偏穗鵝觀草RT-PCR內(nèi)參基因篩選及驗證

張寶蓉， 解繼紅， 金丹青， 汪軍成， 姚立蓉，司二靜， 尚勛武， 王化俊， 李葆春*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省干旱生境作物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730070； 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，呼和浩特 010010； 4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，蘭州 730070）

偏穗鵝觀草（Roegneria komaroviiNevski）為小麥族（Triticeae）鵝觀草屬(Roegneria)植物，為小麥近緣種，是小麥的三級基因源，其優(yōu)異的基因可拓寬小麥遺傳基礎(chǔ)，提高小麥抗病、抗逆等特性[1]。羅粵川等[2]對31份鵝觀草種質(zhì)資源進(jìn)行田間抗赤霉病鑒定，發(fā)現(xiàn)鵝觀草抗侵入性中等、抗擴(kuò)展性優(yōu)異、體抗性表現(xiàn)良好。周永紅等[3]對鵝觀草、大麥以及其屬間雜種進(jìn)行了赤霉病抗性鑒定，表明鵝觀草的抗赤霉病基因在雜種中得到部分表達(dá)，可將鵝觀草抗赤霉病種質(zhì)用于麥類作物育種中。陳景芋等[4]利用不同水平NaCl溶液對偏穗鵝觀草、大芒鵝觀草、肅草進(jìn)行脅迫處理7 d,綜合分析各項生物學(xué)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)偏穗鵝觀草耐鹽性最好，由此表明偏穗鵝觀草中含有耐鹽基因。萬永芳等[5]用單花和多花注射接種法對小麥近緣野生植物16個屬80個種276份材料進(jìn)行了抗赤霉病鑒定和分析，結(jié)果表明鵝觀草屬既高抗侵入又高抗擴(kuò)展,進(jìn)一步為挖掘小麥抗病性基因提供理論支撐。趙富強等[6]對來自國內(nèi)外的34份鵝觀草種質(zhì)資源條銹病及白粉病抗病性進(jìn)行了鑒定和評價，發(fā)現(xiàn)鵝觀草屬種質(zhì)資源抗病能力存在多樣性，篩選出6份高抗條銹病資源、12份高抗白粉病資源及2份(ZY 1007和Pr 87-88344)兼抗條銹病和白粉病資源，為合理利用抗病材料及抗病育種提供資料。馬玉寶等[7]搜集386份野生鵝觀草屬材料在四川、云南、甘肅及內(nèi)蒙古等地區(qū)進(jìn)行適應(yīng)性評價，發(fā)現(xiàn)鵝觀草屬抗逆性強，適應(yīng)性范圍廣。

研究功能基因的表達(dá)模式最常用的方法為實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR），該方法需要選用表達(dá)穩(wěn)定的參考基因進(jìn)行校準(zhǔn)，這些基因被稱為內(nèi)參基因。理想的內(nèi)參基因在植物不同生長發(fā)育階段、不同器官中均能穩(wěn)定表達(dá)，不受環(huán)境影響[8]。常見內(nèi)參基因在所有細(xì)胞中均能穩(wěn)定表達(dá)，通常選用基因組中的管家基因（housekeeping gene），包括肌動蛋白、微管蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等基因。

內(nèi)參基因在不同物種間沒有絕對的通用性，不同物種間同源內(nèi)參基因的穩(wěn)定性不同，同一物種中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性也是相對的，不同的內(nèi)參基因在不同條件下的表達(dá)通常不是恒定不變的，研究者必需結(jié)合各自的試驗條件和樣品類型來選擇合適的內(nèi)參基因[9]，否則會導(dǎo)致試驗數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差，影響目的基因表達(dá)水平的分析。為保障基因表達(dá)分析結(jié)果的可靠性，篩選偏穗鵝觀草適宜的內(nèi)參基因，對于其抗逆性基因篩選及在小麥中的應(yīng)用等研究具有重要意義。本研究選取小麥中8個常用候選內(nèi)參基因[10]，驗證候選內(nèi)參基因在偏穗鵝觀草根、莖、葉等不同器官及不同脅迫處理環(huán)境下的表達(dá)，并借助geNorm、BestKeeper軟件對這些內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行評價，以期篩選最佳內(nèi)參基因，為后續(xù)偏穗鵝觀草基因表達(dá)、功能及調(diào)控等相關(guān)研究提供參考，對進(jìn)一步研究小麥三級資源庫材料具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料中國春、偏穗鵝觀草由甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新實驗室提供，種植于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)玻璃溫室，采用栗鈣土與蛭石（質(zhì)量比3∶1）混合土培方式，分別播種在口徑23 cm、高15 cm塑料花盆中。分別采取供試材料各處理組的根、莖、葉樣品，液氮速凍后轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱保存。

1.2 植物基因組DNA提取

參照Rogers等[11]方法提取提取中國春及偏穗鵝觀草DNA。利用Nanophoto meter Pearl微量紫外分光光度計（德國）測定DNA樣品230、260及280 nm的光吸收值，確定純度及含量。

1.3 植物總RNA提取及cDNA第1條鏈合成

采用Trizol試劑盒 (TIANGEN,北京)植物總RNA提取試劑盒提取偏穗鵝觀草不同處理的不同器官（根、莖、葉）RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳及Nanophoto meter pearl微量紫外分光光度計測定RNA樣品230、260及280 nm的光吸收值，檢測其含量及純度。參照天根公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit(with gDNase)說明書合成 cDNA第1條鏈，保存于-20 ℃冰箱中。

1.4 候選內(nèi)參基因選擇及引物設(shè)計

選取肌動蛋白(Actin1、Actin2、Actin3)、微管蛋白(Beta-Tubulin，BTUB)、親環(huán)素(Cyclophilin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate，GAPDH)、組蛋白(Histone H3)、延伸因子(elongation factor-1-alpha-subunit，EF1α1)的編碼基因，運用NCBI獲得候選內(nèi)參基因序列并根據(jù)編碼序列（coding sequence，CDS）保守區(qū)段設(shè)計引物(表1)。

1.5 候選內(nèi)參基因引物特異性分析

用內(nèi)參基因引物，以偏穗鵝觀草各樣DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系:DNA模板1 μg；上下游引物各1 μL（10 μmol·L-1）；2×TaqPCR Master Mix 25 μL，加水至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。通過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測引物的特異性及產(chǎn)物大小。

1.6 序列分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收，并由北京擎科生物有限公司完成測序。將測序所得結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫并用MEGA6和DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸比對。

1.7 內(nèi)參基因的qRT-PCR分析

qRT-PCR擴(kuò)增采用天根SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒，反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板1 μL；上下游引物各0.6 μL；2×SuperReal PreMix Puls (SYBR Green) 10 μL; 50×ROX Reference Dye 0.4 μL; RNase-Free ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)程序： 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 10 s，60 ℃32 s, 40個循環(huán)； 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min; 95 ℃15 s。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

分別以根、莖、葉不同器官及鹽處理RNA為模板進(jìn)行qRT-PCR得到的Ct值，利用geNorm及BestKeeper軟件進(jìn)行候選基因的表達(dá)豐度分析及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性分析

以偏穗鵝觀草葉片為材料提取的總RNA經(jīng)Nano photo檢測OD260/280均在1.8～2.13之間，說明總RNA純度較好。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，所有樣品28S及18S條帶完整清晰(圖1A)，說明總RNA完整性較好，達(dá)到后續(xù)試驗要求。以偏穗鵝觀草及中國春葉片樣品DNA為模板，利用8個特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，8個候選內(nèi)參基因在偏穗鵝觀草（圖1B）及中國春（圖1C）中均擴(kuò)增出目的條帶，并且擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小符合預(yù)期，引物特異性良好，可對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

圖1 RNA監(jiān)測及候選基因擴(kuò)增Fig.1 RNA detection and candidate gene amplification

2.2 候選基因測序結(jié)果分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果如圖2所示，偏穗鵝觀草候選內(nèi)參基因和小麥、大麥、蒙古冰草、粗山羊草、二粒小麥、大麥草等相似性在82%～96%，同屬小麥族物種，內(nèi)參基因具有一定的保守性。

圖2 偏穗鵝觀草部分候選內(nèi)參基因序列對比Fig.2 Comparison of the sequence of some candidate internal reference genes

應(yīng)用DNAMAN軟件中對偏穗鵝觀草與中國春內(nèi)參基因序列進(jìn)行相似性比對，各候選內(nèi)參基因出現(xiàn)多個位點單堿基突變（single nucleotide polymorphism，SNP）。

2.3 候選內(nèi)參基因表達(dá)豐度分析

分別以不同組織及處理的偏穗鵝觀草cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR分析。8個候選內(nèi)參基因在偏穗鵝觀草不同器官中Ct值介于20.87～32.70之間(表2)。由于Ct值越大，其表達(dá)豐度越小，Actin1、BTUB、Actin2、Actin3、Histone H3的Ct值均大于25，表明其在偏穗鵝觀草中根、莖、葉器官中表達(dá)豐度小，Cyclophilin、EF1a1及GAPDH在根、莖、葉中的Ct均小于25，表明其在偏穗鵝觀草中根、莖、葉器官中表達(dá)豐度較大，優(yōu)先考慮這3個基因作為內(nèi)參基因。

表2 8個候選內(nèi)參基因在偏穗鵝觀草不同器官中的Ct值范圍Table 2 Range of Ct values of 8 candidate internal reference genes in different organs of Roegneria komarovii

2.4 偏穗鵝觀草候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.4.1 geNorm 分析 geNorm 軟件是Vandesompele等[12]編寫的專門用于qRT-PCR中篩選內(nèi)參基因及確定最適內(nèi)參基因數(shù)目的程序，其利用各內(nèi)參基因Ct值換算成Q值進(jìn)行分析，依據(jù)計算的每個基因表達(dá)穩(wěn)定性（M值）來篩選出穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因。M值與內(nèi)參基因穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，且geNorm默認(rèn)值為1.5，M＜1.5時認(rèn)為是理想內(nèi)參；M值＞1.5時則認(rèn)為極其不穩(wěn)定且不應(yīng)作為內(nèi)參基因。因此判定標(biāo)準(zhǔn)為M值越小穩(wěn)定性越好，反之，則穩(wěn)定性越差。geNorm軟件分析結(jié)果顯示，在CK組中8個內(nèi)參基因的M值均小于1.5，說明這些候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性好，表達(dá)穩(wěn)定性由高到低排序依次為EF1a1=GAPDH＞Cyclophilin＞Actin3＞Actin2＞Actin1＞BTUB＞HistoneH3;同上，在鹽處理組中：GAPDH=Histone H3＞Cycliophilin＞Actin3＞EF1a1＞Actin1＞Actin2＞BTUB; 在干旱組中：GAPDH=Actin2＞EF1a1＞Actin3＞Actin1＞BTUB＞Histone H3;在高溫組中：EF1a1=Cycliophilin＞Actin3＞GAPDH＞Actin2＞HistoneH3＞Actin1＞BTUB(圖3)。

圖3 geNorm分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性Fig.3 Analysis of the expression stability of candidate reference genes by geNorm

geNorm軟件可以通過配對差異系數(shù)(Vn/n+1)確定最適內(nèi)參基因數(shù)目，軟件默認(rèn)Vn/n+1閾值為0.15，閾值小于0.15時，最適內(nèi)參基因個數(shù)為n個，大于0.15時，最適內(nèi)參基因個數(shù)為n+1個。在此試驗中對候選內(nèi)參基因的配對差異值分析發(fā)現(xiàn)(圖4)，CK組、鹽處理組及高溫組中，V2/3分別為0.101、0.084、0.147，均小于0.15,說明最適內(nèi)參基因個數(shù)為2個；干旱處理組中，V3/4為0.114,說明最適內(nèi)參個數(shù)為3個。

圖4 geNorm分析確定候選內(nèi)參基因數(shù)目Fig.4 Determined the optimal number of candidate reference genes by geNorm

2.4.2 BestKeeper分析 BestKeeper是由Pfaffl等[13]編寫的針對內(nèi)參基因和目標(biāo)基因表達(dá)量分析的程序，計算比較基因的CV值和s值來評價內(nèi)參基因穩(wěn)定穩(wěn)定性，CV和s越小，說明該內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好；若s＞1則說明該內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定。BestKeeper軟件分析結(jié)果（表3）顯示，8個內(nèi)參基因s值均小于1，說明8個候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性較好；CK組中穩(wěn)定性由高到低排序為GAPDH＞EF1a1＞Actin3＞Cyclophilin＞Actin1＞Actin2＞Histone H3＞BTUB;鹽處理組中，EF1a1＞Actin3＞Cyclophilin＞GAPDH＞HistoneH3＞Actin1＞Actin2＞BTUB;干旱處理組中Cyclophilin＞GAPDH＞Actin3＞Actin1＞Actin2＞EF1a1＞HistoneH3＞BTUB;高溫處理組中Actin3＞Histone H3＞EF1a1＞cyclophilin＞GAPDH＞Actin1＞Actin2＞BTUB。

表3 BestKeeper分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性排名Table 3 Expression stability values of candidate reference genes determined through BestKeeper

2.4.3 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性驗證

鹽、干旱等非生物脅迫可迅速激活植物SnRK2家族蛋白激酶[14]，為驗證篩選的內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性，用綜合穩(wěn)定性排名高的Cyclophilin為參照分別對不同處理偏穗鵝觀草的SnRK2的表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，以Cyclophilin為參照，SnRK2在偏穗鵝觀草不同非生物脅迫處理中上調(diào)表達(dá)(圖5)。

圖5 Cyclophilin分析偏穗鵝觀草不同非生物脅迫處理中SnRK2表達(dá)水平Fig.5 Expression level of SnRK2 in Roegneria komarovii under different abiotic stress treatments using Cyclophilin

3 討論

qRT-PCR是目前研究基因表達(dá)應(yīng)用最為普遍的技術(shù)，但其準(zhǔn)確性受到樣品起始RNA的質(zhì)量和含量、cDNA 合成效率以及PCR擴(kuò)增效率等多因素的影響[15]，常規(guī)qRT-PCR采用相對定量進(jìn)行分析,選擇合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化至關(guān)重要。理想的內(nèi)參基因表達(dá)水平在不同組織、不同生理與環(huán)境條件下保持穩(wěn)定不變[16]，但已有研究表明，生物體內(nèi)并沒有真正的、完全穩(wěn)定的內(nèi)參基因，大多數(shù)傳統(tǒng)內(nèi)參基因已不能滿足qRT-PCR準(zhǔn)確定量的要求[17]。齊香玉等[18]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參基因的表達(dá)差異不僅僅存在于不同物種間，即使同一物種，由于組織、生長階段和環(huán)境等不同，內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性也存在差異。某種植物中較為理想的內(nèi)參基因并不一定適合在其他植物中使用。本文基于8個表達(dá)較穩(wěn)定的小麥內(nèi)參基因篩選偏穗鵝觀草的同源內(nèi)參基因也出現(xiàn)了相似的結(jié)果。因此，為獲得準(zhǔn)確的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，在進(jìn)行研究試驗之前，篩選出試驗條件下特異性的內(nèi)參基因，控制和減少實驗誤差對獲得準(zhǔn)確的基因表達(dá)結(jié)果至關(guān)重要[19-20]。

目前，篩選內(nèi)參基因常采用的軟件有g(shù)eNorm、NormFinder及BestKeeper，已用于馬鈴薯[21]、小麥[8]、大豆[22]等候選基因的穩(wěn)定性評估，并確定了不同條件下的內(nèi)參基因。本文通過geNorm及BesteKeeper軟件對偏穗鵝觀草不同器官及鹽脅迫條件下進(jìn)行內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評估。geNorm軟件分析原理是將RT-qPCR所得到的Ct值轉(zhuǎn)為基因的相對表達(dá)量Q值，篩選出試驗樣品中任意數(shù)量的內(nèi)參基因，通過該程序分析可以篩選出合適內(nèi)參基因以及確定最適內(nèi)參基因數(shù)目，而BestKeeper軟件直接以Ct值作為分析數(shù)值，計算出標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)來評價內(nèi)參基因穩(wěn)定性，CV和SD越小，說明該內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好，其優(yōu)勢在于可比較多個樣品中內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的表達(dá)水平，2個軟件最終都可以獲得較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因[23]。本研究結(jié)果顯示，Actin1、Actin2、Actin3、HistoneH3在偏穗鵝觀草中表達(dá)豐度較低，不適宜作為偏穗鵝觀草的內(nèi)參基因，EF1a1、GAPDH、Cyclophilin在偏穗鵝觀草中表達(dá)豐度相對較高。在CK組中EF1a1、GAPDH、Cyclophilin在2個軟件分析中穩(wěn)定性較好，表達(dá)豐富高，優(yōu)先考慮其作為偏穗鵝觀草的候選內(nèi)參基因；在鹽處理組中Cyclophilin、GAPDH及EF1a1穩(wěn)定性出現(xiàn)差異，該現(xiàn)象在鳳丹、Citrus reticulata[24]的內(nèi)參基因篩選中也有報道，可能與計算機(jī)內(nèi)置統(tǒng)計學(xué)算法不同有關(guān)，但Cyclophilin比其他的穩(wěn)定性較為理想；在干旱處理組中Cyclophilin、GAPDH穩(wěn)定性較好；在高溫處理組中，EF1a1、Cyclophilin穩(wěn)定性較好。試驗結(jié)果表明，根據(jù)不同的試驗條件可以選擇合適的內(nèi)參基因，Cyclophilin基因為偏穗鵝觀草最佳內(nèi)參基因，試驗結(jié)果為其他后續(xù)基因表達(dá)、功能及調(diào)控等相關(guān)研究供參考。