普羅布考對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的影響及其機制

李棟 安毅

(1 青島大學附屬醫(yī)院心內科,山東 青島 266003; 2 臨沂市人民醫(yī)院急診內科)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是由多種因素參與的動脈血管的慢性炎癥性疾?。?］。巨噬細胞在AS發(fā)生、發(fā)展和轉歸中發(fā)揮重要作用。斑塊中的巨噬細胞可根據(jù)局部微環(huán)境的變化呈現(xiàn)不同的表型,其中M1型巨噬細胞分泌促炎因子,加速斑塊進展,并使斑塊不穩(wěn)定性增高;M2型巨噬細胞分泌抗炎因子,可抑制AS進展［2］。因此,如何抑制巨噬細胞M1極化或促進巨噬細胞M2極化,對于減輕斑塊炎癥反應、促進斑塊穩(wěn)定意義重大。

普羅布考具有抗氧化和調血脂的作用,臨床上主要用于高脂血癥和AS治療［3］。另外普羅布考還具有減輕同型半胱氨酸引起氧化應激和炎癥反應、抑制血管彈性纖維降解、抑制白細胞黏附、抑制樹突狀細胞活化以及改善內皮功能等作用［4-8］。但普羅布考能否調控動脈中巨噬細胞極化尚無研究報道。本研究通過構建AS小鼠模型和體外細胞實驗,旨在揭示普羅布考對AS進展的影響,并從巨噬細胞極化角度探討普羅布考影響AS進展的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級健康雄性ApoE-/-小鼠20只,8周齡,品系背景為C57BL/6J,健康雄性C57BL/6J小鼠10只,8周齡,均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,均于恒溫恒濕及晝夜交替環(huán)境中飼養(yǎng)。普羅布考購自美國Sigma公司,ELISA試劑盒購自美國RD公司,一抗α-SMA、CD86購自美國CST公司,MOMA-2購自美國Bio-Rad公司,iNOS、IL-1β購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組與處理 20只ApoE-/-小鼠隨機分為對照組和普羅布考組,每組10只。兩組小鼠均以高脂飼料喂養(yǎng)12周后,普羅布考組小鼠隔日1次灌胃普羅布考(30 mg/kg),對照組隔日1次灌胃等劑量的生理鹽水,均灌胃12周。

1.2.2兩組小鼠各項指標檢測 灌胃12周后,腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉兩組小鼠,心尖取血,離心以后采用全自動生化檢測儀檢測血清中三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、肌酐(CRE)、尿素(UREA)、尿酸(UA)含量及丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)的水平,采用ELISA法檢測血清中炎性因子白細胞介素1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平,檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。頸椎脫臼法處死小鼠后開胸取主動脈血管(包括主動脈弓及分支部分),置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定。隨機取每組5只小鼠的主動脈血管,進行油紅O染色,檢測斑塊面積,計算斑塊面積占血管壁總面積百分比。取每組另外5只小鼠的動脈血管,OCT包埋,制備5～6 μm厚冷凍切片,使用油紅O染色檢測主動脈根部切片中斑塊面積大小,以Masson染色法檢測斑塊穩(wěn)定性,采用組織免疫熒光方法檢測兩組小鼠動脈斑塊中的巨噬細胞、平滑肌細胞、膠原纖維以及巨噬細胞M1極化情況,采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測兩組小鼠主動脈斑塊中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的水平,檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

1.2.3小鼠腹腔原代巨噬細胞提取和分組 8周齡雄性C57BL/6J小鼠10只,頸椎脫臼法處死后,立即浸于含體積分數(shù)0.75乙醇中2 min。然后在小鼠腹部剪一小口,充分暴露腹膜,使用無菌注射器向腹腔注入約10 mL預冷的無菌PBS,使腹腔內充滿PBS;反復抽打腹腔PBS后,以無菌注射器將腹腔懸液移至另一無菌管中,以800 r/min離心5 min;棄掉PBS,并使用含有體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞;置于37 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),待細胞貼壁生長融合度約75%時,PBS清洗1次,更換新鮮含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng),獲得小鼠腹腔原代巨噬細胞。

將小鼠腹腔原代巨噬細胞分為兩組,每組設置3個復孔,結果取平均值,其中對照組的巨噬細胞以LPS(100 μg/L)+INF-γ(20 μg/L)處理24 h;普羅布考組的巨噬細胞以普羅布考(10 μmol/L)+LPS(100 μg/L)+IFN-γ(20 μg/L)處理24 h。然后采用ELISA方法檢測兩組巨噬細胞中的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平,檢測嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4RT-qPCR方法檢測各組細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、CD86和iNOSmRNA的相對表達水平分別取對照組、普羅布考組小鼠主動脈根部血管和巨噬細胞,后分別加入1 mL TRIzol試劑,根據(jù)試劑盒說明書要求提取總RNA,根據(jù)反轉錄試劑盒說明書的要求進行逆轉錄,條件為42 ℃ 30 min,95 ℃ 2 min。根據(jù) SYBR GREEN 染料試劑盒說明書要求,以cDNA模板為底物進行擴增,反應體系的總體積為 15 μL,其中引物1 μL,cDNA 模板1 μL,SYBR GREEN染料5.5 μL和去離子水7.5 μL。以β-actin為內參照,根據(jù)2-△△CT法計算目的基因的相對表達水平。引物由上海博尚生物技術有限公司提供,引物名稱及其序列見表1。

表1 引物名稱及其序列

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 普羅布考對ApoE-/-小鼠血脂和肝腎功能的影響

與對照組小鼠相比較,普羅布考組小鼠血清中的TG、TC及LDL-C水平均明顯下降(t=2.445～4.024,P<0.05),其他指標比較差異均無顯著意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組小鼠血清血脂和肝腎功能指標比較

2.2 普羅布考對ApoE-/-小鼠AS斑塊面積和穩(wěn)定性的影響

主動脈血管油紅O染色顯示,對照組和普羅布考組小鼠的斑塊面積與血管壁總面積比值分別為(27.40±0.02)%和(17.40±0.02)%,兩組比較差異有顯著性(t=3.599,P<0.05)。主動脈根部切片油紅O染色顯示,對照組和普羅布考組小鼠斑塊面積分別為(35.40±4.18)、(21.80±1.93)mm2,兩組比較差異具有顯著性(t=2.954,P<0.05);與對照組相比,普羅布考組小鼠主動脈根部斑塊中脂質明顯減少(圖1A、B)。Masson染色結果顯示,與對照組進行比較,普羅布考組小鼠的主動脈根部斑塊中膠原纖維明顯增多(圖1C、D)。免疫熒光染色顯示,與對照組相比,普羅布考組小鼠的主動脈根部斑塊中巨噬細胞(MAMO-2)明顯減少,斑塊纖維帽處平滑肌細胞(α-SMA)和膠原纖維均明顯增多(圖2),圖中紅色為巨噬細胞,綠色為平滑肌細胞以及膠原纖維。

A、B:主動脈根部切片油紅O染色(紅色表示脂質含量),C、D:主動脈根部切片Masson染色(藍色表示膠原纖維含量),100倍

A、B:對照組,C:對照組融合圖,D、E:普羅布考組,F:普羅布考組融合圖;組織免疫熒光法,200倍

2.3 普羅布考對ApoE-/-小鼠血清和動脈斑塊中炎性因子的影響

與對照組相比,普羅布考組小鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯降低(t=2.388～4.891,P<0.05);主動脈斑塊中IL-1β、IL-6以及TNF-α mRNA的表達水平亦明顯降低,差異具有顯著性(t=3.060～4.507,P<0.05)。見表3。

表3 兩組小鼠動脈斑塊和血清炎性因子水平變化比較

2.4 普羅布考對小鼠巨噬細胞M1極化的影響

與對照組相比較,普羅布考組中MOMA-2+和iNOS+細胞數(shù)量及其比例明顯減少,見圖3。圖中綠色為MOMA-2,紅色為巨噬細胞M1極化標志物iNOS。

A、B:對照組,C:對照組融合圖;D、E:普羅布考組,F:普羅布考組融合圖;組織免疫熒光法,400倍

ELISA檢測結果顯示,與對照組比較,普羅布考組細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯減低(t=4.238～9.580,P<0.05);RT-qPCR檢測結果也顯示,巨噬細胞的M1極化標志物CD86、iNOS和炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的水平亦均明顯降低(t=3.251～36.190,P<0.05)。見表4。

表4 小鼠腹腔原代巨噬細胞M1極化標志物及上清炎性因子水平變化比較

3 討 論

AS是一種涉及多種細胞和多種生物學過程的復雜病變。當各種因素誘導血管發(fā)生AS時,血管內皮細胞受損,白細胞黏附到受損處,進而通過內皮間隙浸潤至血管內膜。內膜中的單核細胞進一步分化為巨噬細胞,可吞噬修飾的低密度脂蛋白及凋亡細胞等,變成泡沫細胞［9］。泡沫細胞是AS的特征性細胞［10］。泡沫細胞后期發(fā)生凋亡壞死,釋放脂質和各種抗原,構成了斑塊的壞死核心,加劇斑塊的炎癥反應。巨噬細胞或泡沫細胞可分泌大量的炎性因子、趨化因子和基質金屬酶,一方面會招募更多的白細胞浸潤,另一方面會導致內皮細胞和平滑肌細胞發(fā)生形態(tài)和功能學改變,如內皮細胞凋亡、平滑肌細胞表型轉換,此外基質金屬酶會直接降解膠原纖維,導致斑塊纖維帽變薄,易于破裂。

巨噬細胞極化與AS發(fā)生關系密切。斑塊中的多種成分比如膽固醇結晶、氧化LDL-C、TNF-α以及微修飾LDL-C均可誘導巨噬細胞M1極化［9-11］。M1型巨噬細胞與斑塊發(fā)生、發(fā)展及不穩(wěn)定有關。M1 型巨噬細胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β一方面增加LDL跨內皮進入內膜中,促進了AS的進展［11］;另一方面導致內皮細胞活化,內皮細胞凋亡增加,內皮一氧化氮合酶表達降低,引起內皮功能紊亂,加速AS的進展［11］。其次,M1 型巨噬細可引起平滑肌細胞凋亡,使動脈中膜變薄,血管重構。最后,M1 型巨噬細胞大量分泌基質金屬蛋白酶,降解膠原纖維,使纖維帽變薄,易于發(fā)生斑塊破裂［12］。

普羅布考具有多重藥理學效應,包括調脂、抗炎、抗氧化及改善血管內皮功能等,在臨床上多用于AS性心血管疾病的防治［13-16］。近年來研究還發(fā)現(xiàn)了普羅布考的多種生物學作用,如普羅布考可逆轉同型半胱氨酸誘導的單核細胞分化和氧化應激［4］,抑制鏈脲霉素誘導的糖尿病小鼠CD11c+樹突狀細胞的免疫成熟［7］,抑制脂多糖誘導的白細胞黏附［6］,抑制血管彈性纖維降解等［5］。但是,普羅布考能否調控巨噬細胞極化尚不清楚。

本研究探討了普羅布考對高脂飲食誘導的小鼠AS的影響及對斑塊中巨噬細胞極化的影響。通過以上實驗結果顯示該濃度的普羅布考干預未對小鼠的肝腎功造成損害,經普羅布考治療能降低小鼠血脂水平,減小AS斑塊面積,使得斑塊更加穩(wěn)定,降低全身和斑塊中炎性因子水平;更重要的是,普羅布考抑制了斑塊中巨噬細胞M1極化,表現(xiàn)為多種M1極化標志物例如CD86、iNOS、IL-1β的mRNA水平均明顯降低。本研究在體外實驗中,進一步驗證了普羅布考對巨噬細胞M1極化的調控作用。由此,我們揭示了普羅布考通過調控巨噬細胞極化和炎癥反應從而抑制AS的新機制。

本課題尚有一些局限性。首先,本研究雖然發(fā)現(xiàn)了普羅布考可抑制巨噬細胞M1極化,但沒有闡明普羅布考調控M1極化的分子機制。其次,普羅布考能否調控巨噬細胞M2極化尚不清楚。再者,普羅布考調控的巨噬細胞M1極化在多大程度上影響AS仍需研究。最后,在臨床上服用普羅布考能否減輕AS患者斑塊中巨噬細胞M1極化亦需要進一步研究。

綜上所述,本研究探討了普羅布考對ApoE-/-小鼠AS的影響,結果顯示普羅布考可延緩小鼠AS進展并促進斑塊穩(wěn)定,其機制可能與抑制巨噬細胞M1極化、減輕斑塊炎癥反應有關。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有實驗均已通過青島大學附屬醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會的審核批準(文件號AHQU-MAL20190510)。所有實驗過程均遵照《實驗動物福利倫理原則》的條例進行。

作者聲明：李棟、安毅參與了研究設計和論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。