溫度調(diào)控對大口黑鱸性腺發(fā)育的影響

楊 剛，李勝杰，連總強，劉 哲，王旭軍，白富瑾，楊立強，，楊瑞蘭，，柳 婷，，吳旭東，

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所，銀川 750001；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510385；4.寧夏新明潤源農(nóng)業(yè)科技有限公司，銀川 750001；5.寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，銀川 750001)

性腺發(fā)育作為魚類繁殖的前提，其受溫度、光照、營養(yǎng)、密度、pH等因素的影響，溫度和光照在魚類性腺發(fā)育中起主導(dǎo)作用，溫度調(diào)控對魚類性腺發(fā)育的影響因魚的種類而異[1]。已有研究表明，溫度對性腺分化、發(fā)育和產(chǎn)卵均有影響，在性腺分化時高溫或低溫會改變魚類雌雄比例，在性腺發(fā)育時適宜的升溫或降溫會促進或抑制性腺發(fā)育和成熟，進而影響產(chǎn)卵[2]。如廈門文昌魚(Branchiostomabelcheri)水溫從16 ℃提高至28 ℃性腺發(fā)育速度顯著加快[3]，(Miichthysmiiuy)提高水溫可使卵巢快速發(fā)育并提前產(chǎn)卵[4]；但對產(chǎn)卵后的四川華鳊(Sinibramataeniatus)雌魚進行11 ℃低溫養(yǎng)殖，發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞發(fā)育不良，大量卵泡出現(xiàn)閉鎖現(xiàn)象[5]；庫達海馬(Hippocampuskuda)幼魚在18 ℃和20 ℃條件下飼養(yǎng)時，卵巢發(fā)育停滯于Ⅱ期或Ⅲ期狀態(tài)[6]。因此溫度調(diào)控對魚類性腺發(fā)育和成熟以及實現(xiàn)全年繁育具有重要意義。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)俗稱加州鱸，原產(chǎn)于美國加利福尼亞州，具有肉質(zhì)鮮美、無肌間刺、生長迅速、適溫范圍較廣等優(yōu)點[7-9]，自20世紀(jì)80年代引入廣東地區(qū)并成功繁殖后，現(xiàn)已成為我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一[10]。近年來寧夏等北方地區(qū)大口黑鱸養(yǎng)殖發(fā)展快速，養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大，但苗種主要從華南和華中地區(qū)引進，存在一苗難求、質(zhì)量不一致、病害多發(fā)、成活率不高等問題[11]。有關(guān)報道顯示，大口黑鱸在自然條件下一年僅繁殖一次[12]，廣東、江浙等沿海地區(qū)大口黑鱸在3-5月產(chǎn)卵[13，14]，安徽、新疆等地區(qū)4月下旬至5月上旬水溫在18～25 ℃時產(chǎn)卵[15，16]，寧夏地區(qū)4月下旬至5月中旬水溫達到18～23 ℃時產(chǎn)卵。由于北方地區(qū)大口黑鱸魚苗下塘?xí)r間晚，養(yǎng)殖有效期短，存在當(dāng)年不能養(yǎng)成上市、越冬死亡率高的問題[17，18]，若能在寧夏地區(qū)開展大口黑鱸反季節(jié)苗種繁育，使苗種在室內(nèi)培育至翌年早春3-4月達到(50～150)g/尾下塘，可在7-9月份上市并高價銷售[19]，既實現(xiàn)結(jié)構(gòu)調(diào)整所需苗種本地化生產(chǎn)又歷史性地實現(xiàn)“北苗南運”，促使大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)效益最大化。已有研究報道，華中地區(qū)通過控溫實現(xiàn)了大口黑鱸9-10月份二次產(chǎn)卵[20]，培育大規(guī)格越冬苗種，大大提前了上市時間并填補了7-9月市場缺魚期。本實驗通過開展寧夏地區(qū)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”自然和人工控溫條件下性腺發(fā)育及性激素水平變化規(guī)律及人工控制反季節(jié)苗種繁育技術(shù)研究，以期為破解西北地區(qū)大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展面臨的苗種適時規(guī)模供給瓶頸提供重要的技術(shù)支撐，為大口黑鱸性腺發(fā)育及周年繁育研究提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗魚及實驗條件

實驗魚為寧夏地區(qū)引進培育的大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”親本，人工馴養(yǎng)1年以上，年齡≥1齡，體質(zhì)健壯，無病無傷，體質(zhì)量(550±50)g，體長(25.4±1.7)cm。實驗魚先在室外池塘培育，后轉(zhuǎn)入室內(nèi)水泥池培育。室外池塘養(yǎng)殖面積為7 000 m2、水深2 m，放養(yǎng)密度約800尾/667 m2，培育用水為黃河水，pH 7.8～8.2、氨氮0.05～0.20 mg/L、亞硝酸鹽0.01～0.15 mg/L、溶氧5.5～8.0 mg/L；室內(nèi)水泥池體積為100 m3，放養(yǎng)密度為25尾/m3，培育用水為地下水(水溫12～13 ℃)，pH 8.0～8.2、溶氧5.5～7.0 mg/L、氨氮0.01～0.20 mg/L、亞硝酸鹽0.01～0.20 mg/L。

1.2 實驗設(shè)計

2022年4月1日-5月7日在室外池塘養(yǎng)殖1齡大口黑鱸，分為控溫組和對照組，控溫組采用室外池塘上方加蓋遮陽保溫材料控制水溫，對照組為不做任何處理的露天池塘。5月8日將室外池塘控溫組和對照組實驗魚分別轉(zhuǎn)入設(shè)施溫棚車間水泥池內(nèi)繼續(xù)控溫[(14±1)℃]培育至大口黑鱸性腺發(fā)育至Ⅴ期后升溫至20 ℃進行反季節(jié)繁殖實驗，各組隨機挑選80尾(雌雄比為1∶1)分別置于直徑為8 m的圓形養(yǎng)殖池產(chǎn)卵，將每天收集的受精卵置于面積為12 m2的孵化池中孵化，孵化水溫為23 ℃。實驗期間每天9：00投喂一次大口黑鱸親魚專用配合飼料，投餌率為0.2%～0.5%。外塘水溫每天取6：00、12：00、18：00、24：00水深1 m處水溫的平均值為當(dāng)天水溫(對照組11.1 ℃～17.7 ℃，控溫組5.4 ℃～11.4 ℃)。

1.3 樣品采集

室外培育期間第8、16、24、30天各采集一次性腺、血清樣品，室內(nèi)培育期間第1天和第30天各采集一次性腺樣品，樣本數(shù)量均為雌雄各5尾。將隨機捕獲的實驗魚用2-苯氧乙醇麻醉，測量體質(zhì)量，尾靜脈采血1.5 mL，解剖魚體采集性腺組織并測量質(zhì)量，同時取約1 cm3小塊性腺組織置于Bouin′s液固定48 h后用于制作組織切片。血液在4 ℃自然凝固4～6 h后3 500 r/min離心10 min，取上清保存于-20 ℃用于性激素測定。繁殖期統(tǒng)計一周內(nèi)產(chǎn)卵量、受精率和孵化率等指標(biāo)。

1.4 血清中性激素測定

用酶聯(lián)免疫吸附測定(Elisa)試劑盒(江蘇雨桐生物科技有限公司)雙抗體夾心法測定血清中雌二醇(E2)和睪酮(T)水平。試劑盒內(nèi)含帶有對應(yīng)激素抗體包被的微孔板，血清激素與微孔板中的抗體結(jié)合后，經(jīng)徹底洗滌后加底物TMB并利用HRP酶催化顯色，使用酶標(biāo)儀測定450 nm的波長下吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中激素水平。具體方法參見試劑盒內(nèi)說明書。

1.5 性腺組織學(xué)觀察

固定好的性腺樣品經(jīng)酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，YD-202輪轉(zhuǎn)式切片機連續(xù)切片(5～8 μm)形成蠟帶，蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，Motic A131顯微鏡拍照觀察。性腺分期標(biāo)準(zhǔn)參照崔慶奎等[20]的方法。

1.6 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果用“Mean±SD”表示，用SPSS 25.0(IBM SPSS Statistics，Version 25)統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行顯著性檢驗，然后用Duncan’s多重比較來確定組間差異的顯著性，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。用Excel軟件制作圖表。相關(guān)計算公式如下：

性腺指數(shù)(GSI)=WG/WB×100%

受精率(FR)=受精卵數(shù)/總卵數(shù)×100%

孵化率(HR)=出膜苗數(shù)/受精卵總數(shù)×100%

式中，WG和WB分別為實驗魚性腺質(zhì)量和體質(zhì)量，單位g。

2 結(jié)果與分析

2.1 室外培育大口黑鱸性腺指數(shù)(GSI)變化

室外池塘培育期間雄性大口黑鱸GSI呈現(xiàn)上升趨勢(圖1)，其中對照組GSI變化范圍為0.47%～0.77%，控溫組GSI在第24天之前呈緩慢上升趨勢，僅上升了0.10個百分點，后顯著上升至0.57%。雌性大口黑鱸GSI變化趨勢和雄性相同(圖2)，對照組GSI變化范圍為8.17%～11.95%，控溫組GSI變化范圍為4.48%～8.45%。對照組雄性大口黑鱸GSI在室外池塘培育期間前24 d內(nèi)顯著高于控溫組，對照組雌性大口黑鱸GSI在室外池塘培育期間顯著高于控溫組。

2.2 室外培育大口黑鱸性腺組織學(xué)觀察

大口黑鱸精巢發(fā)育組織學(xué)觀察如圖3所示。室外池塘培育至第8天，對照組大口黑鱸精巢發(fā)育至Ⅲ期，切片中顯示精小葉有腔隙，小葉邊排列著初級精母細(xì)胞，腔內(nèi)有精母細(xì)胞和精子(圖3A)；同期控溫組大口黑鱸精巢處于Ⅱ期，大口黑鱸精巢處于精原細(xì)胞增殖后期，精原細(xì)胞較多，精小葉內(nèi)精原細(xì)胞成群分布，小葉內(nèi)僅存有少量精子(圖3E)。培育至第24天，對照組大口黑鱸精巢處于Ⅲ期，精巢內(nèi)精原細(xì)胞繼續(xù)增殖生長，主要以初級精母細(xì)胞為主(圖3B，3C)，培育至第30天時，精巢處于Ⅳ期末，小葉腔擴大，腔內(nèi)充滿大量精子，染色較深(圖3D)；而控溫組大口黑鱸精巢發(fā)育較為緩慢，培育至第30天僅發(fā)育至Ⅲ期(圖3F-3H)。

圖3 大口黑鱸精巢組織切片觀察Fig.3 Observation of testis tissue section of M.salmoides

大口黑鱸卵巢發(fā)育組織學(xué)如圖4所示。室外池塘培育至第8天，對照組大口黑鱸卵巢發(fā)育至Ⅲ期，切片顯示卵巢內(nèi)出現(xiàn)液泡，沉積的卵黃開始出現(xiàn)油球，有2層濾泡膜，主要以Ⅲ時相卵母細(xì)胞為主(圖4E)，而控溫組大口黑鱸卵巢內(nèi)卵黃正處于沉積階段，細(xì)胞核明顯(圖4A)，此時卵粒不能剝離。培育至第24天，對照組大口黑鱸卵巢體積進一步增大，此時細(xì)胞核開始極化，油球增多，卵巢內(nèi)主要為Ⅳ時相卵母細(xì)胞(圖4G)，培育至第30天時，此時卵巢處于Ⅴ期，卵黃顆粒處于游離狀態(tài)(圖4H)?？販亟M大口黑鱸卵巢發(fā)育較為緩慢，培育至第24天時，卵母細(xì)胞體積慢慢增大，卵黃繼續(xù)沉積，逐漸出現(xiàn)油球(圖4C)，培育至第30天時為Ⅳ期卵巢，卵母細(xì)胞進一步增大，細(xì)胞核極化，油球數(shù)量增加、變大(圖4D)。

圖4 大口黑鱸卵巢組織切片觀察Fig.4 Observation of ovarian tissue section of M.salmoides

2.3 室外培育大口黑鱸血清性激素表達

室外池塘培育期間大口黑鱸血清T水平呈上升趨勢(圖5)，對照組大口黑鱸血清T水平在1.45～3.13 nmol/L之間；控溫組大口黑鱸血清T水平低于對照組，最低為1.05 nmol/L，在室外池塘培育至第15天，血清T水平上升極其緩慢，后顯著上升至最高2.54 nmol/L。對照組大口黑鱸血清E2水平呈先緩慢上升后快速上升趨勢，其水平為120.28～223.07 ng/L(圖6)；而控溫組大口黑鱸血清E2水平在室外池塘培育期間呈緩慢上升趨勢，水平在76.04～118.95 ng/L之間。在室外池塘培育期間對照組大口黑鱸血清T水平高于控溫組，E2水平也高于控溫組且第30天存在顯著性差異。

圖5 雄性大口黑鱸血清中睪酮(T)含量變化Fig.5 Changes of serum testosterone(T)content in male M.salmoides

圖6 雌性大口黑鱸血清中雌二醇(E2)含量變化Fig.6 Changes of estradiol(E2)content in serum of female M.salmoides

2.4 大口黑鱸室內(nèi)低溫培育及反季節(jié)繁殖

室內(nèi)低溫培育期間大口黑鱸性腺指數(shù)(GSI)變化如表1所示。對照組雄性大口黑鱸GSI從0.85%增加至0.90%，控溫組雄性大口黑鱸GSI從0.60%增加至0.80%，對照組和控溫組之間不存在顯著性差異；對照組雌性大口黑鱸GSI從12.22%增加至13.42%，控溫組雌性大口黑鱸GSI從9.03%增加至10.23%，對照組雌性大口黑鱸GSI顯著高于控溫組。組織學(xué)表明，室內(nèi)培育初對照組大口黑鱸精巢內(nèi)存在大量精子(圖7C)，培育至第30天時，精巢仍處于Ⅴ期，精巢內(nèi)精子染色較深(圖7D)；而室內(nèi)培育初控溫組大口黑鱸精小葉內(nèi)存在不同時期精母細(xì)胞和精子(圖7A)，培育至第30天時仍處于Ⅳ期(圖7B)。卵巢內(nèi)細(xì)胞變化較小，室內(nèi)培育初對照組大口黑鱸卵巢處于Ⅳ期末至Ⅴ期初(圖7E)，控溫組大口黑鱸卵巢處于Ⅳ期初，周圍還存在Ⅲ時相卵母細(xì)胞正在發(fā)育(圖7G)，培育至第30天時，對照組大口黑鱸卵巢內(nèi)主要以Ⅴ時相卵母細(xì)胞為主(圖7F)，控溫組大口黑鱸卵巢處于Ⅳ期末，其周圍也存有少量Ⅲ時相卵母細(xì)胞(圖7H)。

圖7 控溫期大口黑鱸性腺組織切片觀察Fig.7 Observation of gonad tissue section of the first instar M.salmoides during the temperature control period

對照組大口黑鱸室內(nèi)低溫培育30 d后升溫至20 ℃開始產(chǎn)卵，控溫組大口黑鱸室內(nèi)低溫培育60 d后升溫至20 ℃開始產(chǎn)卵，結(jié)果如表2所示。控溫組大口黑鱸總產(chǎn)卵量、受精率高于對照組，孵化率則相反，但二者均不存在顯著性差異。

表2 大口黑鱸反季節(jié)繁殖Tab.2 M.salmoides breed off-season

3 討論

3.1 溫度對大口黑鱸性腺發(fā)育及性激素表達的影響

已有研究報道，溫度、激素、營養(yǎng)、pH等是影響魚類性腺發(fā)育的關(guān)鍵因素，其中溫度是通過啟動下丘腦-垂體-性腺軸的生理功能來發(fā)揮作用并調(diào)控性腺發(fā)育、影響精卵細(xì)胞的增殖生長和成熟過程[21，22]。在本研究中，室外池塘培育期間對照組(平均水溫14.2 ℃)和控溫組(平均水溫8.5 ℃)大口黑鱸GSI均呈上升趨勢，組織學(xué)顯示對照組大口黑鱸卵巢從Ⅲ期末培育至第30天時已達Ⅴ期，而控溫組大口黑鱸卵巢從Ⅲ期中培育至第30天時卵巢發(fā)育至Ⅳ期，這是由于降低溫度導(dǎo)致控溫組大口黑鱸性腺發(fā)育較慢。其中室外池塘培育期間對照組雌性大口黑鱸GSI從17.7 ℃開始顯著上升，MARTYNIUK等[23]表明水溫達到16.1 ℃時野生大口黑鱸性腺開始發(fā)育，GSI顯著上升；BROWN等[24]研究發(fā)現(xiàn)在美國中西部地區(qū)，水溫達到13.9 ℃時大口黑鱸性腺開始發(fā)育，15 ℃以上GSI顯著上升；崔慶奎等[20]在華中地區(qū)池塘養(yǎng)殖大口黑鱸的研究中發(fā)現(xiàn)，從11.0 ℃開始卵巢中逐漸以Ⅲ時相卵子為主，性腺開始發(fā)育，至15 ℃時GSI顯著上升，以上研究均表明大口黑鱸性腺發(fā)育的臨界溫度為15 ℃。本研究推測寧夏地區(qū)適宜控制大口黑鱸性腺發(fā)育的水溫在15 ℃以下，進一步進行大口黑鱸室內(nèi)低溫[(14±1)℃]培育研究，發(fā)現(xiàn)對照組和控溫組雌性大口黑鱸GSI均僅增加了1.20%，其組織學(xué)變化特征不明顯，證實了控制水溫在該溫度范圍內(nèi)能夠有效延緩大口黑鱸性腺發(fā)育。

在硬骨魚類研究中表明，性類固醇激素(T和E2)在性腺發(fā)育成熟過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，其表達變化與GSI密切相關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在大口黑鱸性腺發(fā)育過程中，T和E2表達水平與GSI變化均呈現(xiàn)上升趨勢，且產(chǎn)卵前對照組大口黑鱸血清性激素與性腺發(fā)育顯著增加，與BROWN等[24]的研究結(jié)果相一致。BROWN等[24]發(fā)現(xiàn)大口黑鱸卵巢Ⅲ期卵母細(xì)胞向Ⅳ期卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)換時水溫與E2同步上升，在本研究中，對照組和控溫組大口黑鱸Ⅳ期卵母細(xì)胞出現(xiàn)分別在實驗第16天和第30天，同時間水溫與E2也在上升，但E2上升趨勢不顯著，表明魚類配子的發(fā)生受性類固醇激素產(chǎn)生的時間變化影響[12]。

在硬骨魚類的生殖周期中，溫度也會對魚產(chǎn)卵行為產(chǎn)生影響，其每種魚都有自己的產(chǎn)卵溫度閾值，在適溫范圍內(nèi)溫度越高，產(chǎn)卵率、受精率越高。而在本研究中，對照組大口黑鱸產(chǎn)卵量、受精率均低于控溫組，這可能是由于前期的低溫刺激或產(chǎn)卵時的升溫造成的影響。

3.2 大口黑鱸反季節(jié)繁殖

不同魚類因為產(chǎn)卵類型及環(huán)境不同，繁殖周期和繁殖時間會有所差異，而通過溫度調(diào)控可調(diào)整其繁殖時間及周期。如稀有鯽(Gobiocyprisrarus)在自然條件下的繁殖季節(jié)為3-11月，而人工控制條件下可周年繁殖[26]；香魚(Plecoglossusaltivelis)人工繁殖時間在10-11月，通過人工調(diào)控溫度實現(xiàn)常年提供苗種、周年養(yǎng)殖[27]。通過溫度調(diào)控也可使大口黑鱸繁殖時間與周期發(fā)生變化，HUSSEIN等[28]發(fā)現(xiàn)，華中地區(qū)大口黑鱸自然產(chǎn)卵為5月份，將自然產(chǎn)卵后的大口黑鱸轉(zhuǎn)入水泥池用水庫深層水(9～12 ℃)培育，使大口黑鱸Ⅱ期卵巢延緩了90天，升溫至20 ℃后在秋季的9、10月二次產(chǎn)卵；MATTHEWS等[29]報道，大口黑鱸在佛羅里達州產(chǎn)卵時間為春季，利用控溫設(shè)備調(diào)控水溫，先降溫，再維持低溫(10～12 ℃)，最后升溫至產(chǎn)卵溫度，在9、10月份獲得反季節(jié)苗種；崔慶奎等[20]利用地下水將大口黑鱸池塘水溫降至[(20±1)℃]，維持該水溫至產(chǎn)卵，在9、10月二次產(chǎn)卵。綜合上述研究發(fā)現(xiàn)，要獲得反季節(jié)苗種均需降低水溫來控制性腺發(fā)育，而本研究通過夏季在室內(nèi)使用循環(huán)地下水(12～13 ℃)控溫培育30～60 d升溫至20 ℃產(chǎn)卵，在6、7月獲得了反季節(jié)苗種。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明適宜的溫度[(14±1)℃]控制，可有效調(diào)控大口黑鱸性腺發(fā)育，實現(xiàn)夏秋高溫季節(jié)規(guī)模化繁育水花苗種，解決北方地區(qū)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整所需苗種本地化和南方夏季水花苗種短缺難題。