秦嶺華中五味子種實性狀變異與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)研究

張姜嵐，劉 宸，崔浪軍，強 毅，陳清敏，王高紅，郭 華

（1西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室/藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室/陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710119；2陜西省地質(zhì)調(diào)查院，西安 710054）

0 引言

木蘭科植物華中五味子(Schisandra sphenanthera)的干燥成熟果實在中藥領(lǐng)域被稱為南五味子，其作為一種集藥用、食用、觀賞為一體的林下木質(zhì)落葉藤本植物[1]，具有良好的市場開發(fā)潛力。隨著醫(yī)藥、保健新產(chǎn)品的研發(fā)[2-3]，市場對華中五味子的需求激增。陜西段秦嶺是華中五味子天然分布區(qū)之一，根據(jù)走訪調(diào)查，目前在陜西安康、漢中、寶雞等地已發(fā)展起規(guī)模化的華中五味子人工栽培基地。但人工栽培多采用就地取材、無性擴繁的方式，逐漸出現(xiàn)了品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低、病蟲害頻發(fā)等一系列問題[4]。因此，在人工栽培中加大有性繁殖的比例，是推動華中五味子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的當務(wù)之急，這就需要深入了解種源地華中五味子種實特性及表型變異規(guī)律。

針對華中五味子的研究主要集中在藥用價值、化學(xué)成分[3,5-8]的研究上，關(guān)于其種實特性等遺傳資源評價的研究相對較少。表型多樣性是遺傳與環(huán)境共同作用的結(jié)果，研究不同地理環(huán)境條件下的天然種群的表型性狀分化程度和變異規(guī)律，不僅可在一定程度上反映其遺傳變異水平，也可以有效揭示生物對不同環(huán)境的適應(yīng)，進而探究其發(fā)展演化[9]。種實性狀在物種自然演化過程中具有較高的遺傳穩(wěn)定性，不易受短期環(huán)境變化的影響[10]。同時，作為主要繁殖器官，種實性狀對物種的定居、繁衍及分布具有重要影響[11]。研究表明，果實形態(tài)、種子大小、質(zhì)量、種翅有無等都會影響其種子傳播媒介（風(fēng)、動物等）的傳播效率，進而影響物種的分布范圍[12]。

秦嶺是中國重要的氣候分水嶺，南北坡氣候差異顯著[13]。不少研究表明，地區(qū)海拔、年平均氣溫和經(jīng)緯度是影響種實表型性狀變異的主要因素[14-15]。華中五味子在秦嶺北坡（暖溫帶氣候）和南坡（北亞熱帶氣候）均有大量分布，分布區(qū)氣候條件迥異，進化上較為保守的種實性狀是否會在狹窄空間上產(chǎn)生相應(yīng)變異有待研究。筆者對秦嶺南、北坡分布的5 個種群開展種實性狀分析，旨在揭示華中五味子種實性狀在秦嶺不同氣候帶上的表型分化和變異規(guī)律，并探究其與生境的關(guān)系，從而增加華中五味子生態(tài)種植的理論積累和技術(shù)儲備，為藥用植物的種質(zhì)資源保護、引種繁育和栽培管理提供清晰的生態(tài)學(xué)背景，促進秦嶺地區(qū)林藥一體化產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域與樣地概況

秦嶺地處中國中部，是國內(nèi)12個關(guān)鍵生態(tài)功能區(qū)之一。秦嶺山區(qū)水熱條件優(yōu)越，地形變化復(fù)雜，相對海拔高差較大，植物種類豐富，森林群落類型多樣，垂直分布明顯。主要森林群落有低山落葉闊葉混交林、中山針闊混交林和亞高山針葉林。20 世紀七八十年代林區(qū)經(jīng)歷了大面積的人為采伐，現(xiàn)有的森林絕大部分為天然更新的次生林[16-17]。秦嶺北坡屬于暖溫帶半濕潤氣候，廣泛分布暖溫帶落葉闊葉林。秦嶺南坡水熱條較好，氣候隨海拔變化多樣，土壤類型較多，年降水量依海拔不同在830～970 mm，其南坡海拔800～1000 m等高線，是中國北亞熱帶常綠落葉闊葉混交林與暖溫帶落葉闊葉混交林的生態(tài)交錯區(qū)[18-19]。

本研究華中五味子種子樣品采集樣地分別位于秦嶺北坡寶雞市太白縣（暖溫帶）、秦嶺南坡中段商洛市柞水縣（暖溫帶-北亞熱帶過渡區(qū)）、漢中市寧強縣（北亞熱帶），樣地概況見表1。華中五味子果實樣品采集樣地分別位于秦嶺北坡陜西省寶雞市太白縣（暖溫帶）、秦嶺南坡中段陜西省商洛市柞水縣、鎮(zhèn)安縣、山陽縣（暖溫帶-北亞熱帶過渡區(qū)），陜西省漢中市留壩縣、略陽縣（北亞熱帶），陜西省安康市石泉縣、漢陰縣、嵐皋縣（北亞熱帶），樣地概況見表2。實驗于2020 年8月—2021年4月在陜西師范大學(xué)長安校區(qū)進行。

表1 種子樣品采集樣地概況

表2 果實樣品采集樣地概況

1.2 數(shù)據(jù)采集

1.2.1 種子及果實獲取方式 種子獲取方式參考文獻[20]，采用水浮法。在華中五味子成熟期取當?shù)爻墒烊A中五味子果實，每個樣地采集果串至少30串帶回實驗室進行后續(xù)數(shù)據(jù)采集及分析。

1.2.2 實驗儀器與設(shè)備 實驗中使用到實驗儀器有掃描儀(EPSON Expression 12000XLJ3318)、烘箱（上海一橫科學(xué)儀器DHG-9430A）、電子天平（sartorious）、超高效液相色譜儀（UPLC）（島津SPD-20A）、直尺（得力）、游標卡尺（上海滬工）。

1.2.3 數(shù)據(jù)采集方法

（1）種子數(shù)據(jù)采集方法。

①種子表觀數(shù)據(jù)采集方法。收集到的5份種子樣品，每份選取干燥、顆粒飽滿的種子至少500 顆，分開擺放，使其沒有接觸或重疊，使用掃描儀掃描，并通過Winseedle 2019HR 對圖片進行分析，得到每粒種子的長度、寬度、長寬比以及投影面積的數(shù)據(jù)。

②種子千粒重測量方法。從純凈種子中隨機取1000 粒，用1/1000 電子天平稱重，每組樣品不重復(fù)取樣，稱重5次得到種子的千粒重數(shù)據(jù)。

③種子含水量測量方法。種子含水量的測定參考孫茂[21]的方法，采用高溫烘干法。

④種子活力測定方法。參考使用TTC 染色法[22-23]。將種子用30℃水浸泡48 h后，取出種子剝掉種皮用1500 mg/L 的TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑）溶液30℃進行避光燃染色處理24 h后，取出種子，用清水將種子沖洗2～3 次，觀察種胚被染色的程度和染色部位，判斷五味子種子生活力強弱。種胚全部或大部分被染成紅色的即為具有較強生活力的種子，種胚不被染色的為具有較弱生活力的種子或者死種子。

每組樣品每100粒進行不重復(fù)5次統(tǒng)計，測算種子活力值[式(1)]。

⑤種子萌發(fā)率測定方法。種子萌發(fā)率測定參考劉芳[24]的方法，將沙藏后的種子挑選狀態(tài)良好種子于2021年4月下旬隨機取100粒種子置于濕潤濾紙上進行后續(xù)培養(yǎng)，以種子有胚芽長出為萌發(fā)，截至5 月底。每組樣品進行不重復(fù)5次統(tǒng)計，測算萌發(fā)率。

（2）果實數(shù)據(jù)采集方法。

①表觀數(shù)據(jù)采集方法。對采集到的12 份果實樣品每種樣品隨機取30 串用直尺和游標卡尺測量其果串總長度、果柄長度、果串直徑，使用電子天平測量果串總重及果實凈重，并統(tǒng)計果實個數(shù)。測量完的果實用于多糖和木脂素成分分析。

②多糖數(shù)據(jù)采集方法。多糖含量測定參考李寶巖[25]的方法。

③木脂素數(shù)據(jù)采集方法。UPLC色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 Column(100?，1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫（洗脫比例0～5 min，50%～55%A；5～8 min，55%～63%A；8～9 min，63%～63%A；9～10 min，63%～80%A；10～12 min，80%～80%A；12～13 min，80%～50%A；13～15 min 50%～50%A）；流速0.3 mL/min；柱溫40℃；檢測波長220 nm；進樣體積10 μL；運行時間15 min。

對照品溶液制備方法。分別精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、戈米辛J、五味子酚對照品適量于10 mL 量瓶中，用甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，配制成含五味子醇甲0.18 mg/mL、五味子醇乙0.28 mg/mL、五味子酯甲0.17 mg/mL、五味子酯乙0.38 mg/mL、五味子甲素0.25 mg/mL、五味子乙素0.17 mg/mL、五味子丙素0.1 mg/mL、戈米辛J0.26mg/mL、五味子酚0.22 mg/mL的混合對照品儲備溶液。

供試品溶液制備方法。取南五味子粉末約0.15 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入甲醇25 mL，稱定，超聲處理30 min，取出，放冷至室溫，加甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得樣品檢測溶液。每組樣品進行6 次重復(fù)實驗，計算木脂素含量。

（3）環(huán)境數(shù)據(jù)采集方法。環(huán)境數(shù)據(jù)由Watchdog氣象定位站和國家氣象科學(xué)數(shù)據(jù)中心提供。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法 使用Excel、IBM SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 8.0.2作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子性狀

種子投影面積、單粒種子長度以及單粒種子寬度表示了種子的大小，不同生長地的種子大小有較大差異（圖1A～C）。單粒種子長/寬則表示了種子形狀，不同生長地的種子形狀無較大差異（圖1D）。種子千粒重是體現(xiàn)種子大小與飽滿程度的重要指標，不同產(chǎn)地種子千粒重有較大差異（圖1E），Z1與Z3表現(xiàn)最佳，Z2與Z5 表現(xiàn)最差。Z2、Z5 千粒重較低的種子相應(yīng)的含水率與干重也低（圖1F～G），質(zhì)量也較差。5個樣品種子活力值無較大差異（圖1H），而種子萌發(fā)率有較大差異性（圖1I），表現(xiàn)為Z3最佳、Z5最差。

圖1 華中五味子種子性狀差異

表型變異系數(shù)越大，則性狀值離散程度越大，表型多樣性越大[26]。如表3所示，5個種源地種子相對含水率的變異系數(shù)最大為48.70%，其次為種子萌發(fā)率為37.98%；種子長寬比變異系數(shù)最小為0.93%，表明種子形狀并沒有隨環(huán)境變化產(chǎn)生較大變化。

表3 華中五味子種子性狀變異系數(shù)

如表4 所示，華中五味子種子性狀相關(guān)性主要表現(xiàn)在種子大小相關(guān)的指標即種子投影面積、長度、寬度、長寬比，指標之間表現(xiàn)為顯著正相關(guān)；種子含水率與種子長寬比顯著正相關(guān)，其他指標之間不表現(xiàn)顯著相關(guān)性。

表4 華中五味子種子性狀相關(guān)性

2.2 果實性狀

對所采集到的12個果實樣品的果串長度、果串直徑、果串質(zhì)量、果實凈重、果實粒數(shù)和果柄長度以及華中五味子多糖和木脂素含量共8個參數(shù)的組間差異進行分析，分析結(jié)果如表5所示。所收集到12個產(chǎn)地的華中五味子各性狀均有顯著性差異，其中果串長度以及果串質(zhì)量較其他指標有較明顯差異，果實中多糖含量以及五味子酯甲含量有極大的差異性，表明五味子果實性狀隨生長環(huán)境產(chǎn)生較大差異。果實凈重/果串質(zhì)量表示華中五味子果實采收后可用成分的含量，G1（寶雞市太白縣）、G2（商洛市柞水縣營盤鎮(zhèn)）的果實凈重/果串質(zhì)量較高，其次為G3（漢中市留壩縣）、G5（商洛市柞水縣杏坪縣）以及G6（商洛市鎮(zhèn)安縣）。G4（商洛市柞水縣下梁鎮(zhèn)）、G9（安康市石泉縣）、G10（安康市漢陰縣）、G1（寶雞市太白縣）有較高的多糖含量。

表5 華中五味子果實性狀差異

UPLC 所測南五味子木脂素色譜圖如圖2 所示?！吨腥A人民共和國藥典》（2020 版）對于南五味子有效成分規(guī)定含五味子酯甲不得少于0.20%，如表5 所示，不同產(chǎn)地華中五味子酯甲含量僅有G4（商洛市柞水縣下梁鎮(zhèn)）、G5（商洛市柞水縣杏坪鎮(zhèn)）、G6（商洛市鎮(zhèn)安縣）、G7（商洛市山陽縣）、G8（漢中市略陽縣）、G12（云南省維西傈僳自治州）樣品符合藥典標準，其余6個樣品五味子酯甲含量不達標，其中以G4樣品的五味子酯甲含量最高，同時如圖3所示，G5（商洛市柞水縣杏坪鎮(zhèn)）、G12（云南省維西傈僳自治州）五味子果實木脂素總含量較少。將五味子酯甲含量與五味子木脂素含量進行相關(guān)性分析，兩者相關(guān)性達到0.973（極顯著相關(guān)），五味子酯甲在五味子木脂素中占有極大的比例。商洛市柞水縣、鎮(zhèn)安縣、山陽縣以及漢中市略陽縣所產(chǎn)華中五味子有較高品質(zhì)。

圖2 對照品和南五味子樣品UPLC圖

圖3 華中五味子果實木脂素相對含量

如表6所示，在所測量9種指標中，12個果實來源地果實酯甲含量的變異系數(shù)最大為100.33%，其次為果實多糖含量，表明果實內(nèi)含物含量隨環(huán)境變化產(chǎn)生明顯變化；果實凈重/果串質(zhì)量的變異系數(shù)最小為3.41%，其次為果串直徑為9.21%，表示華中五味子在生長過程中對果實與果柄的能量分配較為固定，果串的直徑較為穩(wěn)定，受環(huán)境影響較小。

表6 華中五味子果實性狀變異系數(shù)

如表7所示，華中五味子果實性狀相關(guān)性表現(xiàn)為果實果串直徑與果實果串質(zhì)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系；果實凈重與果實直徑呈顯著正相關(guān)，與果串質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)，表示質(zhì)量越高、直徑越高的果串果實更多。每串果實的果實數(shù)量與果串直徑以及果實凈重呈顯著正相關(guān)，與果串質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)。果實酯甲含量與果串長度、果串質(zhì)量以及果實凈重呈顯著負相關(guān)，果實總木脂素含量同樣與果串質(zhì)量和果實質(zhì)量呈顯著負相關(guān)。

表7 華中五味子果實性狀相關(guān)性

2.3 種實性狀和環(huán)境因子的相關(guān)性分析

如表8 所示，種子活力值與海拔呈顯著正相關(guān)關(guān)系，種子萌發(fā)率與地位緯度呈顯著正相關(guān)，與年均降水量呈極顯著負相關(guān)關(guān)系。

表8 華中五味子種子與環(huán)境因子的相關(guān)性

如表9所示，果實直徑與海拔呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與年均溫呈顯著負相關(guān)關(guān)系；果實木脂素含量與海拔呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與緯度和年均溫呈顯著負相關(guān)關(guān)系。

表9 華中五味子果實與環(huán)境因子的相關(guān)性

3 討論

不同產(chǎn)地華中五味子種子長寬比無明顯差異，是植物對環(huán)境長期適應(yīng)、相對穩(wěn)定的指標[27]；種子長寬、投影面積所代表的種子大小的表型性狀差異明顯，在秦嶺南北兩側(cè)變異豐富；種子千粒重、種子含水率以及種子干重是種子飽滿程度的重要指標[28]，隨環(huán)境均產(chǎn)生較大變異；種子萌發(fā)率有較大差異，但與種子大小無相關(guān)性，與前人研究結(jié)果一致[29]。說明華中五味子種源間存在明顯的形態(tài)變異，形態(tài)變異是遺傳變異的重要組成部分，形態(tài)變異越大，存在的遺傳變異可能越大[30]，華中五味子具有優(yōu)良種源的選擇潛力。

對華中五味子果實進行分析表明，12個產(chǎn)地的華中五味子果實均有較大的變異性，表現(xiàn)為商洛市柞水縣與云南傈僳自治縣所產(chǎn)果實變異性最大。五味子酯甲含量是果實在12 個產(chǎn)地變異最大的指標，《中華人民共和國藥典》（2020 版）[31]規(guī)定南五味子有效成分中五味子酯甲不得少于0.20%，本次實驗中有6個產(chǎn)地華中五味子果實符合藥典標準，其中主要產(chǎn)地為商洛市。五味子酯甲含量與五味子木脂素總量相關(guān)性達極顯著相關(guān)性，表示五味子酯甲是五味子木脂素的主要組成部分，根據(jù)與環(huán)境因子相關(guān)性分析，五味子木脂素含量與地區(qū)海拔、緯度和年均溫呈顯著相關(guān)性。

表型多樣性是遺傳多樣性的基礎(chǔ)[15]，同一物種在不同居群間發(fā)生的變異可以反映出該物種對不同環(huán)境的適應(yīng)能力，物種的變異程度也表明其適應(yīng)不同生境的廣泛程度，通常變異程度較大的物種，其適應(yīng)的生境也越廣[32]。研究表明，華中五味子果實凈重/果串質(zhì)量無較大差異，說明不同生長地的華中五味子果實能量分配較穩(wěn)定，而果串長度、果串質(zhì)量、果實凈重以及果實粒數(shù)有較大差異，尤其表現(xiàn)在寶雞市（秦嶺北坡）所產(chǎn)果實與商洛市、安康市、漢中市（秦嶺南坡）所產(chǎn)果實存在差異，表示秦嶺南北兩側(cè)華中五味子生長有較大差異。

4 結(jié)論

根據(jù)對華中五味子種子與果實進行分析，秦嶺南北兩側(cè)華中五味子有較大變異性，主要體現(xiàn)在華中五味子種子的大小、千粒重、含水率、萌發(fā)率，以及華中五味子果實果串長度、果串質(zhì)量、果實質(zhì)量、多糖含量、五味子酯甲含量。華中五味子性狀與環(huán)境因子相關(guān)性分析表明，種子、果實的性狀與一部分環(huán)境因子之間呈顯著相關(guān)性，說明華中五味子隨環(huán)境產(chǎn)生表型多樣性。表型多樣性是遺傳多樣性與環(huán)境異質(zhì)性的綜合體現(xiàn)，表型變異中隱藏著遺傳變異，對華中五味子遺傳特性以及生理生化特性還值得進一步探討。