模后腸道微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。與模型組比較,菌黃保腸合劑組厚壁菌門相對豐度明顯上調(diào),擬桿菌門、變形桿菌門相對豐度明顯下調(diào),雙歧桿菌組僅變形桿菌門相對豐度明顯下調(diào),比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與雙歧桿菌組比較,菌黃保腸合劑組擬桿菌門相對豐度明顯下調(diào),比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腸道細菌群落在門分類學(xué)水平上相對豐度比較

2.3 各組大鼠腸道微生態(tài)alpha多樣性分析 利用Chao1和PD_whole_tree指數(shù)評估alpha多樣性的參數(shù),鑒于alpha多樣性數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布,采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。結(jié)果顯示,各組組間Chao1和PD_whole_tree指數(shù)alpha多樣性差異明顯。與假手術(shù)組比較,模型組Chao1指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)均有下降,比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,菌黃保腸合劑組及雙歧桿菌組Chao1指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)上升,比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 )。菌黃保腸合劑組與雙歧桿菌組Chao1指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05 )。見表2。

表2 各組大鼠腸道微生態(tài)alpha多樣性分析 M(P25,P75)

2.4 各組大鼠腸道微生態(tài)beta多樣性分析 將去除嵌合體的序列標準化1800條,隨機抽樣處理,以Unweighted Unifrac距離進行RDP分類算法與Silva(version123 )數(shù)據(jù)庫比較,得到組間腸道菌群物種組成差異,采用PCoA展示各樣品差異性。結(jié)果顯示,假手術(shù)組、模型組、菌黃保腸合劑組及雙歧桿菌組大鼠腸道菌群差異通過PCoA分析進行歸類,假手術(shù)組與模型組在PCoA圖上均能各自聚類未發(fā)生重疊,說明2組大鼠的腸道菌群beta多樣性具有差異。而菌黃保腸合劑組和雙歧桿菌組的腸道菌群菌落分布距離部分重疊,說明菌黃保腸合劑組與雙歧桿菌組beta多樣性差異相對較小。見圖2。

圖2 各組大鼠腸道微生態(tài)beta多樣性分析

2.5 各組大鼠腸道菌群特定菌屬的差異分析 使用 LEfSe 軟件分析各組之間腸道菌群特定菌屬的差異。將LDA值(LDA)設(shè)為2.0,大于設(shè)定值的為具有統(tǒng)計學(xué)差異物種,尋找細菌可能存在的生物標志物差異。結(jié)果顯示,在屬水平分類上,假手術(shù)組中厚壁菌門下的Anaerostipes屬、Blautia屬和疣微菌門下阿克曼氏菌屬(Akkermansia)富集;模型組中變形桿菌門下的莫拉氏菌屬(Moraxella)、埃希氏菌屬(Escherichia),擬桿菌門下的Odoribacter屬,普雷沃氏菌 Ga6A1(Prevotellac-eae_Ga6A1_group )富集;菌黃保腸合劑組中厚壁菌門下的糞球菌屬(Coprococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus),毛螺菌科NK4A136(Lachnospiraceae_NK4A136_group),放線菌門下的放線菌屬(Actinomycetaceae)富集;雙歧桿菌組厚壁菌門下的乳桿菌屬(Lactobacillus)、羅斯伯里氏菌屬(Roseburia),放線菌門下的雙歧桿菌屬(Bifidobacterium),擬桿菌門下的副擬桿菌屬(Parabacteroides)富集。表明在菌屬水平上4組大鼠的腸道菌群特定菌屬具有差異。見圖3。

圖3 各組大鼠腸道菌群特定菌屬的差異分析

3 討論

膿毒癥的發(fā)病機制涉及感染、炎癥、免疫、凝血等一系列病理生理機制,建立具有膿毒癥相似病理生理機制和臨床特點的動物模型是開展相關(guān)研究的前提條件。CLP模型表現(xiàn)出與人類膿毒癥發(fā)病因素、病理生理機制以及臨床癥狀的相似特點：宿主對嚴重感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致血流動力學(xué)改變及全身器官功能障礙,而非細菌和內(nèi)毒素對機體的直接損傷[13-16]。傳統(tǒng)CLP模型具有較高的自然死亡率,動物模型48 h死亡率達到50～70%[17]。從膿毒癥模型制備到出現(xiàn)多器官功能障礙并由此引發(fā)腸道微生態(tài)改變需要一定時間,故本研究在傳統(tǒng)CLP模型基礎(chǔ)上加入壞死盲腸切除和廣譜抗生素抗感染等操作,以建立更符合人類臨床膿毒癥致腸道菌群微生態(tài)變化過程特點的實驗?zāi)Ｐ蚚18-20]。結(jié)果顯示,CLP術(shù)后12 h大鼠開始出現(xiàn)豎毛、活動減少、嗜睡、蜷縮、飲食減少等表現(xiàn),術(shù)后24 h再次開腹發(fā)現(xiàn)結(jié)扎端盲腸腫脹,表面顏色紫黑,被網(wǎng)膜包裹,周圍腸管表面充血等腹腔內(nèi)感染表現(xiàn),通過控制感染治療后,模型組存活時間延長,病死率下降,與相關(guān)文獻報道結(jié)果基本一致[21]。

腸道微生態(tài)由腸道、腸道上皮及黏液、腸內(nèi)容物質(zhì)以及腸道菌群構(gòu)成[22],是腸道菌群與其宿主相互作用的統(tǒng)一體。近年來越來越多的研究顯示,中醫(yī)藥與腸道微生態(tài)關(guān)系密切,兩者可互相影響,運用益氣健脾、滲濕利水等中藥干預(yù)后可增加腸道有益菌數(shù)量,抑制病原菌生長,維持腸道黏膜上皮完整,提高機體免疫并減輕炎性反應(yīng)[23-25]。本研究所采用的菌黃保腸合劑是在四君子湯基礎(chǔ)上根據(jù)大量臨床試驗研制的醫(yī)院特色制劑,該方由黃芪、太子參、茯苓、白術(shù)、酒炒黃連、薏苡仁、神曲、茵陳、石菖蒲等組成。方中黃芪溫補中土而強脾胃,行營氣而理脾胃,健中焦而不傷陰;太子參旨在補益脾胃之氣而斂陰生津,與黃芪配伍,二者均入脾、肺二經(jīng),健運中氣而益陰生津,共為君藥。白術(shù)為補脾胃之要藥,長于補氣而復(fù)健運,除濕并補中土;薏苡仁與茯苓共用,補脾健中,滲濕利水,可“利小便而實大便”。三者并列為臣藥,可使君藥補益脾胃之功得到進一步加強。黃連歸心、脾、胃經(jīng),本制劑用炒制,降低其寒性,可用于清中焦?jié)駸岫蛊⑽傅玫秸{(diào)和;茵陳善清脾胃濕熱;石菖蒲辛溫芳香,達醒脾胃、消氣滯、化濕濁之功。以上三者為伍,辛開苦降,祛除邪實,標本兼治,共為佐藥。神曲作為使藥,健脾開胃,可調(diào)理氣機而緩解食滯。諸藥配伍,可顧護脾胃,促進脾胃之氣恢復(fù),兼以祛除邪實,寒溫并施,標本兼治,使脾胃功能得到進一步加強。從現(xiàn)代藥理學(xué)的研究上看,該方不僅能夠增加人體免疫力[26-27],還兼具調(diào)節(jié)腸道菌群,促進胃腸功能恢復(fù)的作用[28-30]。

膿毒癥可改變腸道微生態(tài)環(huán)境,引起腸道菌群由共生模式向致病模式轉(zhuǎn)變,表現(xiàn)為腸道菌群多樣性降低,厚壁菌門和擬桿菌門細菌豐度降低,而艱難梭菌、葡萄球菌屬、埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬和腸球菌屬過度生長[31]。本研究觀察到膿毒癥大鼠模型中厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、放線菌門等主要菌群結(jié)構(gòu)比例改變,腸道菌群豐度和多樣性都有不同程度下降。進一步利用LEfSe法分析假手術(shù)組與模型組細菌的群落組成時,發(fā)現(xiàn)在屬的水平上,厚壁菌門Anaerostipes屬和Blautia屬、疣微菌門阿克曼氏菌屬等維持健康的菌屬在假手術(shù)組相對富集,而變形桿菌門莫拉氏菌屬、埃希氏菌屬、擬桿菌門Odoribacter屬等條件致病菌和致病菌在模型組增多,與既往文獻報告結(jié)果相同[32-33]。同時變形桿菌門作為細菌中最大的一個門,包括大腸桿菌、幽口螺桿菌、沙門氏菌等許多致病菌,正常人腸道內(nèi)不含或含有少量變形桿菌門細菌,而腸道中變形桿菌大量繁殖則反映腸道微生物群落結(jié)構(gòu)失穩(wěn)[34]。通過補充益生菌可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,促進腸黏膜的微生物屏障修復(fù),阻止致病菌的入侵從而減輕腸道炎癥[35]。本研究中將雙歧桿菌活菌膠囊作為陽性對照藥對菌黃保腸合劑進行的藥效學(xué)評價,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者對腸道菌群結(jié)構(gòu)、外生態(tài)多樣性影響作用相當,但菌群種屬富集方面存在差異,推測雙歧桿菌活菌膠囊作用機制為補充正常菌群,而菌黃保腸合劑從細菌與宿主雙方因素產(chǎn)生代謝、免疫、炎癥等多方面的作用機制選擇性刺激正常菌群生長繁殖[36-37]。另有研究發(fā)現(xiàn)益生菌雙歧桿菌能夠保護宿主抵御大腸桿菌感染,但只有能產(chǎn)生醋酸鹽的雙歧桿菌可發(fā)揮這種保護作用,表明在益生菌中細菌行使的功能遠重要過細菌所屬的種類[38]。因此,研究可進一步深入,明確中藥復(fù)方在維持膿毒癥腸道穩(wěn)態(tài)的靶點機制。

綜上所述,膿毒癥大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)改變,菌群多樣性下調(diào),條件致病菌菌群種類增加,腸道黏膜上皮損傷,是造成膿毒癥內(nèi)源性感染和細菌易位的重要機制,菌黃保腸合劑能夠上調(diào)有益菌相對豐度,抑制條件致病菌過度生長,減少機會性感染,具有調(diào)節(jié)膿毒癥大鼠腸道微生態(tài)的作用。